劉海洋，王 偉，張仁福，溫切木·阿布列孜，姚 舉

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091； 2. 阿勒泰市菜籃子工程辦公室, 新疆阿勒泰 836500)

0 引 言

【研究意義】2019年新疆棉花種植面積占全國(guó)76.1%，產(chǎn)量占全國(guó)84.9%，棉花黃萎病發(fā)生也日漸嚴(yán)重[1,2]。生產(chǎn)上缺乏抗病種質(zhì)資源且抗性易丟失[3]，利用環(huán)境友好的生物技術(shù)對(duì)棉花黃萎病進(jìn)行防治優(yōu)勢(shì)凸顯。【前人研究進(jìn)展】土壤中的大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)的微菌核是棉花黃萎病的主要侵染源，微菌核數(shù)量與黃萎病的發(fā)生程度顯著正相關(guān)[4]，微菌核抗逆性強(qiáng)[5]，降低土壤中的微菌核數(shù)量是防控棉花黃萎病的前提。LóPezescudero等[6]利用Diplotaxisvirgata,Lavandulastoechas和Thymusmastichina制成的有機(jī)改良劑顯著降低了大麗輪枝菌產(chǎn)微菌核的能力，降低了該病的發(fā)生程度。吳藹民等[7]利用內(nèi)生菌拮抗菌73 a對(duì)棉苗蘸根處理后移栽入人工病田，后期調(diào)查發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌73 a對(duì)棉花黃萎病具有良好的防治效果且還有一定的促進(jìn)作用；林玲等[8]同樣發(fā)現(xiàn)，生防內(nèi)生細(xì)菌Jaascd的發(fā)酵液在棉苗移栽前噴施和灌根都能有效防治棉花黃萎病。石磊等[9]利用滴灌設(shè)施滴施枯草芽孢桿菌可濕性粉劑、哈茨木霉菌劑、中農(nóng)綠康等生物藥劑對(duì)棉花黃萎病進(jìn)行了防治，發(fā)現(xiàn)3種生物藥劑均對(duì)黃萎病發(fā)病具有明顯的防治效果?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】新疆南疆生產(chǎn)上利用不同生防菌劑防治棉花黃萎病時(shí)發(fā)現(xiàn)存在防效不穩(wěn)定、效果不佳的問(wèn)題。由于生防菌與土壤中土著微生物存在競(jìng)爭(zhēng)，生防菌與作物根部的親和能力以及其它非生物因子同樣是限制生防菌劑防治能力的重要原因[10]。生防菌(菌劑)的施用方式、施用時(shí)間等也是影響生防菌防治效果的重要因素。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以庫(kù)爾勒棉田利用生防菌防治棉花黃萎病為例，從土壤中病原菌數(shù)量、滴施時(shí)間、生防菌定植、抑菌能力等方面分析生防菌防治棉花黃萎病過(guò)程中的主要制約因素，為棉花黃萎病的生物防治提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試品種

感病品種：軍棉1號(hào)、新陸中36號(hào)；耐病品種：中棉所49、中植棉2號(hào)，均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.1.2 供試菌株

生防菌株AL7是新疆棉田土壤中分離的一株具有廣譜抑菌活性的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌，攜帶有四環(huán)素(tetracycline，Tet)抗性基因和gfp基因[11]。

1.1.3 供試土壤

2017年6月中旬，在農(nóng)業(yè)部庫(kù)爾勒作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站棉花黃萎病病圃(E85.801821、E41.750644)采集軍棉1號(hào)健康株與黃萎病株根圍0～10、10～20和20～40 cm土層的土壤，各取3個(gè)重復(fù)，帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存，備用。

1.2 方 法

1.2.1 棉花黃萎病發(fā)生程度以及滴灌時(shí)期調(diào)查

于6月15日起按全國(guó)統(tǒng)一病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查庫(kù)爾勒病圃?xún)?nèi)4個(gè)棉花品種的黃萎病發(fā)生情況。病情指數(shù)=∑(各級(jí)病株數(shù)×發(fā)病級(jí)別)/(調(diào)查總株數(shù)×4)×100。

記錄棉田滴灌一水時(shí)間，于灌水1 d后測(cè)量水分滲透深度。

1.2.2 不同深度土層微菌核數(shù)量檢測(cè)

配制選擇性培養(yǎng)基[12]，稱(chēng)取3 g土壤樣品用研缽研細(xì)，3份，分別放入盛有200 mL水的三角瓶中，加入少量玻璃珠，靜置10 min，在200 r/min的搖床上搖30 min。然后倒入上層150 μm下層38 μm的雙層細(xì)篩，在自來(lái)水下將泥土沖洗干凈。留在下層篩網(wǎng)上的土壤殘留物全部轉(zhuǎn)移到50 mL三角瓶中，用無(wú)菌水定容到30 mL。將定容好的土樣液每次均勻吸取2 mL于改良微菌核選擇分離培養(yǎng)基表面均勻涂布，接種5皿，在超凈工作臺(tái)上吹干， 28℃下黑暗培養(yǎng)10 d檢查。每5皿的檢驗(yàn)結(jié)果數(shù)目之和就是所測(cè)1 g土樣中所含棉花黃萎病菌微菌核的數(shù)量，3次重復(fù)。

1.2.3 生防菌AL7在土壤中的定植檢測(cè)

將含有四環(huán)素抗性基因的生防菌AL7在含10 mg/L四環(huán)素的固體LB培養(yǎng)基上劃線活化。待長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌落接種于含有5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，于搖床中37℃、200 r/min振蕩搖培8 h。取30 μL此菌懸液接種到300 mL含有10 μg/mL四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min搖床搖培3 d，離心收集菌體，用無(wú)菌水清洗菌體3次，最后用無(wú)菌水稀釋到l×108cfu/mL的接種濃度，重復(fù)制備10份。在病圃?xún)?nèi)棉苗2葉期時(shí)棉花根圍進(jìn)行灌根，單株棉花根圍灌根菌懸液量與滴灌水量盡量相同。分別于接種后5、20、40、60 d取棉花根圍0～20 cm、20～40 cm耕層土樣。利用選擇平板稀釋法回收土壤中菌株AL7[12]。

1.2.4 土壤浸提液對(duì)生防菌AL7生長(zhǎng)量的影響

取棉花根圍土壤250 g加入無(wú)菌水250 mL(室溫振蕩5 h靜置24 h后取上層清液，3層濾紙過(guò)濾，再經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾，得1∶1原液，繼而配制成1∶2、1∶4的土壤浸提液，置于4℃冰箱保存。將生防菌株AL7在LB培養(yǎng)基上活化，轉(zhuǎn)入裝有5 mL(液體LB培養(yǎng)液的試管中，30℃下180 r/min搖培4 h后，取1 mL(菌懸液分別接入配制好的1∶1、1∶2、1∶4的土壤浸提液，30℃，180 rpm/min搖培，每1 h利用分光光度計(jì)測(cè)菌懸液的OD600值，10 h后停止測(cè)量，根據(jù)OD600值畫(huà)出菌株的生長(zhǎng)曲線，評(píng)價(jià)土壤浸提液對(duì)生防菌AL7生長(zhǎng)的影響。

1.2.5 生防菌對(duì)微菌核的抑制能力

將生防菌株AL7在固體LB培養(yǎng)基上劃線活化，挑取單菌落接種于含有250 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于搖床中37℃、120 r/min振蕩搖培2 d，制成AL7菌懸液；市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)某品牌生物菌劑制成推薦濃度懸液。將保存的病圃土壤放置于φ10 cm、深度10 cm的盆缽中，將上述制備好的生防菌AL7、生物菌劑懸液灌入盆缽中，使之全部浸透，10 d后均勻取盆缽中土壤，檢測(cè)微菌核數(shù)量，并制備懸液灌第2次，10 d后再次均勻取盆缽中土壤，檢測(cè)微菌核數(shù)量。設(shè)清水對(duì)照，3次重復(fù)。

校正抑制率(%)=[1-(處理后微菌核數(shù)量×對(duì)照前微菌核數(shù)量)/(處理前微菌核數(shù)量×對(duì)照后微菌核數(shù)量)]×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、匯總并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花黃萎病發(fā)生動(dòng)態(tài)與滴灌

研究表明,6月初庫(kù)爾勒棉田黃萎病已開(kāi)始顯癥，6月15日黃萎病病圃?xún)?nèi)軍棉1號(hào)的病情指數(shù)為8.67，至7月15日病情指數(shù)迅速升至63.92。同期相比，6月15日中棉49號(hào)的病情指數(shù)為0.71，至7月15日病情指數(shù)僅為0.58。中棉49號(hào)對(duì)黃萎病表現(xiàn)出極強(qiáng)的耐受性。圖1

庫(kù)爾勒棉區(qū)滴灌頭水日期為6月中旬，病圃滴灌一水時(shí)期為6月19日，田間棉花黃萎病已顯癥。頭水的滲透深度為32.0 cm，軍棉1號(hào)的主根系平均長(zhǎng)度為38.5 cm，平均株高為19.6 cm，發(fā)病棉株的維管束變色高度平均為15.5 cm。棉田滴一水時(shí)，黃萎病菌已經(jīng)由主根系或側(cè)根系完成侵染并沿維管束向上蔓延，并使棉花顯現(xiàn)病癥。滴施生物菌劑時(shí)期嚴(yán)重遲于黃萎病菌的侵染時(shí)間。且灌水的滲透深度與棉花根系長(zhǎng)度相差6.5 cm，并不能完全將生防菌劑等輸送至棉花根尖等易受黃萎病菌侵染的組織部位。

圖1 不同棉花品種黃萎病發(fā)生動(dòng)態(tài)Fig.1 Occurrence dynamics of Verticillium wilt in different cotton varieties

2.2 棉田不同深度土層中大麗輪枝菌微菌核數(shù)量

研究表明，健康與發(fā)病棉株根圍土壤中棉花黃萎病菌微菌核的含量及垂直分布存在顯著差異。健康棉株根圍土中的微菌核總量為232個(gè)/g土，主要集中在0～10 cm土層中，該土層微菌核數(shù)量為224個(gè)/g土，占全部微菌核數(shù)量的96.6%；發(fā)病棉株根圍土中微菌核總量為721個(gè)/g土，其中0～10 cm土層中微菌核含量為310個(gè)/g土，占總量的43.0%；10～20 cm土層中微菌核數(shù)量為366個(gè)/g土，占總量的50.8%；20-40 cm土層中微菌核數(shù)量為45個(gè)/g土，占總量的6.2%。圖2，圖3

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05), 誤差線表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(n=4)

圖3 土壤中分離出的大麗輪枝菌微菌核在選擇性培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.3 Growth status of microsclerotia isolated from soil on selective medium

2.3 生防菌AL7在土壤中的定植

研究表明，接種5 d時(shí)，生防菌AL7在0～20 cm的土層中的定植數(shù)量為4.5×106個(gè)/g土，在20～40 cm的土層中AL7的定植數(shù)量為2.8×105個(gè)/g土；接種20 d時(shí)，AL7在土壤中的定植量開(kāi)始降低，在0～20 cm的土層中定植數(shù)量為3.3×106個(gè)/g土，在20～40 cm土層中的定植數(shù)量為1.3×105個(gè)/g土；至40～60 d時(shí)，AL7在0～20 cm的土層中的定植量明顯降低至約1×106個(gè)/g土，在20～40 cm土層中的定植數(shù)量約0.5×105個(gè)/g土。生防菌AL7未在土壤中自然增殖，其定植數(shù)量隨著時(shí)間延長(zhǎng)開(kāi)始下降，20 d后下降較為明顯，主要定植在0～20 cm的土層中。圖4

圖4 生防菌AL7在不同深度土層土壤中的定植(1×105)Fig.4 The colonization of bio-control bacteria AL7 in soil at different depths

2.4 土壤浸提液對(duì)生防菌AL7生長(zhǎng)的影響

研究表明，經(jīng)過(guò)10 h的培養(yǎng)，生防菌AL7在純土壤浸提液處理中的OD600值始終最高，顯著高于其它處理。而生防菌AL7在1/2和1/4土壤浸提液2個(gè)處理中0～7 h的OD600值與清水對(duì)照處理沒(méi)有顯著差異；在8～10 h階段，生防菌AL7在1/2和1/4浸提液2個(gè)處理中的OD600值均超過(guò)了清水對(duì)照，且生防菌AL7在1/2浸提液處理的OD600值高于1/4浸提液處理。棉田土壤浸提液對(duì)生防菌的生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。圖5

圖5 土壤浸提液對(duì)生防菌生長(zhǎng)量的影響Fig.5 The effect of soil extract on the growth of bio-control bacteria

2.5 生防菌AL7與生物菌劑對(duì)大麗輪枝菌微菌核的抑制作用

研究有明，生防菌AL7發(fā)酵原液首次施用10 d后，土壤中微菌核數(shù)量由253個(gè)/g土降至44個(gè)/g土；生物菌劑處理土壤中微菌核數(shù)量由264個(gè)/g土下降至181個(gè)/g土；而對(duì)照土壤中微菌核數(shù)量由393個(gè)/g土下降至205個(gè)/g土，經(jīng)計(jì)算生防菌AL7發(fā)酵液的校正抑制率為66.7%，其200 X液的抑制率僅為5.0%；而生物菌劑處理的校正防效為負(fù)值，沒(méi)有抑制效果。

第2次施用10 d后，生防菌AL7發(fā)酵原液處理土壤中微菌核數(shù)量下降至10個(gè)/g土，校正防效為70.5%，200 X液的校正抑制率僅為5.5%；而生物菌劑處理每克土壤中微菌核數(shù)量由上升至224個(gè)/g土，沒(méi)有抑制效果，相反還促進(jìn)微菌核數(shù)量增加了43個(gè)/g土。表1

表1 生防菌(生物菌劑)對(duì)大麗輪枝菌微菌核的抑制作用(個(gè)/g土)Table 1 Inhibitory effect of bio-control bacteria(agent)on the microsclerotia of Verticillium dahliae (per/g soil)

3 討 論

3.1棉花黃萎病作為嚴(yán)重威脅新疆棉花生產(chǎn)的土傳病害，難以防治，利用生物防治技術(shù)進(jìn)行防控是一項(xiàng)重要措施[7-9]。諸如在營(yíng)養(yǎng)缽育苗土和大盆缽移栽土中施用微生物有機(jī)肥對(duì)棉花黃萎病的防治率可達(dá)80%以上[13]；田間利用西蘭花殘?bào)w對(duì)黃萎病的防治效果達(dá)43.06%[14]，能夠降低微菌核的數(shù)量[15]；多種生防菌制成有機(jī)改良劑能顯著降低棉花黃萎病菌產(chǎn)生微菌核的能力，降低了棉花黃萎病的發(fā)病程度[6]，田間拌種和隨水滴施枯草芽孢桿菌S37和S44對(duì)棉花黃萎病的防治效果可達(dá)30%～50%[16]；利用滴灌隨水滴施枯草芽孢桿菌可濕性粉劑、哈茨木霉菌劑、中農(nóng)綠康等生物藥劑對(duì)棉花黃萎病的防治效果可達(dá)33.5%～70%以上[9]。

3.2在庫(kù)爾勒棉區(qū)影響生防菌(菌劑)防治棉花黃萎病效果的首要因素是防治時(shí)期錯(cuò)位。由于庫(kù)爾勒棉區(qū)沒(méi)有實(shí)行北疆的干播濕出的栽培模式，滴施生防菌(菌劑)的時(shí)間延遲至6月中旬(頭水)，此時(shí)與石磊等[9]相比推遲了50 d，沒(méi)有在第一時(shí)間占據(jù)棉花根圍生態(tài)位；而6月中旬棉花黃萎病已開(kāi)始顯癥，防治時(shí)期的嚴(yán)重錯(cuò)位對(duì)于維管束系統(tǒng)侵染病害依然無(wú)效。

3.3生防菌在土壤中的定植、增殖能力決定其生防效果。研究中土壤浸提液并未抑制生防菌的生長(zhǎng)，但是生防菌在棉田中的自然增殖能力較差，主要定植在0～20 cm土層中，在20～40 cm土層中的定植量較低，所以對(duì)20～40 cm土層中的黃萎病菌微菌核的抑制效果便會(huì)打折扣。

3.4庫(kù)爾勒試驗(yàn)病田土壤中黃萎病菌微菌核含量高，發(fā)病棉株根圍0～40 cm土層中微菌核平均含量約為240個(gè)/g土，核算總量約為3.1×107個(gè)，在如此大的病原菌基數(shù)下，棉花根系承受巨大的侵染壓力。

3.5微菌核抗逆性強(qiáng)[5]，生防細(xì)菌(菌劑)對(duì)其僅有抑制生長(zhǎng)作用而無(wú)殺死能力，生防細(xì)菌AL7的200 X發(fā)酵液對(duì)微菌核的抑制率非常低，僅為5.5%，尤為甚者生物菌劑對(duì)微菌核沒(méi)有抑制效果，反而促進(jìn)了其數(shù)量的增長(zhǎng)，與Marzano等[17]、Olanya等[18]、Eo等[19]研究結(jié)果接近。

土傳病原菌通常是從宿主根部的傷口或在初生根和次生根的交界處開(kāi)始入侵，而生防菌對(duì)生態(tài)位點(diǎn)的提前占領(lǐng)能有效防止病原菌侵染植物根系[20]。

4 結(jié) 論

4.1庫(kù)爾勒棉區(qū)隨水滴施生物菌劑時(shí)間為6月中旬，較出苗期推遲約60 d，大大遲于棉花黃萎病菌的侵染始期。應(yīng)探索適合當(dāng)?shù)氐拿藁ǜ刹癯黾夹g(shù)，提前施用生物菌劑。

4.2生防菌在土壤中的定植、自然增殖能力較差。應(yīng)增施羊糞等有機(jī)肥，增加土壤中有機(jī)質(zhì)的含量，改善土壤微生態(tài)并促進(jìn)有益微生物的增長(zhǎng)。

4.3重病田土壤中棉花黃萎病菌微菌核基數(shù)過(guò)大，達(dá)107數(shù)量級(jí)，甚至更高。重病棉田生防菌劑只能作為輔助措施，主要應(yīng)依靠種植抗病品種。

4.4生防菌(菌劑)對(duì)土壤中微菌核的抑制能力較差。應(yīng)施用以拮抗菌為主導(dǎo)包括促生、分解類(lèi)有益微生物的微生物復(fù)合制劑，抑制病原真菌的同時(shí)提高作物的抗性以抵御病原菌的侵襲。