夏 葉，李春華，孫瑩慧，朱永軍，繆德年*，辛永萍

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310009）

單核細(xì)胞增生李斯特菌（簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，Listeria monocytogenes，Lm），是一種嚴(yán)重危害健康的食源性人獸共患致病菌，可通過(guò)多種途徑傳播，引起人和動(dòng)物的感染，出現(xiàn)胃腸炎、腦膜炎、敗血癥和流產(chǎn)等癥狀，致死率可達(dá)20%～30%，與大腸桿菌O157、沙門(mén)菌以及空腸彎曲桿菌并稱世界4 大食源性病原菌，被WHO 列為必檢的食源性致病菌[1-3]。Lm 的致病性與其強(qiáng)大的抗應(yīng)激能力密不可分，該菌可在高滲透壓（10%～20%NaCl）、低溫高溫（0.4 ℃～45 ℃）以及寬泛的pH（pH2.5～pH9.0）條件中生長(zhǎng)，從而使其廣泛存在于自然界、食品加工及儲(chǔ)存環(huán)境中[4]。

細(xì)菌在遭遇應(yīng)激或環(huán)境變化時(shí)，會(huì)啟動(dòng)相應(yīng)的抗應(yīng)激機(jī)制來(lái)適應(yīng)環(huán)境并抵抗應(yīng)激。革蘭氏陽(yáng)性菌中，Sigma B（σB）作為最重要的應(yīng)激調(diào)控因子，直接或間接參與細(xì)菌的抗應(yīng)激過(guò)程[4-6]。σB首先在枯草芽胞桿菌中被發(fā)現(xiàn)[7]，而其活性也受到調(diào)控操縱子（Rsbs）的精密調(diào)控[8]。該調(diào)控操縱子由7 個(gè)基因組成：rsbR、rsbS、rsbT、rsbU、rsbV、rsbW和rsbX，sigB位于rsbW之后、rsbX之前。σB操縱子上游的rsbR、rsbS和rsbT 編碼的蛋白構(gòu)成應(yīng)激復(fù)合體RsbRRsbS-RsbT，穩(wěn)定整個(gè)抗應(yīng)激系統(tǒng)。RsbS 作為復(fù)合體中的骨架蛋白，其磷酸化/非磷酸化狀態(tài)在σB抗應(yīng)激激活過(guò)程中至關(guān)重要[9]。枯草芽胞桿菌和Lm 中的RsbS 較保守，二者同源性高達(dá)74.1%，但其在Lm中發(fā)揮的抗應(yīng)激機(jī)制尚無(wú)報(bào)道。本研究通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得重組RsbS 蛋白并純化后，免疫BALB/c 小鼠，制備RsbS 多克隆抗體，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其理化特性和潛在磷酸化位點(diǎn)，進(jìn)行蛋白互作篩選，并通過(guò)Lm 野生株10403S 和缺失株ΔrsbR分析RsbS 參與的抗應(yīng)激機(jī)制，以期為研究RsbS 蛋白的生物學(xué)功能及其在Lm 抗應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物L(fēng)m 野生型菌株10403S、缺失株ΔrsbR[10]、大腸桿菌DH5α 和Rosetta（DE3）、原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a、RsbR 蛋白[10]、RsbX蛋白及10403S 全菌蛋白[11]均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；酵母浸膏、胰蛋白胨、卡那霉素（工作濃度為50 μg/mL）、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、DNA 連接酶、BCA 蛋白定量試劑盒和HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（IgG-HRP）購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；2×PCR Mix、高保真酶2×phanta Max Master Mix、DNA 膠回收試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、RNA 抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及SYBR Green 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA Marker 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶和蛋白Marker 購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；核酸電泳染料Goldview 購(gòu)自上海賽百盛基因技術(shù)有限公司；His-Ni 純化柱購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

6 周齡～8 周齡BALB/c 小鼠（18 g～22 g，雌性）購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心。

1.2 RsbS 蛋白的理化特性分析通過(guò)ExPAsy 服務(wù)器（https://web.Expasy.org/protparam/）分析RsbS 蛋白的理化性質(zhì)。利用NetPhos 3.1 服務(wù)器（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測(cè)RsbS 蛋白潛在的磷酸化位點(diǎn)。采用SWISS-MODEL 在線軟件預(yù)測(cè)RsbS 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3 rsbS基因的PCR 擴(kuò)增與重組RsbS 蛋白的表達(dá)根據(jù)Genbank 中登錄的Lm 10403S 株全基因組序列（CP002002.1），通過(guò)Vector NTI 軟件設(shè)計(jì)針對(duì)rsbS基因完整ORF 片段的引物并引入酶切位點(diǎn)，F(xiàn)：5'-CGGGATCCGTGGGGATACCAATCTTAAAGTTAG G（BamH I）-3'/R：5'-CGGTCGACTCATTCCCCCAATT CCTGTTTAAG（SacI）-3'，預(yù)期目的片段大小為373 bp。引物由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。采用熱裂解法提取Lm10403S 株的基因組DNA[12]并作為模板，PCR 擴(kuò)增rsbS基因。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃30 s； 95 ℃10 s， 55 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。rsbS基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BamH I 和SacI 雙酶切，回收后克隆于經(jīng)同樣酶切處理的pET-30a（+）中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR 檢驗(yàn)呈陽(yáng)性的樣品由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測(cè)序鑒定。將無(wú)氨基酸突變的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株Rosetta（DE3）中，經(jīng)PCR鑒定正確的重組表達(dá)菌命名為pET-30a-rsbS/Rosetta。

將重組表達(dá)菌pET-30a-rsbS/Rosetta 37 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600nm約0.5，加入終濃度為0.4 mmol/L 的IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)后，以8 000 r/min 離心10 min 收集菌體，超聲裂解后分別收集上清和沉淀（沉淀用含8 mol/L 尿素的PBS 充分溶解），通過(guò)SDSPAGE 檢測(cè)重組RsbS 蛋白表達(dá)情況，進(jìn)一步利用His-Ni 純化柱對(duì)重組RsbS 蛋白進(jìn)行純化，采用BCA方法測(cè)定蛋白濃度，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 蛋白互作的等溫滴定量熱分析根據(jù)GE 公司ITC200 微量等溫滴定量熱儀的操作指南，通過(guò)等溫滴定量熱試驗(yàn)進(jìn)行RsbS 蛋白與其上游蛋白R(shí)sbR 的互作試驗(yàn)。參照肖雨涵等的方法對(duì)1.3 中純化的重組蛋白進(jìn)行透析[13]，以減少溶劑中的雜質(zhì)在滴定過(guò)程中可能引起的熱效應(yīng)變化。滴定蛋白（RsbS）與被滴定蛋白（RsbR）濃度比為5∶1，RsbS 蛋白單次滴定體積10 μL，滴定速度2 s/μL，滴定間隔300 s，攪拌速度300 r/min，反應(yīng)溫度25 ℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用NanoAnalyze 軟件進(jìn)行independent 和blank（constant）擬合，通過(guò)計(jì)算結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）、親和力常數(shù)（Ka）、熔變（ΔH）、熵變（ΔS）等熱力學(xué)參數(shù)來(lái)判斷蛋白間的互作關(guān)系。

1.5 RsbS 多克隆抗體的制備及鑒定將純化的重組RsbS 蛋白作為抗原，與弗氏完全佐劑等體積混合，采用注射推拉法充分乳化至油包水狀態(tài)，于小鼠脊椎兩側(cè)經(jīng)皮下多點(diǎn)注射。免疫前經(jīng)尾靜脈采血作為陰性對(duì)照，每10 d 免疫一次。初免抗原量為200 μg/只，二免、三免和四免抗原量均為100 μg/只。四免后一周眼眶采集血，分離血清后，3 000 r/min 離心20 min，收集上清即為RsbS 多克隆抗體。將純化的重組RsbS 蛋白以每孔3 μg 的量包被于96 孔聚乙烯酶標(biāo)板，以2 倍倍比稀釋的RsbS 多抗（1∶500～1∶256 000）作為一抗，羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）作為二抗，采用間接ELISA 測(cè)定抗體效價(jià)。當(dāng)OD450nm值＞0.2，且P/N≥2.1 時(shí)的最大抗體稀釋倍數(shù)即為其效價(jià)。參照文獻(xiàn)中western blot 方法鑒定RsbS 多抗的反應(yīng)原性[11]。即以RsbX 蛋白和空載體pET-30a/Rosetta裂解液作為陰性對(duì)照，檢測(cè)制備的RsbS 多克隆抗體能否與Lm10403S 全菌蛋白中的RsbS 蛋白特異性結(jié)合。鑒定正確后的多克隆抗體用于后續(xù)研究RsbS 參與細(xì)菌抗應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)制。

1.6 應(yīng)激狀態(tài)下Lm 野生菌株與缺失菌株rsbS基因轉(zhuǎn)錄水平的分析將培養(yǎng)至OD600nm約0.6 的Lm 野生株10403S 和缺失株ΔrsbR分別用BHI 液體培養(yǎng)基（pH7.4）和含5% NaCl 的BHI 應(yīng)激培養(yǎng)基于37 ℃震蕩培養(yǎng)30 min 后，離心收集菌體。根據(jù)說(shuō)明書(shū)抽提全菌RNA 并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，參照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法[11]，利用qPCR 分別檢測(cè)野生株和缺失株中rsbS（F：5'-AAACGTCGGCCAGAGGAGTA-3'/R：5'-CTTT TGCACCCATTAGTTTAGACAT-3'）在應(yīng)激/非應(yīng)激狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄水平。以gyrB（F：5'-AGACGCTATTGA TGCCGATGA-3'/R：5'-GTATTGCGCGTTGTCTTCGA-3'）作為內(nèi)參[11]，以BHI 液體培養(yǎng)的非應(yīng)激組作為對(duì)照組，利用2-ΔΔCT法分析rsbS基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.7 應(yīng)激狀態(tài)下Lm 野生菌株與缺失菌株RsbS 蛋白表達(dá)量分析將培養(yǎng)至OD600nm約0.6 的Lm 野生株10403S 和缺失株ΔrsbR分別用BHI 液體培養(yǎng)基和含5% NaCl 的BHI 應(yīng)激培養(yǎng)基于37 ℃震蕩培養(yǎng)30 min后，離心收集菌體，超聲裂解收獲全菌蛋白。利用western blot 鑒定野生株和缺失株中RsbS 蛋白在應(yīng)激/非應(yīng)激狀態(tài)下的表達(dá)量差異，以RsbS 多克隆抗體作為一抗（1∶500），羊抗鼠IgG-HRP 作為二抗（1∶5 000），GAPDH 作為內(nèi)參蛋白，利用Quantity One 軟件進(jìn)行定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 RsbS 蛋白的理化特性分析經(jīng)ExPAsy 服務(wù)器分析顯示，Lm RsbS 蛋白分子式為C565H938N136O175S4，含有118 個(gè)氨基酸，亮氨酸含量最高為13.6%，異亮氨酸含量次之為12.7%，不含天冬氨酸、色氨酸和酪氨酸。RsbS 蛋白帶正電荷殘基8 個(gè)，負(fù)電荷殘基18 個(gè)，等電點(diǎn)為4.38。RsbS 蛋白在體外的理論半衰期為100 h，不穩(wěn)定系數(shù)為32.55，表明該蛋白較為穩(wěn)定。RsbS 蛋白的平均親水指數(shù)（GRAVY）為0.625，預(yù)測(cè)其在胞外的可能性較高，表明該蛋白具有較高親水性。NetPhos 3.1 服務(wù)器分析顯示，RsbS蛋白共有8 個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，分別為S18、T24、S40、S56、S69、T88、S101 和S107，提示該蛋白可能易被磷酸化。經(jīng)SWISS-MODEL 在線軟件同源建模的方法預(yù)測(cè)RsbS 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖1）。RsbS 蛋白序列與SWISS-MODEL 中作為模板的序列枯草芽孢桿菌RsbS 蛋白的一致性高達(dá)73.28%，GMQE值0.77，QMEAN 值-0.51，表明預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)可靠性高，基本可代表RsbS 蛋白的真實(shí)狀態(tài)，提示Lm RsbS蛋白可能與枯草芽胞桿菌RsbS 蛋白一樣參與細(xì)菌的應(yīng)激調(diào)控。

圖1 Lm RsbS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Protein tertiary structure prediction of Listeria monocytogenes RsbS

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒及重組RsbS 蛋白表達(dá)的鑒定結(jié)果以構(gòu)建的重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增rsbS基因，目的條帶與預(yù)期373 bp 大小相符（圖2），表明重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-rsbS正確構(gòu)建。測(cè)序鑒定結(jié)果顯示擴(kuò)增的rsbS基因未發(fā)生突變。

圖2 重組質(zhì)粒pET-30a-rsbS的PCR鑒定結(jié)果Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid pET-30a-rsbS

重組表達(dá)菌pET-30a-rsbS/Rosetta 經(jīng)0.4 mmol/L的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)3 h 后，收集裂解菌體的上清和沉淀經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè)。結(jié)果顯示，重組菌的上清和沉淀中均在18.8 ku 處出現(xiàn)目的條帶，與重組RsbS蛋白預(yù)期大小一致，而空載體菌對(duì)照樣品未出現(xiàn)相應(yīng)條帶；重組RsbS 蛋白在上清和沉淀中均有表達(dá)，上清中的蛋白量略高于沉淀中的蛋白；利用His-Ni純化柱對(duì)重組RsbS 蛋白進(jìn)行親和層析純化，SDSPAGE結(jié)果顯示蛋白純化效果較好（圖3）。BCA方法檢測(cè)純化蛋白濃度約1 μg/mL。結(jié)果表明，獲得的重組RsbS蛋白具有良好的純度和濃度，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 重組RsbS蛋白表達(dá)及純化的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE identification of expression and purification of recombinant RsbS protein

2.3 蛋白互作的等溫滴定量熱分析蛋白質(zhì)間發(fā)生生化反應(yīng)均會(huì)有一定程度的熱量改變，等溫滴定量熱法是近年發(fā)展起來(lái)的用于研究生物分子間相互作用的重要技術(shù)，可靈敏的捕捉反應(yīng)體系中的熱量變化，通過(guò)監(jiān)測(cè)體系中的熱量變化確定蛋白間是否發(fā)生相互作用。利用NanoAnalyze 軟件繪制RsbS 與RsbR蛋白互作的等溫滴定量熱曲線并計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)。圖4 上半部分顯示了RsbS 蛋白每次滴入RsbR 蛋白溶液中，反應(yīng)體系所吸收的熱量值，將上半部分圖中每個(gè)峰的峰面積積分值對(duì)RsbS 與RsbR 的摩爾比作圖（所有數(shù)據(jù)均已扣除背景滴定），即得出圖4 下半部分的擬合曲線。圖4 結(jié)果顯示，每10 μL RsbS 蛋白滴定入RsbR蛋白，體系均發(fā)生了1.67 μW～3.35 μW的能量變化，對(duì)應(yīng)產(chǎn)生的摩爾熱量約為1 100 kJ/mol～2 206 kJ/mol，表明RsbS 與RsbR 蛋白間發(fā)生了反應(yīng)，導(dǎo)致體系產(chǎn)生了熱量變化。利用NanoAnalyze軟件計(jì)算得到RsbS 與RsbR 蛋白互作的熱力學(xué)參數(shù)為：結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n=3.43、親和力常數(shù)Ka 為1.48×1012L/mol、ΔH1.16×103kJ/mol、ΔS4.13 kJ/mol/K。根據(jù)蛋白互作的熱力學(xué)規(guī)律可初步判斷[14]：RsbS 與RsbR 間的互作為吸熱反應(yīng)，兩個(gè)蛋白間存在至少3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，ΔS＞0 且ΔH＞0 表明該兩個(gè)蛋白間的互作是由疏水力作用主導(dǎo)，提示RsbS 與RsbR 蛋白在體外存在互作。

圖4 RsbS與RsbR互作的等溫滴定量熱曲線Fig.4 Isothermal titration calorimetry curve of RsbS-RsbR binding

2.4 RsbS 多克隆抗體效價(jià)和反應(yīng)原性鑒定結(jié)果將純化的重組RsbS 蛋白經(jīng)4 次免疫小鼠后，收獲血清，間接ELISA 測(cè)定RsbS 多克隆抗體效價(jià)約1∶128 000（圖5A）。經(jīng)western blot 檢驗(yàn)該多克隆抗體的反應(yīng)原性，結(jié)果顯示，Lm10403S 全菌蛋白在18.8 ku 處出現(xiàn)特異性條帶，陰性對(duì)照RsbX 蛋白及空載體菌pET-30a/Rosetta 裂解液均未見(jiàn)反應(yīng)條帶（圖5B）。表明獲得的RsbS 多克隆抗體具有良好的反應(yīng)原性，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖5 RsbS多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定（A）及western blot（B）檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Titer(A)and western blot(B)detection of RsbS polyclonal antibody

2.5 rsbS在應(yīng)激條件下的轉(zhuǎn)錄水平分析利用qPCR檢測(cè)Lm 野生株和缺失株在NaCl 應(yīng)激條件下rsbS基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，5%NaCl 應(yīng)激30 min 后，野生株10403S 中rsbS基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增高，約為未應(yīng)激對(duì)照組的2.10 倍（P＜0.01）；而缺失株ΔrsbR中rsbS基因的轉(zhuǎn)錄水平降低，約為對(duì)照組的61%（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖6）。可見(jiàn)5% NaCl 應(yīng)激會(huì)刺激LmrsbS基因的轉(zhuǎn)錄水平增高，提示該基因可能具有抗?jié)B透壓應(yīng)激的功能；但缺失株ΔrsbR中rsbS基因在5% NaCl 應(yīng)激條件下的轉(zhuǎn)錄水平降低，提示rsbS基因的抗?jié)B透壓應(yīng)激功能可能受rsbR基因的調(diào)控。表明rsbS基因通過(guò)rsbR基因的介導(dǎo)而參與抗應(yīng)激反應(yīng)。

圖6 Lm 10403S和ΔrsbR中rsbS基因在NaCl應(yīng)激和未應(yīng)激（pH7.4）條件下的轉(zhuǎn)錄水平差異Fig.6 Transcription difference of Listeria monocytogenes 10403S and ΔrsbR rsbS gene under NaCl stress or unstress(pH7.4)condition

2.6 RsbS 在應(yīng)激條件下的表達(dá)量分析利用本研究制備的RsbS 多克隆抗體經(jīng)western blot 檢測(cè)Lm 野生株和缺失株在NaCl 應(yīng)激條件下RsbS 蛋白的表達(dá)量。結(jié)果顯示，5% NaCl 應(yīng)激30 min 后，野生株10403S中RsbS 蛋白的表達(dá)量增高，約為對(duì)照組的1.53 倍（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖7A、7B）；缺失株ΔrsbR中RsbS 蛋白的表達(dá)量降低，約為對(duì)照組的51%（P＜0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖7C、7D）?？梢?jiàn)5%NaCl 應(yīng)激會(huì)刺激Lm RsbS 蛋白的表達(dá)量增高，提示RsbS 蛋白可能參與Lm 抗?jié)B透壓應(yīng)激的過(guò)程；但rsbR缺失的情況下，RsbS 蛋白在5% NaCl 應(yīng)激條件下的表達(dá)量降低，提示RsbS 的抗?jié)B透壓應(yīng)激作用可能需要RsbR 蛋白的協(xié)同參與。進(jìn)一步驗(yàn)證RsbS 通過(guò)與RsbR蛋白互作參與抗應(yīng)激反應(yīng)。

圖7 Lm 10403S（A、B）和ΔrsbR（C、D）中RsbS蛋白在NaCl應(yīng)激和未應(yīng)激（pH7.4）條件下的表達(dá)量差異Fig.7 Expression difference of Listeria monocytogenes 10403S(A,B)or ΔrsbR(C,D)RsbS protein under NaCl stress or unstress(pH7.4)condition

3 討 論

Lm 擁有強(qiáng)大的抗應(yīng)激能力，σB作為該菌最重要的應(yīng)激調(diào)控因子，其活性受到7 個(gè)調(diào)控操縱子（Rsbs）的精密調(diào)控。其中，RsbS 作為整條應(yīng)激調(diào)控通路中的開(kāi)關(guān)蛋白，其生物學(xué)功能及其在抗應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮的作用具有重要的研究?jī)r(jià)值。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)RsbS 蛋白的理化特性、三級(jí)結(jié)構(gòu)和磷酸化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其與SWISSMODEL 中的模板序列枯草芽孢桿菌RsbS 蛋白的一致性高達(dá)73.28%，提示Lm RsbS 蛋白可能與枯草芽胞桿菌RsbS 蛋白擁有類(lèi)似的應(yīng)激調(diào)控功能[15]。本研究利用等溫滴定量熱技術(shù)對(duì)與RsbS 的互作蛋白進(jìn)行了篩選和鑒定，發(fā)現(xiàn)Lm RsbS 與RsbR 蛋白存在互作反應(yīng)，且兩個(gè)蛋白間至少存在3 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。該結(jié)果與Reeves 等利用酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證的枯草芽胞桿菌RsbR-RsbS應(yīng)激復(fù)合體相類(lèi)似[16]，與Dessaux等提出的滲透壓應(yīng)激中Lm可能瞬時(shí)存在RsbR-RsbS-RsbT復(fù)合體的假設(shè)相一致[6]?；蛟趹?yīng)激狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平通常與其抗應(yīng)激功能密切相關(guān)。進(jìn)一步利用qPCR 和western blot 技術(shù)，分別對(duì)Lm 野生株和ΔrsbR缺失株在NaCl 應(yīng)激條件下rsbS的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平進(jìn)行分析：檢測(cè)到NaCl 應(yīng)激條件下，Lm 野生株中rsbS的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平增高，表明RsbS 蛋白通過(guò)提高表達(dá)量正向參與了Lm 的抗?jié)B透壓應(yīng)激過(guò)程，本研究首次對(duì)Lm 應(yīng)激狀態(tài)下的rsbS水平進(jìn)行了分析，所得結(jié)果與枯草芽胞桿菌RsbS 為應(yīng)激正調(diào)控因子的結(jié)論一致[17]；而缺失株ΔrsbR在NaCl 應(yīng)激條件下rsbS的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平均降低，提示RsbS 蛋白可能通過(guò)RsbR 的介導(dǎo)參與Lm 的抗?jié)B透壓應(yīng)激過(guò)程，該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了RsbR-RsbS 蛋白互作的結(jié)論，即在RsbR 缺失的情況下，RsbS 的應(yīng)激應(yīng)答水平降低，提示RsbS 的抗應(yīng)激功能需在RsbR 的協(xié)同作用下才能發(fā)揮?？莶菅堪麠U菌RsbR-RsbS 應(yīng)激體協(xié)同作用從而激發(fā)細(xì)菌應(yīng)激應(yīng)答的觀點(diǎn)已被多次驗(yàn)證[15-19]，然而在Lm 中RsbR-RsbS 應(yīng)激體的研究仍處于起步階段。綜上，推測(cè)RsbS 蛋白調(diào)控Lm 的抗應(yīng)激過(guò)程是一個(gè)較為復(fù)雜的多元調(diào)控方式，可能涉及到多個(gè)蛋白的互作和應(yīng)激應(yīng)答，且生物信息學(xué)預(yù)測(cè)RsbS 蛋白具有8 個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)，因此RsbS 是如何與互作蛋白協(xié)同作用從而直接或間接影響Lm 的應(yīng)激應(yīng)答，以及影響互作的關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn)有哪些？還需要進(jìn)一步研究。

本研究獲得了Lm 重組RsbS 蛋白及其多克隆抗體，首次驗(yàn)證了其RsbS 與RsbR 蛋白的體外互作，分析了rsbS在NaCl 應(yīng)激條件下的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，為探明Lm RsbS 蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，為闡明RsbS 在應(yīng)激調(diào)控中發(fā)揮的作用及Lm 的抗應(yīng)激調(diào)控機(jī)制提供了重要基礎(chǔ)和研究工具。