王立 顏世傳 牛蘭俊 朱曼輝 孫曉東 徐迅 宋鄂

作者單位：1蘇州大學(xué)附屬理想眼科醫(yī)院，蘇州 215021；2上海市第一人民醫(yī)院，上海 200080

糖尿病視網(wǎng)膜病變（Diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，DR發(fā)病率、致盲率隨著糖尿病病程的延長而增加[1]。研究表明，氧化應(yīng)激、糖基化代謝產(chǎn)物堆積、視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞退行性病變、血管生長因子及炎癥因子釋放增多等機(jī)制共同參與DR的發(fā)病[2-3]。近年來，探討DR的發(fā)病機(jī)制，并抑制其發(fā)生發(fā)展已成為DR研究的前沿與焦點(diǎn)。在哺乳動(dòng)物中，視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞分為小膠質(zhì)細(xì)胞和大膠質(zhì)細(xì)胞，Müller細(xì)胞是一種特化的大型星型膠質(zhì)細(xì)胞，Müller細(xì)胞貫穿于視網(wǎng)膜全層，是視網(wǎng)膜細(xì)胞的主要組成部分[4]。它能維持視網(wǎng)膜的正常代謝，調(diào)節(jié)神經(jīng)成分和血管成分之間的相互作用，在病理狀態(tài)下，其異?；罨cDR[5]、視網(wǎng)膜變性、缺血性疾病有著密切關(guān)系。

自噬是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的降解途徑之一，自噬參與維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[6-7]，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)蛋白和部分細(xì)胞器的降解，對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要的生理意義，在病理情況下可誘導(dǎo)自噬，尤其是缺氧應(yīng)激反應(yīng)[8]，然而缺氧應(yīng)激反應(yīng)恰恰是DR的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制，既往研究也表明高糖環(huán)境下培養(yǎng)Müller細(xì)胞，其自噬功能出現(xiàn)紊亂[9]，錯(cuò)誤折疊蛋白逐漸增多，同時(shí)檢測發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）含量明顯增高，Müller細(xì)胞過度膠質(zhì)增生。自噬與凋亡是細(xì)胞代謝的2 種不同方式，二者相互制約，處于動(dòng)態(tài)平衡，共同維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。如果細(xì)胞自噬通路出現(xiàn)障礙，細(xì)胞反應(yīng)效率和功能受損，生命活動(dòng)失衡后啟動(dòng)凋亡通路[10]。因此，DR的發(fā)病機(jī)制和細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、自噬和凋亡水平失衡密切相關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究，這極有可能是導(dǎo)致DR發(fā)生發(fā)展的重要因素。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為出生后5～7 d的SD大鼠，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，雌雄不限，本實(shí)驗(yàn)遵循視力與眼科研究協(xié)會（ARVO）關(guān)于在眼科和視力研究中使用動(dòng)物的聲明。

1.1.2 試劑 自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA，美國Sigma公司）；胎牛血清（FBS，美國Gibico公司）；DMEM/F-12 培養(yǎng)基（美國Gibico公司）；胰蛋白酶（美國Gibico公司）；青鏈霉素雙抗溶液（美國Gibico公司）；beclin-1單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；LC3單克隆抗體（美國Abcam公司）；LC3慢病毒（上海漢恒公司）；P62 單克隆抗體（美國Abcam公司）；GAPDH單克隆抗體（美國santa Cruz公司）等。

1.2 方法

1.2.1 原代Müller細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將出生5～7d的SD大鼠浸泡于75%的乙醇中處死，并在無菌狀態(tài)下取出眼球，置超凈工作臺無菌操作，在顯微鏡下沿角膜緣剪開，去除角膜、晶狀體及玻璃體，分離出視網(wǎng)膜組織，然后收集于培養(yǎng)皿中。先加入0.25%胰蛋白酶37 ℃消化7 min，然后加入含15%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基終止消化。用移液槍輕輕吹打，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞吹打的程度，見視網(wǎng)膜組織已消化成10～20個(gè)細(xì)胞的組織團(tuán)塊，70%的細(xì)胞從中游離時(shí)停止吹打。接種于培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。定時(shí)觀察細(xì)胞的生長情況，2～3 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)板的80%以上時(shí)進(jìn)行消化傳代：吸出培養(yǎng)液，PBS充分沖洗3次，每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入0.25%胰蛋白酶1 ml，37 ℃溫箱中消化20～30 s，顯微鏡下觀察細(xì)胞觸角稍皺縮后，去除胰酶，加入完全培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)輕輕吹打?qū)⒓?xì)胞完全脫壁，移入離心管，1 000 r/min離心5 min，去除上清液，加入含15%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按1∶2傳代，由于通過傳代培養(yǎng)，第三代Müller細(xì)胞具有較高的純化率，通過谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）鑒定（見圖1E）并被用于實(shí)驗(yàn)研究，移入放有細(xì)胞爬片的6孔培養(yǎng)板，置于5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前將純化的Müller細(xì)胞用無血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基饑餓24 h進(jìn)行同步化處理。純化后的Müller細(xì)胞隨機(jī)分為5.5 mmol/L葡萄糖組[正常組（Normal glucose，NG）]以及20、30、40、50 mmol/L高糖組；使用40 mmol/L高糖培養(yǎng)時(shí)隨機(jī)分為不同時(shí)間組：3、6、12、24、36 h高糖組；3-MA組（3-甲基腺嘌呤，自噬特異性抑制劑，5 mmol/L）作為陰性對照組以觀察高糖對視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞自噬的抑制作用水平。

1.2.2 Western Blot蛋白質(zhì)印跡法 收集各組Müller細(xì)胞加入含蛋白酶抑制劑cocktail，不含乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）的RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度，等量蛋白上樣，10%SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（PVDF），5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，LC3兔單克?。?∶1 000）、beclin-1鼠單克?。?∶500）、P62鼠單克?。?∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）抗體孵育，4 ℃過夜，第2天取出室溫復(fù)溫1 h，PVDF膜于搖床上洗滌3次，每次5 min，加入二抗，室溫?fù)u床孵育2 h。紅外成像系統(tǒng)（美國LI-COR odyssey）顯影后應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行積分吸光度（A）分析。

1.2.3 免疫熒光 取對數(shù)期Müller細(xì)胞按5×105個(gè)/孔的細(xì)胞量接種于6 孔板中，按不同實(shí)驗(yàn)分組處理24 h后，利用4%多聚甲醛固定Müller細(xì)胞20 min，再用1% Triton X-100通透細(xì)胞后以5%血清封閉，加入1∶200稀釋的LC3、P62抗體于4 ℃孵育過夜。以PBS洗3次，加入1∶1 000稀釋的熒光二抗于室溫避光孵育2 h，Hoechst染核15 min。以PBS洗3 次，封片后熒光顯微鏡觀察拍照。隨機(jī)選擇10個(gè)視野計(jì)數(shù)自噬細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 TUNEL實(shí)驗(yàn) 對于正常組、6 h高糖組、24 h高糖組及3MA組的12孔板細(xì)胞，PBS洗滌1次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min。加入含0.3% Triton X-100的PBS，室溫孵育5 min。在樣品上加50 μl TUNEL檢測液，37 °C避光孵育60 min，PBS或HBSS洗滌3次。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 透射電子顯微鏡觀察 將Müller細(xì)胞接種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，至細(xì)胞密度達(dá)到90%，換新鮮培養(yǎng)基。后用不含EDTA胰酶消化細(xì)胞，4 ℃、1 000 r/min離心5 min后收集細(xì)胞，冷PBS洗滌2遍，加入3%（體積分?jǐn)?shù)）戊二醛溶液，4 ℃固定過夜，送樣檢驗(yàn)。

1.2.6 GFP-LC3慢病毒轉(zhuǎn)染 取原代Müller細(xì)胞培養(yǎng)第3代純化的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞，制備24孔板細(xì)胞爬片，每孔板細(xì)胞數(shù)約1.25×105/孔，在倒置顯微鏡下確定每個(gè)孔的細(xì)胞爬片上的細(xì)胞均生長良好；丟棄原培養(yǎng)液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液約1.2 ml，并分別加入病毒液，設(shè)置無病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞孔作為陰性對照組。每孔加入新鮮的不同處理?xiàng)l件培養(yǎng)基：正常組、6 h高糖組、24 h高糖組。觀察Müller細(xì)胞生長狀況及GFP-LC3熒光蛋白表達(dá)情況。

1.3 指標(biāo)選擇及觀察

微管相關(guān)蛋白輕鏈3（Microtubule-associatedproteinlight-chain-3，LC-3）是目前檢測自噬的標(biāo)志蛋白，定位于自噬體分隔膜上，在自噬體形成各階段的內(nèi)外膜及自噬溶酶體膜上也可見到。本實(shí)驗(yàn)通過使用外源性綠色熒光蛋白來示蹤自噬形成，細(xì)胞發(fā)生自噬后，LC3表達(dá)增加并轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，斑點(diǎn)的個(gè)數(shù)被用來評價(jià)自噬活性的高低。用Western Blot法檢測細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白的相對含量（LC3Ⅰ/LC3Ⅱ）、Beclin-1（自噬相關(guān)蛋白，BECN1）及P62（自噬代謝底物標(biāo)志蛋白，SQSTM1/p62），評價(jià)自噬水平。同時(shí)透射電子顯微鏡的超微結(jié)構(gòu)觀察也一直被認(rèn)為是檢測自噬的金標(biāo)準(zhǔn)，在透射電子顯微鏡下，可以觀察到自噬小體（雙層膜結(jié)構(gòu)、膜內(nèi)包裹有胞漿成分）及自噬溶酶體（單層膜結(jié)構(gòu)）的形態(tài)及數(shù)量變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)研究。數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 7（GraphPad Prism Software，美國CA）。各檢測指標(biāo)的數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)證實(shí)呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng)過Levene檢驗(yàn)證實(shí)方差齊。各組間視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白（Beclin-1、P62蛋白、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ）相對表達(dá)量差異比較，高糖不同刺激時(shí)間對Müller細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白、自噬小體及凋亡細(xì)胞率的差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Müller細(xì)胞質(zhì)內(nèi)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化

使用Western Blot法分別檢測正常組及20、30、40、50 mmol/L高糖組培養(yǎng)下視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞質(zhì)內(nèi)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。檢測結(jié)果顯示正常組及20、30、40、50 mmol/L高糖組中Müller細(xì)胞質(zhì)的Beclin-1、P62及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白相對表達(dá)量總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=131.21，P=0.029；F=197.25，P=0.012；F=100.02，P=0.045）。與正常組比較，各濃度高糖組Müller細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Beclin-1、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白均明顯降低（P＜0.05），P62 蛋白相對表達(dá)量明顯增加（P＜0.001）。40 mmol/L與50 mmol/L高糖組Müller細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Beclin-1、P62、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白相對表達(dá)量相似，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.092、0.158、0.429）。由此可見，視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞在一定濃度范圍內(nèi)高糖培養(yǎng)（高糖濃度≤50 mmol/L）時(shí)，高糖對自噬的抑制作用具有濃度依賴性。見圖1。

2.2 不同高糖刺激時(shí)間對視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的自噬影響

使用Western Blot法分別檢測正常組及6、12、24、36 h高糖組LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、P62、Beclin-1蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示正常組有明顯自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ及Beclin-1 蛋白表達(dá)，底物標(biāo)志蛋白P62 表達(dá)較少。正常組及6、12、24、36 h高糖組中Müller細(xì)胞質(zhì)的自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、P62及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白相對表達(dá)量總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=98.46，P=0.015；F=109.48，P=0.004；F=99.27，P=0.032），其中與正常組比較，3 h高糖組LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1、P62蛋白變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），6 h高糖組LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1 蛋白明顯增加（P=0.002、0.015），但P62 蛋白變化較小，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.214），12、24、36 h高糖組與正常組相比較LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin-1 蛋白明顯下降（P＜0.05），但P62 蛋白明顯增加（P＜0.001），24 h、36 h高糖組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.176）。見圖2。

2.3 不同時(shí)間高糖培養(yǎng)對視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞LC3-Ⅱ和P62的表達(dá)及細(xì)胞定位

圖1.各組Müller細(xì)胞質(zhì)內(nèi)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況A：正常組及20、30、40、50 mmol/L高糖組細(xì)胞質(zhì)中LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、P62、Beclin-1蛋白的表達(dá)。B、C、D：分別為Beclin-1、P62、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白條帶密度比值柱狀圖，不同實(shí)驗(yàn)組Müller細(xì)胞質(zhì)的Beclin-1、P62及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白相對表達(dá)量總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。a，與正常組比較，P＜0.01Figure 1.Expression changes in autophagy-related proteins in the cytoplasm of Müller cells in different groups.A:Western blot was used to detect the expression of LC3Ⅰ/LC3Ⅱ,P62 and Beclin-1 proteins in the cytoplasm of the normal group and high glucose groups at 20,30,40 and 50 mmol/L.B,C,D:Densitometric analysis of Beclin-1,P62 and LC3Ⅰ/LC3Ⅱ levels relative to their respective standards.a,compared to NG,P＜0.01.HG,high glucose group;NG,normal group.

圖2.不同高糖刺激時(shí)間對視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的自噬影響A：使用Western Blot法分別檢測正常組及6、12、24、36 h高糖組細(xì)胞質(zhì)中Beclin-1、P62、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)。B，C，D：分別為Beclin-1、P62、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白條帶密度比值柱狀圖，不同實(shí)驗(yàn)組Müller細(xì)胞質(zhì)的自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、P62及LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白相對表達(dá)量總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。a，與正常組比較，P＜0.01，b，與6 h高糖組比較，P＜0.01Figure 2.Effects of different high glucose stimulation times on the autophagy of retinal Müller cells.A:Western blot was used to detect the expression of Beclin-1,P62 and LC3Ⅰ/LC3Ⅱ proteins in the cytoplasm of the normal group and high glucose groups at 6,12,24 and 36 h.B,C,D:Densitometric analysis of Beclin-1,P62 and LC3Ⅰ/LC3Ⅱ levels relative to their respective standards.a,compared to NG,P＜0.01;b,compared to HG (6 h),P＜0.01.HG,high glucose group;NG,normal group.

我們對高糖刺激6 h（自噬水平明顯增強(qiáng)時(shí)間點(diǎn)）及24 h（自噬水平明顯減弱時(shí)間點(diǎn)）這2個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，使用細(xì)胞免疫熒光觀察40 mmol/L高糖對LC3-Ⅱ和P62 的表達(dá)量影響及細(xì)胞定位情況，結(jié)果顯示LC3-Ⅱ和P62這2個(gè)與自噬密切相關(guān)的蛋白質(zhì)主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，3-MA組作為陰性對照組，對比24 h高糖培養(yǎng)對Müller細(xì)胞LC3-Ⅱ和P62的表達(dá)量的影響。正常組、6 h高糖組及24 h高糖組LC3-Ⅱ和P62在細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)總體比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=240.49，P=0.014；F=198.98，P=0.001）。與正常組比較，6 h高糖組中LC3Ⅱ表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003），P62 蛋白變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.176），24 h高糖組中LC3Ⅱ表達(dá)明顯下降（P=0.013），P62蛋白變化增加（P=0.040），24 h高糖組與3MA組對比，LC3-Ⅱ和P62的表達(dá)量變化差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.091），說明高糖刺激Müller細(xì)胞24 h后具有明顯的自噬抑制作用。見圖3。

2.4 高糖對視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞自噬小體形成的影響

本研究采用透射電鏡及GFP-LC3 慢病毒轉(zhuǎn)染正常組及6、24 h高糖組視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞，觀察細(xì)胞中自噬小體及自噬溶酶體的變化。結(jié)果顯示正常組及6、24 h高糖組視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中GFP-LC3轉(zhuǎn)染陽性顆粒、自噬小體相對數(shù)量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=78.47，P=0.039；F=89.01，P=0.021），其中6 h高糖組與正常組比較，GFP-LC3轉(zhuǎn)染陽性顆粒、自噬小體相對數(shù)量明顯增加（P=0.002、0.029），24 h高糖組與正常組比較，GFP-LC3 轉(zhuǎn)染陽性顆粒、自噬小體相對數(shù)量明顯降低（P=0.019、0.036），然而正常組及6、24 h高糖組視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中自噬溶酶體的相對數(shù)量變化不明顯（F=24.47，P=0.315）。見圖4。

2.5 TUNEL染色觀察高糖對視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞凋亡的影響

對正常組、6 h高糖組、24 h高糖組及3MA組進(jìn)行TUNEL染色分析，并計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常組、6 h高糖組、24 h高糖組及3MA組視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞凋亡指數(shù)分別為3.14±1.01、15.34±3.87、25.82±4.96、24.79±4.01，4 組間Müller細(xì)胞凋亡指數(shù)總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=234.12，P=0.003），其中與正常組比較，6 h及24 h高糖組TUNEL陽性細(xì)胞增多（P=0.022、0.039）；與6 h高糖組比較，24 h高糖組TUNEL陽性細(xì)胞進(jìn)一步增加（P=0.017）；與正常組比較，3MA組細(xì)胞凋亡數(shù)增加（P=0.020）；與3MA組比較，24 h高糖組細(xì)胞凋亡指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.187）。見圖5。

圖3.不同時(shí)間高糖培養(yǎng)對視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞LC3-和P62的表達(dá)及細(xì)胞定位A─D：綠色通道表示LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)；E─H：除了綠色通道的LC3-Ⅱ，藍(lán)色通道代表細(xì)胞核位置；I─L紅色通道表示P62蛋白表達(dá)；M─P中除了紅色通道的P62，藍(lán)色通道代表細(xì)胞核位置；Q和R：正常組及6 h、24 h高糖組LC3-Ⅱ和P62在細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。標(biāo)尺為20 μm。a，與正常組比較，P＜0.01，b，與6 h高糖組比較，P＜0.01Figure 3.A representative photomicrograph of LC3 and P62 immunofluorescence in Müller cells cultured for different time points in HG.A─D:Nuclear staining with LC3 (green).E─H:Hoechst (blue) are shown in addition to the green channel (LC3-Ⅱ).I─L:P62 (red).M─P:Hoechst (blue)are shown in addition to the red channel (P62).Q and R:The overall comparison of LC3-Ⅱ and P62 expression in cytoplasm of the normal group,6 h and 24 h groups showed statistically significant differences.Scale bars:20 μm.a,compared to NG,P＜0.01;b,compared to HG (6 h),P＜0.01.HG,high glucose group;NG,normal group.

圖4.高糖對視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞自噬小體形成的影響A：綠色通道表示GFP-LC3轉(zhuǎn)染陽性顆粒（自噬小體），標(biāo)尺為20 μm；B：透射電鏡顯示自噬小體（黑色小箭頭）及溶酶體（黑色粗箭頭），標(biāo)尺為1 μm；C：正常組及6 h、24 h高糖組視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中GFP-LC3轉(zhuǎn)染陽性顆粒、自噬小體相對數(shù)量組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。a，與正常組比較，P＜0.01；b，與6 h高糖組比較，P＜0.01Figure 4.Effects of high glucose on autophagosome formation in retinal Müller cells.A:A representative image and quantification of GFP-LC3 puncta in transfected Müller cells.Scale bars:20 μm.B:Electron micrograph images of the Müller cells.AP (fine arrow) and electron-dense APL (coarse arrow).Scale bars:1 μm.C:The comparison of the number of GFP-LC3 puncta transfected positive particles,and autophagosomes in transfected Müller cells in cytoplasm of the normal group,6 h and 24 h groups showed statistically significant differences.a,compared to NG,P＜0.01;b,compared to HG (6 h),P＜0.01.AP,autophagosomes;APL,autophagosomes lysosome;HG,high glucose group;NG,normal group.

3 討論

DR是糖尿病微血管和神經(jīng)并發(fā)癥，根據(jù)視網(wǎng)膜微血管病變和缺血程度分為非增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變（Non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR）和增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變（Proliferative diabetic retinopathy，PDR），可伴有糖尿病黃斑水腫（Diabetic macular edema，DME）[11]。自噬與全身多個(gè)系統(tǒng)的疾病都有密切聯(lián)系，且與氧化應(yīng)激關(guān)系密切[12]，然而氧化應(yīng)激是DR的重要發(fā)病機(jī)制，其病理機(jī)制還包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、硝基化應(yīng)激、基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP）升高、晚期糖基化終產(chǎn)物（Advanced glycation endproducts，AGEs）堆積、蛋白激酶C激活和多元醇通路激活等[13-14]，我們推測自噬異?？赡苁菍?dǎo)致高糖環(huán)境下視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞功能改變的一個(gè)重要因素。目前已經(jīng)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[15]及體外實(shí)驗(yàn)（高糖培養(yǎng)的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞[16-20]）中觀察到自噬被激活，有趣的是，也有部分研究顯示高糖條件下，自噬上游信號被激活而下游蛋白活性被抑制[21]，甚至發(fā)現(xiàn)自噬水平未見變化[22]的情況。所以自噬是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，任何條件發(fā)生變化都將導(dǎo)致不同的自噬改變，目前研究較多的氧化應(yīng)激可造成自噬功能受損，而自噬可以通過清除氧化損傷的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和細(xì)胞器等抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[23]，由此可見，在與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的DR發(fā)病過程中，Müller細(xì)胞自噬功能異常可能是其重要啟動(dòng)因素。

圖5.TUNEL 染色分析正常組、6 h高糖組、24 h高糖組、3MA組凋亡細(xì)胞數(shù)量A：綠色熒光為TUNEL陽性細(xì)胞，DAPI染色為細(xì)胞核，標(biāo)尺為20 μm；B：各組視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞凋亡指數(shù)總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。a，與正常組比較，P＜0.01；b，與6 h高糖組比較，P＜0.01Figure 5.TUNEL staining analysis of the number of apoptotic cells in NG,6 h HG,24 h HG and 3MA.A:The positive cells are shown in green,and Hoechst for nuclear staining is shown in blue.Scale bars:20 μm.B:The bars represent the mean±SD of positive cells corrected by the number of total cells.a,compared to NG,P＜0.01;b,compared to HG,P＜0.01.NG,normal group;HG,high glucose group.

自噬是DR的研究熱點(diǎn)，目前已經(jīng)在多種細(xì)胞模型中觀察到自噬水平改變。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，高糖刺激視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞早期，可造成Müller細(xì)胞自噬增加，自噬相關(guān)蛋白（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin-1）增加，自噬小體形成增多，Müller細(xì)胞中自噬反應(yīng)被激活，增強(qiáng)Müller細(xì)胞對代謝底物或者受損細(xì)胞器的消化處理能力，底物標(biāo)志蛋白P62在高糖處理早期未見明顯異常，隨著高糖培養(yǎng)時(shí)間不斷增加，自噬水平出現(xiàn)下降，P62 堆積，代謝底物增多，故早期高糖刺激Müller細(xì)胞自噬激活，對維持細(xì)胞正常生理活性起到重要作用。我們推測，在高糖刺激視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞早期，自噬被激活，代謝底物未出現(xiàn)明顯增加，但是隨著時(shí)間的不斷延長，自噬水平下降，自噬出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，進(jìn)而造成代謝底物堆積，視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞自噬功能出現(xiàn)異常。

細(xì)胞自噬既是一種廣泛存在的正常生理過程，又是細(xì)胞對不良環(huán)境的一種防御機(jī)制[24]，但是自噬也猶如雙刃劍，自噬在DR（尤其是糖尿病視神經(jīng)退行性疾?。┲械降装缪葜鯓拥慕巧晕疵鞔_定論。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠的坐骨神經(jīng)軸突橫斷面和背根神經(jīng)節(jié)的感覺神經(jīng)元[25]均可發(fā)生自噬的異常。同樣，在胰島素導(dǎo)致的低血糖模型大鼠中，早期病變和晚期的再生軸突中均出現(xiàn)了明顯的自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)的改變[26]。因此，自噬是參與血糖改變引起的神經(jīng)病變發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，糖尿病引起的神經(jīng)病變多伴隨一系列的自噬調(diào)節(jié)失衡現(xiàn)象。近年來，隨著人們對自噬功能的不斷認(rèn)識和研究發(fā)現(xiàn)[27]，高糖環(huán)境下培養(yǎng)Müller細(xì)胞，隨著高糖的不斷刺激，雖然Müller細(xì)胞自噬被激活，但是自噬功能紊亂，錯(cuò)誤折疊蛋白逐漸增多，最終造成Müller細(xì)胞體損傷，同時(shí)檢測培養(yǎng)液中各種生長因子（如VEGF）含量明顯增高，Müller細(xì)胞過度膠質(zhì)增生，這提示高糖可通過刺激Müller細(xì)胞自噬功能發(fā)生紊亂，繼而破壞Müller細(xì)胞活性，最終導(dǎo)致DR的進(jìn)一步發(fā)展。還有一些研究也顯示[28]，在糖尿病動(dòng)物模型中，活性氧增多，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，非折疊蛋白質(zhì)增多造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力增大，從而導(dǎo)致自噬機(jī)制紊亂，在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中也發(fā)現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力標(biāo)記蛋白（如自噬轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白、磷酸-eif2a）改變。由此可見因糖尿病引起的神經(jīng)病變多伴隨一系列的自噬調(diào)節(jié)失衡現(xiàn)象，因此，自噬可能是參與血糖改變引起的視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

自噬與凋亡共同維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，既往研究發(fā)現(xiàn)，抗凋亡蛋白Bcl-2和自噬蛋白Beclin-1之間的相互作用可能是調(diào)節(jié)自噬和凋亡之間轉(zhuǎn)換的重要機(jī)制[29]。某些細(xì)胞在應(yīng)激條件下，細(xì)胞啟動(dòng)細(xì)胞自噬通路，刺激活躍的自噬反應(yīng)發(fā)生，代償性處理凋亡狀態(tài)的細(xì)胞，以幫助細(xì)胞中各種功能正常運(yùn)行[30]。而另一方面，如果細(xì)胞自噬通路出現(xiàn)障礙將導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊蛋白堆積，細(xì)胞反應(yīng)效率和功能受損，生命活動(dòng)失衡后啟動(dòng)凋亡通路[31]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證高糖培養(yǎng)的Müller中自噬改變對Müller細(xì)胞凋亡的影響，我們檢測了Müller細(xì)胞的凋亡水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高糖早期，自噬狀態(tài)增強(qiáng)，但是細(xì)胞凋亡水平較低，高糖培養(yǎng)晚期，自噬水平下降，自噬功能異常，凋亡細(xì)胞百分比明顯提高，這充分說明，激活自噬可以改善由高糖刺激的Müller細(xì)胞的凋亡水平，對細(xì)胞具有保護(hù)作用，反之，抑制視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞自噬反應(yīng)可增加細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究顯示在DR早期可能誘導(dǎo)自噬激活，降低視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞凋亡，但是隨著時(shí)間不斷延長，自噬功能被抑制，底物堆積，凋亡水平增加，這可能是高糖對視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞損傷的一種致病機(jī)制，所以對DR的防治一定要在早期予以控制，盡可能減少高糖對視網(wǎng)膜的損傷。本研究數(shù)據(jù)在細(xì)胞水平上對DR的發(fā)病機(jī)制提供了較好的理論支持，但是DR的病理機(jī)制復(fù)雜，后續(xù)詳盡的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)仍有待進(jìn)一步研究。