謝佩芳,李 慧,馬欽海,李洪梅,李 芳,邵榆嵐,方 越,沈智麗,李蓉濤,楊子峰,趙金存,董書維,楊洪軍,夏雪山

(1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650500；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,北京 100700；3.廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 廣東 510120)

冠狀病毒(coronavirus,CoVs)是一種單鏈RNA病毒,可感染人和多種脊椎動(dòng)物。已知可感染人類的7種冠狀病毒中,嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS-CoV)、中東呼吸綜合征(MERS-CoV)和新型冠狀(SARS-CoV-2)病毒因其高傳染性、高致病性對(duì)社會(huì)公眾健康造成了重大威脅[1]。與此同時(shí),引起成人普通感冒的HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63 和 HCoV-HKU1這4種普通冠狀病毒在兒童、老年人或免疫抑制人群中易造成嚴(yán)重呼吸道感染[2-3]。對(duì)于冠狀病毒感染,現(xiàn)有臨床治療主要采用對(duì)癥和支持療法,尚缺乏特異性藥物。此外,因冠狀病毒具有高頻率同源/異源重組和基因組靈活性等特點(diǎn),使其具有較強(qiáng)的人群感染適應(yīng)能力和逃逸藥物選擇壓力的能力[4]。為應(yīng)對(duì)常見流行冠狀病毒危害、尤其新發(fā)冠狀病毒的大流行,亟需篩選具有抗多種冠狀病毒感染作用的廣譜藥物。

在冠狀病毒感染過程中,刺突蛋白(spike protein,S)與細(xì)胞表面受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)結(jié)合,導(dǎo)致病毒吸附并進(jìn)入細(xì)胞[5]。病毒侵入后，可激活機(jī)體免疫系統(tǒng),引起MCP-1、IL-10和IP-10等免疫介質(zhì)大量產(chǎn)生,加劇免疫反應(yīng),導(dǎo)致組織損傷、水腫,還容易引發(fā)二次感染,嚴(yán)重威脅患者健康[6]。因此,尋找限制病毒復(fù)制和抑制過度促炎反應(yīng)的藥物,對(duì)于減緩冠狀病毒感染造成的機(jī)體損傷具有重要價(jià)值。

本研究所選肺脾氣虛方(以下簡稱4-1)為國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》試行第四和第五版推薦處方,主要用于治療脾肺氣虛的恢復(fù)期患者,但是其治療機(jī)理尚不清楚。本研究擬在體外水平確定4-1對(duì)新冠病毒和普通冠狀病毒的抗病毒作用,并從多個(gè)炎癥因子表達(dá)層面探討其抗炎效果和抗病毒作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞和病毒 人直腸癌HRT-18細(xì)胞系(ATCC CCL-244)、恒河猴腎上皮細(xì)胞系LLC-MK2 (ATCC CCL7)、非洲綠猴腎上皮細(xì)胞系Vero E6 (ATCC CRL-1586)和人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系Huh-7 (ATCC)由本實(shí)驗(yàn)室保存。HCoV-OC43 (VR-1558)、HCoV-229E、HCoV-NL63毒株由廣州醫(yī)科大學(xué)趙金存教授提供,SARS-CoV-2 (Genebank accession no.MT123290.1)由廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床分離。

1.1.2藥物 連花清瘟原料藥粉(Lianhuaqingwen powder,LH)由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供,鹽酸阿比朵爾片(arbidol hydrochloride tablets,ARB)(0.1 g/片)購自中海石油歐益制藥有限公司,瑞德西韋(remdesivir,RDV)由廣州醫(yī)科大學(xué)楊子峰教授提供。新冠肺脾氣虛方(4-1)飲片由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供,該處方包含法半夏9 g、陳皮10 g、黨參15 g、炙黃芪30 g、茯苓15 g、藿香10 g以及砂仁6 g,煎煮方法如下：取上述藥材,除砂仁外加8倍量水(加水量按總處方計(jì)算)浸泡30 min后加熱煎煮,沸騰20 min,濾過,為一煎液；按砂仁重量取10倍一煎液,加入砂仁,單獨(dú)煎煮10 min,過濾,為砂仁煎煮液；將砂仁煎煮液與法半夏等藥渣混合,再加入8倍水,煎煮20 min,過濾,濾液與一煎液混合后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮,濃縮液以1 000 r·min-1常溫離心10 min,用0.45 μm濾膜過濾,得到4-1水煎劑。每毫升4-1煎劑相當(dāng)于0.874 g生藥。

1.1.3主要試劑和儀器 色譜純試劑甲醇和乙腈(Thermo Fisher,美國)；RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)(Gibco,美國)；MTT噻唑蘭和二甲基亞砜(DMSO)試劑(GBCBIO,中國)；RNAiso Plus (TRIzol)、RR064A One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit、RR036A PrimeScript RT Master Mix、RR390A Premix Ex Taq (Probe qPCR)、SYBR Premix Ex TapTMⅡ (TaKaRa,日本);E.Z.N.A.viral RNA extraction 162 R6874-02(Omega Bio-Tek,美國)；PCR引物(上海生工生物科技有限公司)；pEASY-T1載體 (北京全式金生物技術(shù))；pTRIPLEscript載體(Ambion,美國)；6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS (Agilent,美國)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI,瑞士)；酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Thermo Fisher公司的Multiskan GO)；ABI檢測系統(tǒng)(ABI PRISM?7500 Real-time PCR system,Applied Biosystems Co,USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1藥物準(zhǔn)備 LH、ARB、RDV分別用DMSO配制成濃度為300和100 g·L-1、100 mmol·L-1的儲(chǔ)存液。上述藥物儲(chǔ)存液及4-1水煎劑于4 ℃保存待用。

1.2.2處方煎劑LC-MS分析 將4-1中藥復(fù)方及其配伍藥材分別粉碎,95%乙醇冷浸提取3次(每次24 h)。合并3次提取液,減壓濃縮除去乙醇,得到醇提物。取少量溶于甲醇,過濾后進(jìn)行LC-MS分析。篩選在4-1復(fù)方和配伍藥材中具有相同保留時(shí)間(tR)和質(zhì)荷比(m/z)的分子離子峰(或準(zhǔn)分子離子峰),通過與配伍藥材的化學(xué)成分進(jìn)行比較以及文獻(xiàn)查閱,確定離子峰可能的化學(xué)組成。

1.2.3細(xì)胞和病毒培養(yǎng) 人直腸癌HRT-18細(xì)胞系于RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。恒河猴腎上皮細(xì)胞系LLC-MK2、非洲綠猴腎上皮細(xì)胞系Vero E6和人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系Huh-7于添加10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HCoV-OC43 (VR-1558)、HCoV-229E、HCoV-NL63和SARS-CoV-2病毒分別在HRT-18、Huh-7、LLC-MK2、Vero E6細(xì)胞中培養(yǎng)。以上病毒均儲(chǔ)存于-80 ℃。用Reed-Muench法計(jì)算組織半數(shù)感染量(TCID50)。

1.2.5CPE法檢測抗病毒藥效 以PBS洗滌96孔板中預(yù)先鋪好的單層細(xì)胞,每孔加入100 μL 100TCID50的病毒稀釋液,在34 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h,棄去病毒液,加入特定濃度的藥物,每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。HCoV-229E和SARS-CoV-2孵育3 d,HCoV-OC43 (VR-1558)孵育5 d(d 3補(bǔ)液100 μL/孔)。根據(jù)CPE分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄各處理所對(duì)應(yīng)的CPE情況：“+”為25%的細(xì)胞出現(xiàn)病變；“”為50%細(xì)胞出現(xiàn)病變；“”為75%的細(xì)胞出現(xiàn)病變；“”為>75%的細(xì)胞出現(xiàn)病變。用Prism non-regression analysis計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度(IC50),計(jì)算選擇指數(shù)(SI)=CC50/IC50。

1.2.6藥物體外抑制病毒增殖與RT-PCR法病毒載量檢測 用感染復(fù)數(shù)(MOI)為1的HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和SARS-CoV-2分別感染Huh7、HRT-18、LLC-MK2和Vero-E6細(xì)胞,吸附2 h后去上清,PBS洗滌2次,隨后分別加入特定藥物濃度的培養(yǎng)基,藥物濃度為：Huh7細(xì)胞,4-1為10、5、2.5 g·L-1,LH為500 mg·L-1,ARB為4 mg·L-1；HRT-18細(xì)胞,4-1為20、10、5 g·L-1,LH為600 mg·L-1,ARB為6 mg·L-1；LLC-MK2細(xì)胞,4-1為 20、10、5、2.5 g·L-1,LH為400 mg·L-1,ARB為2 mg·L-1；Vero E6細(xì)胞,4-1為10、5、2.5 g·L-1,LH為400 mg·L-1,ARB為2 mg·L-1,RDV為5 μmol·L-1；放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。分別孵育48、72 h (229E),72、96、120 h (OC43),120、168 h (NL63)及48 h (SARS-CoV-2 )后收集上清。用E.Z.N.A.病毒RNA提取試劑盒提取上清液中病毒RNA,按照RR064A試劑說明測定上清中病毒載量。分別擴(kuò)增HCoV-OC43、HCoV-229E和HCoV-NL63核蛋白(n)基因并插入到pEASY-T1載體中,擴(kuò)增SARS-CoV-2 RdRp/Helicase基因插入到pTRIPLEscript載體中,利用所得重組質(zhì)粒制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,用于計(jì)算各冠狀病毒載量[7]。引物序列見Tab 1。

1.2.7qRT-PCR檢測藥物對(duì)SARS-CoV-2所致細(xì)胞ACE2、病毒S蛋白、IL-1α和CCL-5/RANTES mRNA表達(dá)水平的影響 SARS-CoV-2病毒吸附2 h后,去上清,加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱孵育48 h后去上清,用RNAiso Plus試劑盒提取細(xì)胞總RNA,按照RR036A說明將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；以GAPDH為內(nèi)參基因,利用SYBR Premix Ex TapTMⅡ進(jìn)行qRT-PCR檢測,以2-ΔΔCt方法計(jì)算。PCR檢測系統(tǒng)為ABI檢測系統(tǒng)。

1.2.8qRT-PCR檢測藥物對(duì)OC43和229E感染細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)水平的影響 OC43和229E病毒吸附2 h后,去上清,加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱分別孵育48 h (229E)和96 h (OC43)后去上清,細(xì)胞總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄方法同1.2.7；以GAPDH為內(nèi)參基因,根據(jù)RR390A說明進(jìn)行qRT-PCR檢測促炎因子mRNA表達(dá)水平,以2-ΔΔCt方法計(jì)算。引物序列見Tab 1。

Tab 1 The primer sequences for quantitative measurement of HCoVs genes and cytokines/chemokines

續(xù)Tab 1

2 結(jié)果

2.1 4-1化學(xué)成分分析LC-MS分析表明,從4-1中藥粉劑和7個(gè)配伍飲片的醇提物鑒定了94個(gè)化合物,包括17個(gè)黃酮、14個(gè)甾體、13個(gè)倍半萜、13個(gè)脂肪酸及其脂類、8個(gè)酚類、5個(gè)三萜以及24個(gè)其他類型化合物。來源于半夏的化學(xué)成分有15種,涉及不飽和脂肪酸及其酯、生物堿和低聚糖等；來源于廣藿香的化合物共16種,以愈創(chuàng)木烷型倍半萜為主,以及一定量的廣藿香油；來源于茯苓的化合物有17種,主要包括倍半萜、三萜及甾體化合物；來源于炙黃芪的化學(xué)成分共10種,涉及甾體及其苷、異黃酮及其苷,以及三萜皂苷；來源于黨參的化學(xué)成分有22種,主要是炔苷、苯丙素、生物堿和芳香族化合物；來源于砂仁的化學(xué)成分有8種,涉及黃酮苷、甾體、單萜和芳香族化合物；來自陳皮的化合物有10種,包括9個(gè)黃酮及1個(gè)檸檬苦素類化合物 (Fig 1,Tab 2)。

Tab 2 Retention time and ion flow information of LC-ESI+-MS in ethanol extraction group of TCM compound 4-1

續(xù)Tab 2

續(xù)Tab 2

Fig 1 Results of LC-MS analysis of TCM 4-1 in alcohol extraction group

Tab 3 Antiviral activity of n=3)

2.2 4-1可在核酸水平抑制SARS-CoV-2體外增殖,降低SARS-CoV-2誘導(dǎo)的IL-1α 和CCL-5/RANTES近期研究表明，LH、ARB和RDV可以抑制SARS-CoV-2的復(fù)制[8-9]。本研究以這3種藥物為對(duì)照藥物,檢測4-1對(duì)SARS-CoV-2的抑制作用。在SARS-CoV-2感染的Vero-E6細(xì)胞中,4-1 CC50為(141.75±1.40)g·L-1,IC50為(6.80±0.11)g·L-1,選擇指數(shù)(SI,CC50/IC50)>2,說明該藥物對(duì)SARS-CoV-2低毒高效(Tab 3)。進(jìn)一步通過RT-PCR檢測4-1對(duì)病毒核酸的抑制作用,在感染48 h時(shí),4-1能較好抑制上清中病毒mRNA表達(dá),且呈濃度依賴關(guān)系(Fig 2A)。4-1在10 g·L-1濃度下對(duì)對(duì)病毒復(fù)制抑制效果優(yōu)于ARB (2 mg·L-1)、LH (400 mg·L-1)及RDV(5 μmol·L-1),差異具有顯著性(P<0.01)。IL-1α和CCL-5/RANTES是重要的促炎因子和趨化因子,本研究結(jié)果顯示,4-1能顯著降低SARS-CoV-2誘導(dǎo)的IL-1α和CCL-5/RANTES,且高濃度10 g·L-1降低CCL-5/RANTES效果優(yōu)于ARB(2 mg·L-1)和LH (400 mg·L-1)(Fig 2B)。

2.3 4-1抑制細(xì)胞ACE2受體和SARS-CoV-2病毒S蛋白mRNA表達(dá)如Fig 3所示,SARS-CoV-2感染Vero-E6細(xì)胞后,4-1持續(xù)作用48 h,在10、5和2.5 g·L-1濃度下均能降低細(xì)胞ACE2及病毒S蛋白mRNA表達(dá)水平；與ARB(2 mg·L-1)、LH(400 mg·L-1)及RDV(5 μmol·L-1)相比,中、高濃度4-1對(duì)病毒S蛋白 mRNA表達(dá)抑制效果更好(P<0.05)。

2.4 4-1對(duì)普通冠狀病毒體外增殖抑制作用

2.4.14-1具備抗病毒活性 為了明確4-1是否對(duì)不同株系冠狀病毒發(fā)揮抗病毒作用,本研究進(jìn)一步檢測該藥物對(duì)3種普通冠狀病毒的抑制效果。4-1對(duì)HRT-18、Huh7和LC-MK23種細(xì)胞的細(xì)胞毒性見Tab 3。通過CPE法檢測發(fā)現(xiàn)4-1對(duì)HCoV-OC43和HCoV-229E的IC50值分別為(13.57±0.71)和(7.04±0.30)g·L-1。HCoV-NL63感染LLC-MK2細(xì)胞5 d后,通過qRT-PCR檢測上清中病毒載量,其IC50為(2.64±0.14)g·L-1。如Tab 3所示,4-1對(duì)3種普通冠狀病毒SI值均大于2,說明該藥物具備抗3種冠狀病毒活性。

Fig 2 The inhibitory rate of viral mRNA expression in supernatant and mRNA levels of intracellular pro-inflammatory cytokines after treated with n=3)

Fig 3 The mRNA levels of host ACE2 and viral S protein in SARS-CoV-2-infected cells after treated with

2.4.24-1可降低三種冠狀病毒在細(xì)胞上清中的病毒載量,提高病毒增殖抑制率 3種冠狀病毒分別吸附相應(yīng)細(xì)胞2 h后,對(duì)藥物持續(xù)作用不同時(shí)間內(nèi)上清中的病毒載量進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,4-1對(duì)3種病毒的抑制作用均呈濃度依賴性。在HCoV-OC43感染HRT-18細(xì)胞中,高濃度藥物 (30、20 g·L-1在72和120 h時(shí)抑制率均高于50%,且4-1 (30 g·L-1)持續(xù)治療120 h時(shí),其抑制率明顯高于LH(600 mg·L-1)(P<0.01)；相比濃度為6 mg·L-1的ARB,4-1在30、20 和10 g·L-1濃度下抑制效果更好(P<0.01)(Fig 4A)。對(duì)于HCoV-229E感染Huh7細(xì)胞,4-1 (20 g·L-1)持續(xù)作用72 h時(shí),其抑制率顯著高于ARB(4 mg·L-1),且不同濃度的抑制效果均優(yōu)于LH(500 mg·L-1)(Fig 4B)。在HCoV-NL63感染LLC-MK2細(xì)胞中,高濃度4-1(20 g·L-1)持續(xù)作用120和168 h時(shí),其抑制效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而低濃度(2.5 g·L-1)藥物抑制效果在120 h時(shí)優(yōu)于168 h(P<0.01)。藥物持續(xù)作用120 h時(shí),4-1(20 g·L-1)抑制率優(yōu)于ARB(2 mg·L-1)和LH (400 mg·L-1)(Fig 4C)。上述結(jié)果表明,4-1通過抑制上清中病毒載量從而發(fā)揮對(duì)多株系冠狀病毒的廣譜抗病毒作用。

2.5 4-1抑制普通冠狀病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞因子/趨化因子表達(dá)以過度促炎介質(zhì)的產(chǎn)生或免疫細(xì)胞募集為特征的異常免疫反應(yīng)可加速疾病的發(fā)病過程。因此,我們進(jìn)一步檢測4-1對(duì)229E及OC43感染細(xì)胞中炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,HCoV-OC43感染96 h和HCoV-229E感染48 h均導(dǎo)致IL-6、CXCL-8/IL-8、CXCL-10/IP-10、TNF-α、IFN-α、CCL-2/MCP-1、CXCL-9/MIG和CCL-5/RANTES的mRNA水平顯著升高,而4-1可降低上述基因mRNA表達(dá)水平,該藥物作用呈濃度依賴性(P<0.01)(Fig 5A,5B)。與對(duì)照藥物相比,在HCoV-OC43感染細(xì)胞中,ARB (6 mg·L-1)對(duì)CXCL-8/IL-8、IL-6、CXCL-10/IP-10、TNF-α的作用優(yōu)于中低劑量的4-1 (Fig 5A)；在HCoV-229E感染細(xì)胞中,除CXCL-9/MIG外,不同劑量4-1以及LH (500 mg·L-1)對(duì)各炎癥因子表達(dá)水平的抑制作用均優(yōu)于ARB (4 mg·L-1)(Fig 5B)。這些結(jié)果表明,4-1對(duì)多株系冠狀病毒感染誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)具有緩解作用。

3 討論

肺脾氣虛方主要用于改善新冠患者恢復(fù)期癥狀,包括惡心乏力、倦怠、痞滿,大便粘稠、舌苔白膩等。與一定劑量的LH和ARB相比,4-1對(duì)病毒復(fù)制抑制的效果更好,抑制作用可持續(xù)至感染后期。廣藿香具有抗病毒抗炎作用,調(diào)節(jié)免疫,止咳、平喘、止嘔,其有效成分廣藿香油能有效抑制病毒復(fù)制[10]；來源于炙黃芪的苷類化合物能抑制流感病毒H1N1、合胞病毒RSV及登革病毒的增殖[11-12]。4-1配伍中含有廣藿香油,苷類等化合物,這也許是其能普遍抑制多種病毒增殖,且對(duì)不同病毒的感染后期也有一定的抑制效果的原因之一。

Fig 4 The inhibitory rate of common coronaviruses mRNA expression in supernatant after drug n=3)

Fig 5 Expression of pro-inflammatory cytokines after treated with n=3)

病毒粒子的遷移由S蛋白主導(dǎo)。S蛋白識(shí)別受體,吸附并進(jìn)入宿主細(xì)胞。這種S蛋白-受體的相互作用支配著病毒的組織趨向性[5-6]。4-1一方面通過抑制SARS-CoV-2的復(fù)制從而降低S蛋白的表達(dá),另一方面一定程度上干擾了宿主細(xì)胞受體ACE2的合成,從而減少病毒的遷移和吸附。

冠狀病毒侵入宿主細(xì)胞后可促發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng),并導(dǎo)致炎癥因子風(fēng)暴的產(chǎn)生,從而加劇疾病進(jìn)程[13]。ARB (4 mg·L-1)對(duì)229E感染引起的炎癥因子表達(dá)上調(diào)作用有限,除 CXCL-9/MIG外該藥物不能顯著降低其余炎癥因子 mRNA表達(dá)水平。而4-1可普遍降低SARS-CoV-2、OC43和229E感染誘導(dǎo)的細(xì)胞因子/趨化因子mRNA表達(dá)水平。這可能與4-1含有多種抗炎成分有關(guān)。以往研究顯示,來源于廣藿香的倍半萜化合物能抑制脾細(xì)胞增殖[14]；黃芪活性成分如黃芪甲苷等能誘導(dǎo)T細(xì)胞激活、增強(qiáng)CD45磷酸酶活性、抑制促炎細(xì)胞因子上調(diào)等,參與免疫調(diào)節(jié)[15]；此外黨參補(bǔ)脾肺氣,改善機(jī)體免疫功能[16]。而LC-MS分析提示4-1中含以上抗炎成分,這些結(jié)果表明,新冠肺脾氣虛處方4-1對(duì)多種病毒具有潛在的抗炎作用。

綜上,本研究證明了該處方能有效抑制多種冠狀病毒的增殖及炎癥發(fā)生,且抗病毒效果可持續(xù)到感染后期。為臨床推薦恢復(fù)期用藥提供了一定的基礎(chǔ)證據(jù)。