宋瑞嬌，馮彩軍，齊軍倉

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室, 新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】大麥具有釀造、飼用、食用及藥用價值[1]。在萌發(fā)階段，缺水會對幼苗造成生長不可逆的傷害，并顯著影響植物的產(chǎn)量與品質(zhì)[2]。研究大麥萌發(fā)期對干旱脅迫的響應(yīng)，對緩解干旱損傷具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】高等植物體內(nèi)存在氫化酶[3]。在種子萌發(fā)期，氫氣可能作為氣體信號分子參與植物對逆境脅迫的響應(yīng)。氫氣可通過激活淀粉酶活性、加速還原糖和總可溶性糖形成的途徑，減弱100 mmoL/L NaCl引起的萌發(fā)抑制[4]。富氫水(外源氫氣供體)預(yù)處理后，水稻的硼中毒癥狀得到了改善，這種緩解作用是通過增強抗氧化酶活性，緩解氧化損傷實現(xiàn)的[5]。氫氣還可在一定程度上調(diào)控赤霉素與脫落酸的動態(tài)平衡、維持根尖細胞及細胞核的完整性，并通過上述途徑減輕重金屬脅迫對禾谷類種子萌發(fā)的抑制[6, 7]?！颈狙芯壳腥朦c】雖然已有研究表明，氫氣參與作物萌發(fā)期的抗逆反應(yīng)，但有關(guān)氫氣對植物萌發(fā)階段抗旱性的研究尚未見報道。研究富氫水對干旱脅迫下大麥種子萌發(fā)的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】以新啤6號大麥為試材，在聚乙二醇模擬的干旱條件下，研究富氫水預(yù)處理對大麥種子抗氧化和滲透調(diào)節(jié)系統(tǒng)的影響，分析富氫水對大麥抗旱性的調(diào)控機理，為增強大麥干旱適應(yīng)能力提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試大麥品種為新啤6號，由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

1.2 方 法

1.2.1 脅迫濃度

選取大小均勻、籽粒飽滿的大麥種子置于10%的次氯酸鈉溶液中消毒10 min，蒸餾水洗凈后將其避光浸于蒸餾水中24 h,期間每隔12 h更換1次新鮮的蒸餾水。之后將種子每50粒轉(zhuǎn)移至鋪設(shè)4層濾紙并含有40 mL不同濃度(0、10%、20%、21%、22%、23%、24%和25%)聚乙二醇-6000的發(fā)芽盒(10 cm×15 cm)中，于25℃、光暗比12 h/12 h、光照強度為400 μmol/(m2·s)條件下培養(yǎng),每個處理重復(fù)3次。以胚根與種子等長、胚芽達到種子長1/2為發(fā)芽標(biāo)準，7 d后統(tǒng)計發(fā)芽率，據(jù)此確定種子萌發(fā)的半致死干旱脅迫濃度。

1.2.2 富氫水制備

采用鼓泡法，用AK-H300氫氣發(fā)生器(上海埃焜儀器設(shè)備有限公司)將純度為99.994%的氫氣以150 mL/min流速充入500 mL蒸餾水中1 h，制備出飽和氫氣溶解度的富氫水。之后按比例迅速與蒸餾水混合至所需濃度。

1.2.3 發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)

選取大小均勻、籽粒飽滿的大麥種子置于10%的次氯酸鈉溶液中消毒10 min，蒸餾水洗凈后將其避光浸于不同氫氣溶解度(0、25%、50%、75%和100%)的富氫水中24 h,期間每隔12 h更換1次新鮮溶液。之后將種子每50粒轉(zhuǎn)移至鋪設(shè)4層濾紙，并含有40 mL半致死聚乙二醇-6000溶液的發(fā)芽盒(10 cm×15 cm)中，于25℃、光暗比12 h/12 h、光照強度為400 μmol/(m2·s)條件下培養(yǎng)，每個處理重復(fù)3次。以胚根達到種子長、胚芽達到種子長1/2記為發(fā)芽，每隔24 h記錄發(fā)芽種子數(shù)，連續(xù)7 d，計算其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢。

發(fā)芽率=7 d內(nèi)能正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽勢=發(fā)芽高峰時期的發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)(Gt是第td的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽時間)。

1.2.4 測定指標(biāo)

萌發(fā)3 d后，直接選取長勢均勻的種子測定相關(guān)指標(biāo)，或用液氮速凍后置于-80℃冰箱以供后續(xù)實驗分析。其中，使用磺基水楊酸法測定脯氨酸含量[8]；蒽酮比色法測定可溶性糖含量[8]；參考Bradford的方法測定可溶性蛋白含量[9]；采用硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛含量[10]；氮藍四唑還原法測定超氧化物歧化酶活性，以抑制光化還原50%為1個酶活性單位[10]；按Maehly和Chance的方法測定過氧化物酶和過氧化氫酶活性[11]。所有指標(biāo)數(shù)據(jù)測定均為3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，Duncan新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 富氫水對干旱脅迫下大麥種子發(fā)芽特性的影響

研究表明，大麥種子的發(fā)芽率隨著聚乙二醇-6000濃度的增加而下降。當(dāng)脅迫濃度達到10%時，種子的萌發(fā)受到顯著抑制；聚乙二醇-6000濃度為20%時，大麥種子發(fā)芽率約為對照的一半；當(dāng)脅迫濃度達到35%后，種子發(fā)芽率低于10%，萌發(fā)進程幾乎被完全抑制。25%、50%及75%的富氫水為適宜浸種濃度，三者均可顯著提高干旱脅迫下大麥種子的發(fā)芽率，相比于對照各高出了13.3、9.3與7.3個百分點，而100%的富氫水雖也表現(xiàn)出一定的促進效應(yīng)，但作用并不顯著。對萌發(fā)3 d后種子的發(fā)芽勢作計量，25%與50%濃度的富氫水可將干旱脅迫下大麥種子的發(fā)芽勢提升15.3與13.3個百分點，其余濃度差異均不顯著。相較于對照，不同濃度富氫水處理下大麥種子的發(fā)芽指數(shù)都有所提高，但僅有25%、50%和75%的富氫水表現(xiàn)出顯著的提升作用。以25%和50%富氫水處理效果最好。圖1，表1

2.2 富氫水對干旱脅迫下大麥種子滲透調(diào)節(jié)物含量的影響

研究表明,不同濃度的富氫水處理，對干旱脅迫下大麥種子萌發(fā)期滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量有較為明顯的影響。相比于對照，各濃度富氫水均能顯著提高種子中可溶性糖的含量，其中，以25%和50%的富氫水提升效果最佳，可溶性糖含量可達對照的1.36與1.31倍，75%和100%的富氫水處理下，可溶性糖含量則為對照的1.09和1.10倍。隨著富氫水濃度的增加，萌發(fā)大麥種子中可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)富氫水濃度為25%時，可溶性蛋白含量與對照相比有顯著性升高；當(dāng)富氫水濃度為50%后，可溶性蛋白含量達到峰值，為對照的1.20倍；而當(dāng)富氫水濃度達到75%和100%時，可溶性蛋白含量雖有提升，但增幅并不顯著。大麥種子中游離脯氨酸含量在50%與75%富氫水處理下，較之對照有顯著性增加，分別達到1.33與1.05倍，其余濃度處理后，游離脯氨酸含量無顯著性差異。表2

注：圖柱上不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

表1 不同濃度富氫水浸種干旱脅迫下大麥種子萌發(fā)變化Table 1 Effects of different HRW concentrations on barley seed germination under drought stress

表2 不同濃度富氫水浸種干旱脅迫下大麥種子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)變化Table 2 Effects of different HRW concentrations on the content of osmotic regulation substances on barley seed under drought stress

2.3 富氫水對干旱脅迫下大麥種子氧化還原平衡的影響

研究表明，不同濃度富氫水處理可參與調(diào)節(jié)干旱脅迫下萌發(fā)期大麥種子的氧化還原平衡。丙二醛是一種衡量氧化脅迫程度高低的指標(biāo)，相比于對照，25%、50%、75%的富氫水中丙二醛含量分別降低了14.5%、8.4%和8.6%，100%富氫水中丙二醛含量雖有所降低，但與對照無顯著性差異。超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶是重要的抗氧化酶，對維持植物體內(nèi)氧化還原平衡有重要作用。在富氫水處理下，3種酶的活性均有所升高。其中，超氧化物歧化酶活性僅在25%與75%時有顯著性差異，其余處理提升均不顯著；過氧化物酶和過氧化氫酶的活性均符合先上升后下降的規(guī)律，前者活性在富氫水濃度為50%時最高，25%時次之，分別為對照的1.40倍和1.28倍，濃度為75%和100%時，差異不顯著；后者活性在富氫水濃度為50%時最高，75%、25%時次之，分別為對照的2.2倍、1.90倍和1.58倍，100%時則無顯著性差異。表3

表3 不同濃度富氫水浸種干旱脅迫下大麥種子丙二醛含量和抗氧化酶活性Table 3 Effects of different HRW concentrations on the content of malondialdehyde and antioxidant enzyme activities of barley seed under drought stress

3 討 論

3.1 富氫水以濃度依賴的方式促進干旱脅迫下大麥種子的萌發(fā)

發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)是衡量發(fā)芽質(zhì)量的常用指標(biāo)[12]。輕微的干旱脅迫有利于柱花草、洋蔥等植物的萌發(fā)，而過度的干旱脅迫會顯著降低發(fā)芽率、發(fā)芽勢與發(fā)芽指數(shù)[13, 14]。研究則發(fā)現(xiàn)，大麥種子的萌發(fā)質(zhì)量在呈濃度梯度的聚乙二醇-6000溶液中均受到了不同程度的抑制，這與在紫花苜蓿和野生草木犀中的研究結(jié)果一致[15,16]。低濃度聚乙二醇-6000處理可增高耐旱性較強茅草的發(fā)芽率，而降低干旱敏感茅草的萌發(fā)質(zhì)量[17]。

試驗篩選20%聚乙二醇-6000為大麥種子萌發(fā)的半致死濃度。富氫水能以濃度依賴的方式緩解該濃度下聚乙二醇-6000對大麥種子萌發(fā)的抑制，其中以25%和50%的富氫水溶液處理最佳。在硼、鋁等重金屬脅迫中，富氫水的作用也表現(xiàn)出了類似的規(guī)律[5, 18]，富氫水的促進效應(yīng)伴隨著氫氣溶解度的增高而增強。100%富氫水對高鹽脅迫下水稻種子的萌發(fā)最有利[4]，高濃度富氫水更能提升黃瓜對熱脅迫的耐受性[19]。

3.2 富氫水通過提升大麥種子中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量增強干旱脅迫耐受性

干旱脅迫下，植物體會合成并積累大量可溶性糖與可溶性蛋白以平衡細胞內(nèi)外水勢，緩解缺水對植物生長發(fā)育造成的負面影響[11, 20]。富氫水處理可顯著增加缺水條件下大麥種子中可溶性糖與可溶性蛋白含量，這與富氫水在鹽脅迫與銅脅迫中所起到的作用相一致[4,7]。

物質(zhì)的累積有利于降低組織內(nèi)外滲透勢，防止細胞脫水甚至死亡，其含量與植物抗逆性強弱成正比[21, 22]；游離脯氨酸含量可作為一種衡量植物所受脅迫程度大小的指標(biāo)，脅迫程度越重，游離脯氨酸含量越高[20, 23]。研究結(jié)果與第一種觀點一致，當(dāng)富氫水濃度為25%與50%時，大麥種子中游離脯氨酸含量最高，該處理下發(fā)芽率、發(fā)芽勢等指標(biāo)表現(xiàn)最佳，25%、50%富氫水浸種后，大麥種子受到的干旱損傷最小。

3.3 富氫水通過增強抗氧化酶活性緩解干旱脅迫對大麥種子造成的氧化損傷

干旱脅迫會使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，如過氧化氫、羥基自由基、超氧陰離子、氧化硝酸陰離子等。過量的活性氧累積會啟動膜脂過氧化作用，造成細胞膜損傷，甚至導(dǎo)致細胞死亡[24, 25]。丙二醛是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物，該產(chǎn)物自身過度累積也可對植物產(chǎn)生毒害作用。研究表明，不同濃度富氫水以濃度依賴的方式降低了干旱脅迫下大麥種子中的丙二醛含量，適宜濃度外源供氫有利于緩解干旱脅迫對萌發(fā)期大麥造成的氧化損傷。

為了應(yīng)對逆境條件下活性氧的積累，植物自身可啟動氧化保護系統(tǒng)中的酶類物質(zhì)，如超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶等，和一些非酶類化合物，如脯氨酸等來抵御與清除活性氧[24]。超氧化物歧化酶可將植物體內(nèi)的超氧陰離子轉(zhuǎn)化為過氧化氫和水。氫氣能夠降低miR398a和miR159a的轉(zhuǎn)錄本，并上調(diào)靶基因OsSOD2與OsGAMYB的表達水平[6]。適宜濃度的富氫水能顯著提高植物種子中超氧化物歧化酶的活性，這與上述結(jié)果相一致[6]。過氧化物酶和過氧化氫酶能清除植物體內(nèi)累積的過氧化氫。試驗發(fā)現(xiàn)25%與50%富氫水可顯著提升2種酶的活性，75%富氫水可顯著增加過氧化氫酶活性，這與劉豐嬌等[20]的研究結(jié)果基本相同。此外，羥基自由基、氧化硝酸陰離子也對細胞膜有高度破壞性。氫氣可選擇性地清除上述2種強毒性活性氧[21]，這可能也是富氫水浸種能夠緩解干旱脅迫下大麥種子氧化損傷的原因，但仍需進一步研究驗證。

4 結(jié) 論

20%聚乙二醇-6000脅迫可對大麥種子萌發(fā)造成較大程度的抑制，25%和50%富氫水浸種可以顯著改善萌發(fā)質(zhì)量，使大麥的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)提高。富氫水能增加可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸含量，通過調(diào)節(jié)細胞和組織的水勢平衡增強萌發(fā)期大麥種子的抗旱能力；富氫水還能促進大麥種子內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性的升高，以及時清除活性氧并降低丙二醛含量，緩解干旱脅迫對大麥種子造成的氧化傷害。