鄭雪芳，王梓然，朱育菁，陳燕萍，王階平，劉 波

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003；2. 廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門 361102）

0 引言

【研究意義】由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum，簡稱青枯菌）引起的番茄青枯病是一種毀滅性土傳病害[1]，在全國各番茄種植區(qū)域普遍發(fā)生，尚無有效的藥劑防治，主要依靠抗病品種、嫁接苗、栽培措施等。青枯菌在自然界中存在致病力分化現(xiàn)象[2-4]，其無致病力突變株可以侵染植株，不引起寄主植物產(chǎn)生病害，具有重要的生防應(yīng)用潛力[5]?！厩叭搜芯窟M展】青枯菌無致病力菌株及其作用機制有許多報道[6-9]。Frey等[6]用hrp-突變體防治番茄青枯病，病情指數(shù)比對照降低80%，并推遲25 d發(fā)病。楊宇紅等[7]研究表明，無致病力青枯菌hrp-突變體對致病性青枯菌雖無直接抑制作用，但其可在寄主體內(nèi)定殖，阻止致病性青枯菌的增殖。劉波等指出，病原菌弱毒株侵入植株體內(nèi)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生類似“弱菌株免疫保護”的防病作用[8]。Feng等[9]報道預(yù)接種無致病力青枯菌ΔhrpB突變株，可誘導(dǎo)擬南芥抗病相關(guān)基因表達，其中26%上調(diào)表達的基因參與脫落酸（ABA）生物合成和信號傳導(dǎo)。植物受到外界因子誘導(dǎo)，體內(nèi)基因會有不同的響應(yīng)，從而出現(xiàn)基因表達水平不同[10]。植物激素，如水楊酸（salicylic acid, SA）、茉 莉 酸（jasmonic acid, JA）和 乙 烯（ethylene, ET）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其交互作用在植物免疫應(yīng)答中發(fā)揮極其重要的作用[11-12]。【本研究切入點】目前青枯菌致病性菌株誘導(dǎo)番茄、馬鈴薯和花生等寄主信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因表達的報道較多[13-15]，但是，無致病力青枯菌與番茄互作研究有待深入探討。我們前期研究已篩選獲得一株高防效（番茄盆栽苗和田間防效分別為100%和77.45%）的青枯菌無致病力菌株FJAT1458[16-17]，但其誘導(dǎo)抗病機制未明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】比較分析青枯菌無致病力菌株FJAT1458和強致病力菌株FJAT91對番茄SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑防御相關(guān)基因gluA和PR-1a，JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑防御相關(guān)基因pin2和loxA及ET信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑防御相關(guān)基因PR-1b和Osmotin-like表達量的變化，為探明菌株FJAT-1458誘導(dǎo)番茄系統(tǒng)防御反應(yīng)的分子機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

青枯菌無致病力菌株FJAT1458和強致病力菌株FJAT91分別分離自健康番茄和青枯病發(fā)病植株，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所菌種庫收集保存。青枯菌培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基TTC的配制參照Kelman的方法[18]，液體培養(yǎng)基為SP（蔗糖20 g，蛋白胨5 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.025 g，定容至1 L，pH 7.0）。番茄品種為金石王1號，購自廈門如意集團開發(fā)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化和接種處理 青枯菌無致病力菌株FJAT1458和強致病力菌株FJAT91在TTC平板上活化，30 ℃、48 h后，轉(zhuǎn)接至SP培養(yǎng)基，于170 r·min-1、30 ℃培養(yǎng)24 h，兩種菌液均稀釋至108CFU·mL-1，分別灌根接種于5～6葉齡的番茄盆栽苗上，100 mL·盆-1，每處理20盆（1株·盆-1），設(shè)3個重復(fù)。接種無菌水為對照（CK）。接種處理后的0、3、6、12、24、36、48、72 h進行取樣，隨機采取500 mg左右的番茄葉片，放入液氮中速凍，之后迅速放入-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 總 RNA的提取 采用Transzol Up Plus RNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取番茄葉片總RNA。參照說明書進行提取。提取的RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并用紫外分光光度計檢測RNA的純度及濃度。

1.2.3 cDNA的合成 按照RevertAid First Stand cDNA Synthesis Kit（Thermo）反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作方法，將各處理番茄葉片總RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。獲得的cDNA產(chǎn)物直接用于PCR或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 防御基因熒光定量PCR RT-PCR采用10 μL反應(yīng)體系：5.0 μL TransStart?Top/Tip Green qPCR Super-Mix (2×)，正反向引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，加水至10 μL；RT-PCR的反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 退火/延伸30 s，45個循環(huán)。熒光定量引物見表1，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表 1 RT-PCR檢測基因的特異引物序列Table 1 Specific primer sequences used for RT-PCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析以管家基因actin作為內(nèi)參，采用公式方法計算防御基因的表達量[19]。計算公式如下：目的基因相對表達量數(shù)據(jù)分析采用Excel 2010、DPS 16.05和Graphpad Prism 7.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同致病力青枯菌誘導(dǎo)SA途徑防御基因gluA和PR-1a的表達結(jié)果分析

青枯菌無致病力菌株FJAT1458和強致病力菌株FJAT91均誘導(dǎo)番茄gluA和PR-1a基因的表達量呈先上升后下降的趨勢，接種12 h，兩種基因在強或無致病力菌株誘導(dǎo)下表達量均達最大值。在觀察期內(nèi)（3 h除外），無致病力菌株FJAT1458誘導(dǎo)番茄gluA基因的表達量均顯著大于對照組，而接種強致病力菌株FJAT91初期（3～24 h）誘導(dǎo)番茄gluA基因表達量顯著高于對照組，接種72 h后則顯著低于對照（P＜0.05）。接種初期（12 h前），強致病力菌株FJAT91誘導(dǎo)gluA基因的表達量顯著高于無致病力菌株FJAT1458（P＜0.05），后期（24 h后）則相反（圖1-A）。此外，接種后3～36 h，強致病力菌株FJAT91誘導(dǎo)PR-1a基因表達量均顯著高于無致病力菌株FJAT1458和對照組（圖1-B）。

圖 1 接種青枯菌不同時間番茄葉片gluA基因（A）和PR-1a基因（B）相對表達量Fig. 1 Relative expressions of gluA (A) and PR-1a (B) in tomato leaves after R. solanacearum inoculation for different time lengths

2.2 不同致病力青枯菌誘導(dǎo)JA途徑防御基因loxA和pin2的表達結(jié)果分析

觀察期內(nèi)（3 h除外）無致病力菌株FJAT1458誘導(dǎo)番茄植株loxA和pin2基因表達量均顯著高于對照組（P＜0.05）。接種初期（3～24 h）無致病力菌株FJAT1458誘導(dǎo)番茄植株loxA基因表達量顯著低于強致病力菌株FJAT91，接種后期（48 h后），F(xiàn)JAT1458誘導(dǎo)番茄植株loxA基因表達量顯著高于FJAT91處理（P＜0.05）（圖2-A）。菌株FJAT1458和FJAT-91誘導(dǎo)番茄植株pin2基因表達量最大值分別出現(xiàn)在接種后12 h和6 h，分別為CK的131.36倍和186.69倍；FJAT-91誘導(dǎo)番茄植株pin2基因相對表達量在12～24 h驟降，接種12 h 后，其誘導(dǎo)pin2基因相對表達量均顯著低于FJAT1458處理（P＜0.05）。

2.3 不同致病力青枯菌誘導(dǎo)ET途徑抗性基因PR-1b和Osm的表達結(jié)果分析

觀察期內(nèi)（48 h除外），無致病力菌株FJAT1458誘導(dǎo)番茄植株Osm基因表達量均顯著高于CK，接種12 h，F(xiàn)JAT1458 誘導(dǎo)Osm基因表達量達到最大值，為CK的7.68倍。強致病力菌株FJAT-91 誘導(dǎo)番茄植株Osm基因表達量呈現(xiàn)“先上升后下降”趨勢，接種12 h達最大值，為對照組13.86倍，接種72 h，其誘導(dǎo)Osm基因表達量與對照組相當，顯著低于FJAT1458處理組（圖3-A）。接種3～24 h，F(xiàn)JAT1458誘導(dǎo)PR-1b基因表達量顯著低于FJAT-91處理組，接種36 h后則相反，PR-1b基因在FJAT1458處理組的表達量顯著高于FJAT-91處理組（P＜0.05）（圖3-B）。

圖 2 接種青枯菌不同時間番茄葉片loxA基因（A）和pin2基因（B）相對表達量Fig. 2 Relative expressions of loxA (A) and pin2 (B) in tomato leaves after R. solanacearum inoculation for different time lengths

圖 3 接種青枯菌不同時間番茄葉片Osm基因（A）和PR-1b基因（B）相對表達量Fig. 3 Relative expressions of Osm (A) and PR-1b (B) in tomato leaves after R. solanacearum inoculation for different time lengths

3 討論與結(jié)論

許多研究表明，青枯菌的無致病力突變株能夠誘導(dǎo)植物各個信號途徑的系統(tǒng)防御基因的表達[20-21]。陳達[20]研究表明，青枯菌phcA-突變株接種3 d，其對番茄SA、JA和ET信號途徑防御基因都有不同程度的誘導(dǎo)，而青枯菌phcA-突變株和hrp-突變株能有效誘導(dǎo)煙草SA和JA信號途徑防御基因的表達。本研究發(fā)現(xiàn)，青枯菌強弱菌株均能誘導(dǎo)番茄植株SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑gluA和PR-1a基因、JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑pin2和loxA基因及ET信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑PR-1b和Osmotinlike（osm）基因的相對表達，表明接種青枯菌能夠激活番茄植株系統(tǒng)防御反應(yīng)。

劉俊平等[21]比較了青枯菌GMI1000的hrp-突變株與出發(fā)菌株GMI1000對PR-1a基因的誘導(dǎo)情況，發(fā)現(xiàn)在接種GMI1000菌株12 h時PR-1a的表達量最高，之后，表達量降低，本研究同樣發(fā)現(xiàn)青枯菌強致病力菌株FJAT91接種番茄植株12 h時誘導(dǎo)PR-1a表達量達到最高值，隨后降低。Milling等[22]研究發(fā)現(xiàn)，番茄感病品種接種GMI1000和GMI1000 ΔepsB突變株后，GMI1000誘導(dǎo)番茄植株SA、JA和ET途徑的防御基因的相對表達量均高于GMI1000 ΔepsB突變菌株。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，強致病力菌株FJAT91誘導(dǎo)SA途徑的防御基因PR-1a表達量顯著高于無致病力菌株FJAT1458。然而，Chen等[23]報道，青枯菌phcA基因突變的弱毒株誘導(dǎo)番茄gluA和PR-1a基因表達量顯著高于野生型強致力菌株，究其原因可能與菌株來源及番茄品種有關(guān)，不同抗性的番茄品種對同一病原菌的誘導(dǎo)抗性存在差異[22]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，接種初期，強致病力菌株FJAT91誘導(dǎo)番茄gluA、loxA和PR-1b顯著高于無致病力菌株FJAT1458，而接種后期則相反，如PR-1b基因在接種前12 h，其表達量在FJAT91處理組顯著高于FJAT1458處理組，而接種36 h后，PR-1b基因在FJAT91處理組的表達量顯著低于FJAT1458處理組，可能正是由于強致病力菌株接種后期番茄植株這些防御基因表達量降低，最終導(dǎo)致植株發(fā)病死亡。接種后期（36 h之后），無致病力菌株FJAT1458誘導(dǎo)番茄植株防御基因（PR-1a和Osm除外）表達量均顯著大于強致病力菌株和對照處理，表明，接種無致病力菌株能夠激發(fā)番茄植株防御基因表達，從而誘導(dǎo)植株免疫抗病反應(yīng)。

Ciardi等[24]和Block等[11]報道無致病力野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris pv vesicatoria）比致病的野油菜黃單胞菌對番茄系統(tǒng)抗性的誘導(dǎo)更快、更強。本研究結(jié)果與之相反，青枯菌強致病力菌株FJAT91誘導(dǎo)番茄抗性反應(yīng)更為強烈，在不同的信號途徑中，F(xiàn)JAT91菌株誘導(dǎo)番茄植株抗性基因的最大表達量均大于無致病力菌株FJAT1458，特別是ET途徑中的PR-1b基因，感染初期（3-12 h）的表達量是FJAT1458處理組的30.53-165.35倍，說明番茄寄主抗性反應(yīng)的強弱與病原菌致病力強弱呈正相關(guān)。本研究中GluA、PR-1a、pin2、loxA、PR-1b和Osm這些防御基因只是SA、JA和ET信號途徑防御調(diào)節(jié)基因中的一部分，今后應(yīng)在這3條信號途徑中其他重要防御基因在時間和空間表達量變化開展進一步的研究。

綜上，青枯菌的強、弱菌株均能誘導(dǎo)番茄植株中SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的gluA和PR-1a基因、JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的loxA和pin2基因及ET信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的Osm和PR-1a基因表達，從而激活番茄植株系統(tǒng)防御反應(yīng)。總體來看，強致病力菌株誘導(dǎo)番茄防御基因表達量變化幅度大于無致病力菌株誘導(dǎo)的番茄植株防御基因表達量變化，但在侵染后期（36 h之后），多數(shù)基因在無致病力菌株中的誘導(dǎo)表達量比強致病力菌株高。