李榮榮，李蘇楠，Iqbal Ahmad，鄭永輝

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-美國(guó)密歇根州立大學(xué)天然免疫聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

天然免疫是機(jī)體對(duì)抗外來微生物感染的第一道防線，宿主細(xì)胞抵御病毒侵入而產(chǎn)生的抗病毒分子又稱宿主限制性因子[1]。絲氨酸整合因子5（Serine incorporator 5，Ser5）是近來發(fā)現(xiàn)的宿主限制因子，將其通過未知機(jī)制插入人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）粒子中并抑制病毒將其侵入下一個(gè)靶細(xì)胞，而HIV-1 編碼的Nef 蛋白能拮抗Ser5 的抗病毒活性[2]。研究發(fā)現(xiàn)HIV-1 Nef蛋白能將Ser5 內(nèi)化至細(xì)胞漿中并通過溶酶體途徑降解Ser5，進(jìn)而阻止Ser5 進(jìn)入新生病毒粒子中[3]。除了HIV-1 Nef 蛋白之外，鼠白血病病毒（Murine leukemia virus，MLV）的附屬蛋白glycoGag以及馬傳染性貧血病毒（Equine infectious anemia virus，EIAV）的附屬蛋白S2 也能通過相似的機(jī)制拮抗Ser5 對(duì)HIV-1 感染的限制作用[4]。然而，不同HIV-1病毒株編碼的Nef蛋白拮抗Ser5的能力和具體機(jī)制不盡相同。

馬傳染性貧血（Equine infectious anemia，EIA）是新中國(guó)成立以來嚴(yán)重危害養(yǎng)馬業(yè)的重要傳染病之一，EIA 的病原EIAV 是一種復(fù)雜的逆轉(zhuǎn)錄病毒，能夠編碼多種附屬蛋白調(diào)控病毒的復(fù)制[5]。S2 是EIAV特有的附屬蛋白，S2 的缺失會(huì)顯著降低病毒在體內(nèi)的復(fù)制水平和致病力[6]。美國(guó)Wyoming 強(qiáng)毒株是一種對(duì)馬屬動(dòng)物高度致死的EIAV，EIAVpv 是Wyoming 株體外培養(yǎng)的適應(yīng)株，對(duì)馬屬動(dòng)物具有感染性，但無致病性[7]。pSPEIAV19（No. GU385359.1）（命名為EIAV）是在EIAVpv 株感染的馬腎源細(xì)胞中獲得的非致病感染性克隆株，有研究發(fā)現(xiàn)高致病性EIAV Wyoming株或者致病性EIAVpv 變異株的3'端替換pSPEIAV19對(duì)應(yīng)的位置，可恢復(fù)該感染性克隆株的致病性[8]。這些研究結(jié)果提示影響病毒毒力的區(qū)域可能位于病毒基因組的3'端（包括env 和LTR）[9]。通過對(duì)非致病感染性克隆株EIAV 研究發(fā)現(xiàn)其長(zhǎng)期體外傳代后喪失了毒力，從而制備了中國(guó)EIAV 弱毒疫苗株（No. U01866.1）（命名為EIAVHRBS2），已證明其可有效控制EIA 的流行[10]。王雪峰等人對(duì)EIAV 弱毒疫苗親本株EIAVLN40感染馬后連續(xù)分離病毒并測(cè)序發(fā)現(xiàn)，EIAV 基因組在馬體內(nèi)的進(jìn)化過程中高度變異，呈現(xiàn)明顯的正選擇壓力[11]。作為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象，EIAV 和EIAVHRBS2在核苷酸和推導(dǎo)氨基酸水平上，S2的差異分別為2.5%～4.1%和6.4%～10.6%，具有3 個(gè)共有氨基酸取代位點(diǎn)（T41I、T51I、Q55K），說明EIAVHRBS2株S2 中的3 個(gè)共有突變殘基對(duì)該病毒相關(guān)毒力蛋白的功能至關(guān)重要[12]。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)EIAVS2編碼的S2 蛋白（命名為S2 蛋白）通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制內(nèi)化細(xì)胞膜表面的Ser5，并在核內(nèi)體的幫助下將Ser5 轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體后降解，進(jìn)而拮抗Ser5 的抗病毒活性[13]。然而，EIAVHRBS2編碼的S2 蛋白（命名為HRB-S2 蛋白）是否也能拮抗Ser5 的抗病毒活性？二者在機(jī)制上是否有區(qū)別？目前還不清楚?；诖耍狙芯繉⒅攸c(diǎn)探究HRB-S2 蛋白如何拮抗Ser5 的抗病毒活性，試圖揭示不同EIAV 編碼的S2 蛋白拮抗Ser5 的機(jī)制差異，以期對(duì)抗HIV-1 藥物的開發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料人胚胎腎細(xì)胞293T、人宮頸癌細(xì)胞Hela 和TZM-bl 細(xì)胞（HIV-1 感染后表達(dá)熒光素酶，其活性高低與HIV-1 感染性呈正相關(guān)）均由本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pBJ5-iFLAG-Ser5、pCMV6-Ser5-FLAG、pEGFP-Ser5、pcDNA3.1-Ser5-VN-HA、pcDNA3.1-Ser5-FLAG-VC、pcDNA3.1-S2-HA、pcDNA3.1-glycoMA-HA、pcDNA3.1-Nef-HA、pcDNA3.1-S2-VN-HA、pcDNA3.1-S2-FLAG-VC、pcDNA3.1-AP-μ1-V5-VC、pcDNA3.1-AP-2α-V5-VC、pcDNA3.1-AP-2σ-V5-VC、DsRed-Rab7 和DsRed-Rab11 以及沉默質(zhì)粒shAP-2σ、shRab7 和shRab11 均由本實(shí)驗(yàn)室前期制備并保存[14]；HIV-1 野生型（HIV-1 WT）、HIV-1 Nef 缺失型（HIV-1 ΔNef）及HIV-1 Env 質(zhì)粒均由Kenzo Tokunaga 惠贈(zèng)；本實(shí)驗(yàn)室前期將密碼子優(yōu)化后的HRB S2 基因分別克隆至相應(yīng)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HRB-S2-HA、pcDNA3.1-HRB-S2-VN-HA 和pcDNA3.1-HRB-S2-FLAG-VC 并保存；另外本實(shí)驗(yàn)室前期分別對(duì)pcDNA3.1-HRB-S2-HA 和pcDNA3.1-HRB-S2-VN-HA 質(zhì)粒中的HRB-S2 進(jìn)行點(diǎn)突變，獲得了G2A、E22A 和L26A 突變體質(zhì)粒并保存?zhèn)溆?；RIPA 裂解液、 ERAD 通路抑制劑DBeQ、自噬通路抑制劑Wortmannin、泛素蛋白酶體通路抑制劑MG132、溶酶體通路抑制劑Bafilomycin A1、鼠源HA 抗體和鼠源FLAG 抗體均購自Sigma 公司；NH4Cl 由本實(shí)驗(yàn)室配制；聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染試劑（Polyethylenimin，PEI）購自Polyscience 公司；Lipofectamine?3000（Lip3000）轉(zhuǎn)染試劑、antiHA-HRP 和Monoclonal ANTI-FLAG（R）M2-Peroxidase（HRP）antibody（antiFLAG-HRP）均購自Thermo 公司；antiActin-HRP 購自武漢三鷹公司；兔源V5 抗體、Alexa-Fluor-647 標(biāo)記的羊抗鼠IgG、Alexa-Fluor-488 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 均購自Invitrogen 公司；兔源Rab7 和Rab11 抗體購自Cell Signaling Technology。

1.2 HRB-S2 對(duì)Ser5 抗病毒活性影響的檢測(cè)利用PEI轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染HIV-1 WT（1 μg）+HIV-1 Env（0.5 μg）和HIV-1 ΔNef（1 μg）+ HIV-1 Env（0.5 μg）的質(zhì)粒于293T 細(xì)胞中，用于包裝HIV-1、HIV-1 ΔNef兩組偽病毒，同時(shí)分別于上述兩組細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）、pcDNA3.1-S2-HA（3 μg）、pcDNA3.1-glycoMA-HA（3 μg）、pcDNA3.1-Nef-HA（3 μg）和pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）質(zhì)粒，其中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-glycoMA-HA 和pcDNA3.1-Nef-HA 組作為本實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h 后收集含HIV-1、HIV-1 ΔNef 兩組偽病毒上清，通過ELISA 方法對(duì)病毒粒子含量進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)取HIV-1、HIV-1 ΔNef兩組偽病毒上清分別感染TZM-bl 細(xì)胞，感染48 h 后使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)TZM-bl 細(xì)胞熒光素酶活性（即luc 值），計(jì)算Luc/ELISA 的比值得到HIV-1 偽病毒的相對(duì)感染性，以檢測(cè)HRB-S2 對(duì)Ser5 抗病毒活性的影響。

1.3 HRB-S2 對(duì)Ser5 表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位影響的檢測(cè)使用PEI 轉(zhuǎn)染試劑將pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-S2-HA（3 μg）、pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-glycoMA-HA（3 μg）、pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-Nef-HA（3 μg）、pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白，分別以antiActin-HRP（1∶20 000）、antiHA-HRP（1∶2 000）和anti-FLAG-HRP（1∶20 000）為抗體進(jìn)行孵育，通過western blot 檢測(cè)Ser5、S2、Nef、glycoMA 和HRB-S2 蛋白的表達(dá)，其中檢測(cè)Nef、glycoMA 作為陽性對(duì)照，分析HRB-S2 蛋白對(duì)Ser5 的降解情況。為了檢測(cè)HRB-S2 和Ser5 在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，利用Lip3000將pEGFP-Ser5（1 μg）和pEGFP-Ser5（1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）分別轉(zhuǎn)染Hela 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后以Anti-HA（1∶1 000）為一抗，Alexa-Fluor-647 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶500）為二抗，經(jīng)DAPI 染核，利用高分辨率活細(xì)胞共聚焦顯微鏡觀察具有綠色熒光活性的Ser5 蛋白和具有紅色熒光活性的HRB-S2 蛋白的定位情況。

1.4 HRB-S2 降解Ser5 蛋白關(guān)鍵位點(diǎn)的檢測(cè)利用PEI 轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）、pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-G2A-HA（3 μg）、pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-E22AHA（3 μg）和pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-L26A-HA（3 μg）分別轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，24 h后用預(yù)冷的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白，按照1.3 中western blot 方法檢測(cè)Ser5 和HRB-S2 及其突變體蛋白表達(dá)情況，確定HRB-S2 降解Ser5 蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)可以將Venus 蛋白（具有綠色熒光活性）分成兩部分， 分別為N 端和C 端，N 端為aa2～aa173 區(qū)域（VN）， C 端為aa154～aa238區(qū)域（VC），當(dāng)單獨(dú)存在VN 或者VC 時(shí)，熒光分子沒有綠光；當(dāng)VN 和VC 同時(shí)存在并足夠靠近時(shí)，熒光分子活性恢復(fù)發(fā)出綠色熒光（圖3A）[15]。本研究根據(jù)該原理進(jìn)行雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（BimolecuLar Fluores- cence Complementation，BiFC）：使用Lip3000將質(zhì)粒pcDNA3.1-Ser5-FLAG-VC（1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-VN-HA（3 μg）、pcDNA3.1-Ser5-FLAG-VC（1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-G2A-HA（3 μg）、pcDNA3.1- Ser5- FLAG- VC（1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-E22A-HA（3 μg）和pcDNA3.1-Ser5-FLAG-VC（1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-L26A-HA（3 μg）分別轉(zhuǎn)染Hela 細(xì)胞24 h 后，按照1.3 中方法檢測(cè)Ser5 蛋白和HRB-S2及其突變體蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布和共定位情況。

1.5 受體介導(dǎo)的內(nèi)吞對(duì)HRB-S2 降解Ser5 影響的檢測(cè)使用PEI 轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）分別與APμ1-V5-VC（1 μg）、AP-2α-V5-VC（1 μg）和AP-2σ-V5-VC（1 μg）共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞24 h 后，用預(yù)冷的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白，按照1.3 方法通過western blot 檢測(cè)Ser5 和HRB-S2、AP-μ1、AP-2α、AP-2σ 蛋白的表達(dá)，評(píng)估AP-μ1、AP-2α、AP-2σ 蛋白對(duì)HRB-S2 降解Ser5 的影響。使用PEI轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）+shAP-2σ（4 μg）轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，其中沉默質(zhì)粒shAP-2σ 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能夠特異性降解AP-2σ 的mRNA 導(dǎo)致AP-2σ 基因表達(dá)沉默，24 h 后用預(yù)冷的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞蛋白，按照1.3 中western blot 方法檢測(cè)Ser5、HRB-S2和Actin 蛋白的表達(dá)，評(píng)估shAP-2σ 沉默AP-2σ 后對(duì)HRB-S2 降解Ser5 的影響。利用Lip3000 將質(zhì)粒pBJ5-iFLAG-Ser5（2 μg）和pBJ5-iFLAG-Ser5（2 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）分別轉(zhuǎn)染兩組Hela 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后兩組細(xì)胞用Anti-FLAG（1∶1 000）4 ℃孵育30 mins，接著將一組樣品在37 ℃孵育1 h使Ser5 發(fā)生內(nèi)吞，另一組在4 ℃孵育1 h 阻止內(nèi)吞，以Anti-FLAG（1∶2 000）為一抗，其余抗體種類及濃度按照1.3 中激光共聚焦試驗(yàn)進(jìn)行，觀察具有綠色熒光活性Ser5 蛋白的定位情況，以檢測(cè)在受體作用下HRB-S2 對(duì)Ser5 降解的影響。

1.6 Rab7 和Rab11 對(duì)HRB-S2 降解Ser5 影響的檢測(cè)使用PEI 轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）分別與DsRed-Rab7（3 μg）和DsRed-Rab11（3 μg）共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后用預(yù)冷的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白，按照1.3 中western blot 方法檢測(cè)Ser5、HRB-S2、Rab7、Rab11 和Actin 蛋白的表達(dá)情況，確定Rab7 和Rab11 對(duì)HRB-S2 降解Ser5 的影響。使用PEI 轉(zhuǎn)染試劑將pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）分別與shRab7（4 μg）和shRAb11（4 μg）共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞24 h 后用預(yù)冷的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞蛋白，分別以Anti-Rab7，Anti-Rab11（1∶5 000）為一抗，其余抗體種類及濃度參照1.3 中western blot 方法，檢測(cè)Ser5 和Actin 蛋白的表達(dá)，評(píng)估沉默Rab7 和RAb11 表達(dá)后對(duì)HRBS2 降解Ser5 的影響。

1.7 不同EIAV編碼的S2蛋白對(duì)Ser5蛋白降解影響的檢測(cè)分別利用Lip3000和PEI轉(zhuǎn)染試劑將Ser5-FLAGVC（1 μg）+Ser5-VN-HA（1 μg）、S2-FLAG-VC（1 μg）+S2-VN-HA（1 μg）和HRB-S2-FLAG-VC（1 μg）+HRBS2-VN-HA（1 μg）分別共轉(zhuǎn)染Hela 細(xì)胞和293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后對(duì)Hela 細(xì)胞按照1.3 方法處理樣品，通過激光共聚焦觀察綠色熒光（S2-FLAG-VC+S2-VN-HA 和HRB-S2-FLAG-VC+HRB-S2-VN-HA形成二聚體的情況）和紅色熒光（S2 和HRB-S2 蛋白）共定位的情況；轉(zhuǎn)染24 h 后對(duì)收集293T 細(xì)胞并固定，封閉，以Anti-FLAG（1∶1 000）為一抗，Alexa-Fluor-488 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶500）為二抗，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度（MFI）以確定S2和HRB-S2 蛋白形成二聚體的情況。為了進(jìn)一步確定HRB-S2 降解Ser5 蛋白的降解途徑，使用PEI轉(zhuǎn)染試劑分別將質(zhì)粒pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-HRB-S2-HA（3 μg）、pCMV6-Ser5-FLAG（0.1 μg）+pcDNA3.1-S2-HA（3 μg）共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h 換液，12 h 后分別加入DBeQ（15 μmol/L）、Wortmannin（100 nmol/L）、MG132（10 μmol/L）、NH4Cl（20 μmol/L）和Bafilomycin A1（100 nmol/L）蛋白降解通路抑制劑繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后用預(yù)冷的RIPA裂解液裂解細(xì)胞后提取細(xì)胞蛋白，按照1.3中western blot方法檢測(cè)Ser5、HRB-S2 和Actin 蛋白表達(dá)情況，確定HRBS2降解Ser5蛋白的降解途徑。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本研究使用SPSS 軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)雙尾t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果以±s表示。*：P＜0.05，表示差異顯著；**：P＜0.01，***：P＜0.001表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 HRB-S2 對(duì)Ser5 抗病毒活性影響的檢測(cè)結(jié)果利用HIV-1 WT和HIV-1 ΔNef質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝兩種偽病毒，同時(shí)過表達(dá)Ser5、glycoMA、Nef、S2、HRB-S2 蛋白，通過ELISA 檢測(cè)病毒上清中兩組偽病毒粒子的含量，同時(shí)將含兩組偽病毒上清感染TZM-bl靶細(xì)胞獲得熒光素酶的活性值（Luc值），計(jì)算Luc/ELISA的比值得到HIV-1 WT和HIV-1 ΔNef兩組偽病毒的相對(duì)感染性，以評(píng)估HRB-S2 對(duì)Ser5 抗病毒活性的影響。結(jié)果顯示HIV-1 WT 和HIV-1 ΔNef 在無Ser5時(shí)，HIV-1 WT感染性大于HIV-1 ΔNef；在過表達(dá)Ser5蛋白時(shí)，Ser5能夠抑制HIV-1的感染性，尤其是在Nef缺失的情況下抑制HIV-1的感染性更顯著；而Nef、glycoMA、S2 和HRB-S2 均能極顯著拮抗Ser5 的抗病毒活性（P＜0.001），其中S2 拮抗Ser5 的能力比HRB-S2更強(qiáng)（圖1）。表明HRB-S2能夠拮抗Ser5的抗病毒活性。

圖1 HRB-S2對(duì)Ser5抗病毒活性的影響Fig.1 The effect of HRB-S2 on the antiviral activity of Ser5

2.2 HRB-S2 對(duì)Ser5 表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位影響的檢測(cè)結(jié)果將pCMV6-Ser5-FLAG 和pcDNA3.1-HRBS2-HA 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，通過western blot 檢測(cè)Ser5 蛋白的表達(dá)，評(píng)估HRB-S2 對(duì)Ser5 降解的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Nef、glycoMA、S2、HRBS2 均能顯著降解Ser5 蛋白表達(dá)，其中HRB-S2 和Nef降解Ser5 的能力比S2 和glycoMA 弱（圖2A）。利用Lip3000 將pEGFP-Ser5 和pcDNA3.1-HRB-S2-VN-HA分別單獨(dú)和共轉(zhuǎn)染Hela 細(xì)胞，激光共聚焦觀察可見，單獨(dú)轉(zhuǎn)染pEGFP-Ser5 組，Ser5 在細(xì)胞膜表面有綠色熒光，表明Ser5 分布于細(xì)胞膜；共轉(zhuǎn)染pEGFPSer5+HRB-S2-HA 組，Ser5 和HRB-S2 在細(xì)胞漿內(nèi)存在綠色和紅色熒光的共定位情況，表明HRB-S2 能夠?qū)er5 從細(xì)胞膜表面轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞漿（圖2B）。以上結(jié)果表明HRB-S2 下調(diào)細(xì)胞膜表面Ser5 的表達(dá)。

圖2 HRB-S2對(duì)Ser5表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位的影響Fig.2 The effect of HRB-S2 on Ser5 degradation and cellular localization

2.3 HRB-S2降解Ser5蛋白關(guān)鍵位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果將質(zhì)粒pCMV6-Ser5-FLAG 與pcDNA3.1-HRB-S2-HA 及其G2A、E22A 和L26A 突變體共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞， western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，HRB-S2-WT 能夠顯著降解Ser5 蛋白，這與2.2 結(jié)果一致；而HRB-S2 L26A 降解Ser5 蛋白的能力減弱，表明L26是降解Ser5 蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)（圖3B）；同時(shí)利用激光共聚焦檢測(cè)HRB-S2及突變體蛋白與Ser5 在細(xì)胞內(nèi)定位情況，結(jié)果顯示HRB-S2 與Ser5 在細(xì)胞漿存在共定位，而HRB-S2 L26A 和Ser5在細(xì)胞膜有共定位（圖3C），表明L26A不能下調(diào)細(xì)胞膜表面的Ser5。以上結(jié)果表明L26是HRB-S2轉(zhuǎn)運(yùn)降解Ser5 蛋白的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。

圖3 HRB-S2降解Ser5蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)的檢測(cè)Fig.3 Detection of the key site of HRB-S2 degradation of Ser5

2.4 受體介導(dǎo)的內(nèi)吞對(duì)HRB-S2 降解Ser5 影響的檢測(cè)結(jié)果將質(zhì)粒pCMV6-Ser5-FLAG+pcDNA3.1-HRB-S2-HA 分別與pcDNA3.1-AP-μ1-V5-VC、pcDNA3.1-AP-2α-V5-VC 和pcDNA3.1-AP-2σ-V5-VC 共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過western blot檢測(cè)Ser5蛋白的表達(dá)水平，以確定AP-μ1、AP-2α、AP-2σ蛋白對(duì)HRB-S2降解Ser5 的影響。結(jié)果顯示，僅AP-2σ 能顯著促進(jìn)HRB-S2 對(duì)Ser5 的降解（圖4A、4B）；將質(zhì)粒pCMV6-Ser5-FLAG+pcDNA3.1-HRB-S2-HA+shAP-2σ 共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，通過western blot 檢測(cè)Ser5 蛋白的表達(dá)水平，確定shAP-2σ沉默AP-2σ 后對(duì)HRB-S2 降解Ser5的影響，結(jié)果顯示利用shRNA 沉默AP-2σ 表達(dá)后，HRB-S2 不能降解Ser5 蛋白的表達(dá)（圖4C），表明AP-2σ 參與HRB-S2 對(duì)Ser5 的降解過程。在溫度依賴的內(nèi)吞試驗(yàn)中，已知在4 ℃條件下細(xì)胞代謝停止，細(xì)胞內(nèi)吞活動(dòng)被抑制。通過激光共聚焦觀察可見，與4 ℃相比，在37 ℃時(shí)HRB-S2 顯著促進(jìn)Ser5的內(nèi)吞（圖4D）。這些結(jié)果表明HRB-S2 通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制內(nèi)化Ser5 蛋白。

圖4 受體介導(dǎo)的內(nèi)吞對(duì)HRB-S2降解Ser5的影響Fig.4 The effect of receptor-mediated endocytosis on HRB-S2 degradation of Ser5

2.5 Rab7 和Rab11 對(duì)HRB-S2 降解Ser5 影響的檢測(cè)結(jié)果過表達(dá)Ser5、HRB-S2 和Rab7、Rab11 蛋白后通過western blot 檢測(cè)在HRB-S2、Rab7、Rab11 作用下Ser5 的蛋白表達(dá)，以確定Rab7 和Rab11 對(duì)HRB-S2 降解Ser5 影響，結(jié)果顯示Rab7 和Rab11 存在條件下，HRB-S2 降解Ser5 的能力增強(qiáng)（圖5A），表明Rab7 和Rab11 能促進(jìn)HRB-S2 降解Ser5；另外過表達(dá)Ser5、HRB-S2 和shRab7、shRab11 質(zhì)粒，通過western blot 檢測(cè)Ser5 蛋白的表達(dá)，確定沉默Rab7 和RAb11 蛋白對(duì)HRB-S2 降解Ser5 影響，結(jié)果顯示沉默Rab7 和Rab11 后HRB-S2 降解Ser5 能力明顯減弱（圖5B）。以上結(jié)果表明Rab7和Rab11參與HRB-S2 降解Ser5 的過程。

圖5 Rab7和Rab11對(duì)HRB-S2降解Ser5影響的western blot檢測(cè)Fig.5 The effect of Rab7 and Rab11 degradation of Ser5 in the presence of HRB-S2

2.6 不同EIAV 編碼的S2 蛋白對(duì)Ser5 降解影響的檢測(cè)結(jié)果利用BiFC 技術(shù)，將Ser5-FLAG-VC+Ser5-VN-HA、S2-FLAG-VC+S2-VN-HA 和HRB-S2-FLAGVC+HRB-S2-VN-HA 分別共轉(zhuǎn)染Hela 細(xì)胞和293T 細(xì)胞，通過激光共聚焦觀察Hela 細(xì)胞組綠色熒光，結(jié)果顯示HRB-S2 和Ser5 均存在二聚體，而S2 不會(huì)形成二聚體（圖6A）；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)293T 細(xì)胞組，結(jié)果顯示HRB-S2 的平均綠色熒光強(qiáng)度（MFI）明顯高于S2，表明HRB-S2 存在二聚體，而S2 不存在二聚體（圖6B）。在檢測(cè)HRB-S2 降解Ser5 蛋白的降解途徑試驗(yàn)中，過表達(dá)Ser5 和HRB-S2 蛋白12 h 后分別加入多種蛋白降解通路抑制劑阻止蛋白降解，通過western blot 檢測(cè)Ser5 蛋白的表達(dá)以確定HRB-S2降解Ser5 蛋白的降解途徑，結(jié)果顯示，NH4Cl 和Bafilomycin A1 顯著抑制HRB-S2 和S2 對(duì)Ser5 的降解作用（圖6C）；此外，MG132 顯著抑制HRB-S2 對(duì)Ser5的降解作用，并增加HRB-S2 的表達(dá)，而對(duì)S2 無影響（圖6C、6D），表明HRB-S2 通過蛋白酶體和溶酶體途徑降解Ser5。上述結(jié)果表明HRB-S2 蛋白能夠形成二聚體，并通過蛋白酶體和溶酶體途徑降解Ser5 蛋白。

圖6 不同EIAV編碼的S2蛋白對(duì)Ser5降解的影響的檢測(cè)Fig.6 The effect of different EIAV S2 on Ser5 degradation

3 討 論

Ser5 是新近發(fā)現(xiàn)的在不同物種間高度保守的宿主限制因子，能抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒HIV-1、鼠白血病病毒（MLV）、EIAV 的感染性，而病毒附屬蛋白Nef、gycoMA 和S2 能拮抗Ser5 的抗病毒活性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，EIAVHRBS2編碼的HRB-S2 蛋白也能拮抗Ser5 的抗病毒活性，并且HRB-S2 蛋白能顯著降低Ser5 的表達(dá)，但是HRB-S2 蛋白降解Ser5 的能力明顯比S2 弱。通過對(duì)HRB-S2 蛋白進(jìn)行點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)L26是其降解Ser5 的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，這與本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果一致[13]。通過比較不同病毒株的S2 蛋白發(fā)現(xiàn)，L26是比較保守，雖然來自不同病毒株的S2 蛋白序列存在差異，導(dǎo)致不同S2 蛋白的功能有所不同，但本研究證實(shí)該保守位點(diǎn)在S2 拮抗Ser5 抗病毒活性中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果證明Nef、glycoMA 和S2通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞內(nèi)化Ser5，并將Ser5 靶向到溶酶體進(jìn)行降解[13]。S2 具有一個(gè)功能性N 末端肉豆蔻酰化位點(diǎn)，S2 和Se5 之間的相互作用依賴于該豆蔻?；稽c(diǎn)，并可與質(zhì)膜結(jié)合，由此推測(cè)S2 和Se5 的相互作用發(fā)生在細(xì)胞膜上。研究表明S2 與質(zhì)膜上的Ser5 存在相互作用，并通過AP-2 介導(dǎo)的內(nèi)吞作用下調(diào)Ser5[16]。S2 將Ser5 重新定位到Rab5 早期、Rab7 晚期和Rab11 循環(huán)核內(nèi)體中[13]。本研究發(fā)現(xiàn)HRB-S2 蛋白也能通過AP-2σ 將Ser5 內(nèi)化至Rab7 和Rab11 內(nèi)體中。由此可以看出，盡管不同病毒附屬蛋白拮抗Ser5 的能力存在差異，但逆轉(zhuǎn)錄病毒如HIV-1、EIAV 和MLV 等已經(jīng)進(jìn)化出類似的機(jī)制來拮抗宿主Ser5 的病毒限制作用。

BiFC 試驗(yàn)結(jié)果表明HRB-S2 蛋白能形成二聚體。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明Nef 之間存在二聚體形式，而glycoMA 和S2 蛋白卻不能形成二聚體[4]。本研究通過western blot試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Nef和HRB-S2蛋白降解Ser5 的能力明顯比S2 蛋白和glycoMA 弱，結(jié)合相關(guān)研究推測(cè)病毒因子形成二聚體可能會(huì)影響其拮抗Ser5的能力[17]。本研究進(jìn)一步通過使用不同降解通路的特異性抑制劑研究發(fā)現(xiàn)，HRB-S2 蛋白不僅通過溶酶體途徑降解Ser5，還能通過蛋白酶體通路降解Ser5，然而與S2 相比，蛋白酶體通路的特異性抑制劑還能阻止HRB-S2 蛋白的降解。根據(jù)這些結(jié)果推測(cè)形成二聚體構(gòu)象的HRB-S2 蛋白本身可以通過蛋白酶體途徑降解，導(dǎo)致能與Ser5 結(jié)合的HRB-S2 蛋白減少，這可能是HRB-S2 蛋白拮抗Ser5 抗病毒活性能力比S2 蛋白弱的原因之一，但這一推論需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究結(jié)果顯示HRB-S2 通過AP-2 介導(dǎo)的內(nèi)吞將Ser5 從細(xì)胞膜表面轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞漿中，在Rab7 和Rab11 的參與下將Ser5 轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體和蛋白酶體進(jìn)行降解，從而拮抗Ser5 的抗病毒活性。在本實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)S2 和HRB-S2 蛋白均能通過降解宿主Ser5 蛋白而拮抗其抗病毒活性，然而S2 拮抗Ser5 的能力比HRB-S2 強(qiáng)，且HRB-S2存在二聚體化蛋白構(gòu)象，S2 則沒有。推測(cè)這可能是HRB-S2 拮抗Ser5 的能力比S2 弱的原因之一。本研究首次闡述了HRB-S2 蛋白拮抗Ser5 抗病毒活性能力及機(jī)制，為新型抗病毒藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。