何 龍，趙 琪，莊婷婷，朱詩蘭，陳曉雨，李國清

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

鉤蟲是一類寄生于人和犬、貓等動物腸道中的土源性線蟲，其感染性幼蟲可通過皮膚與口腔感染宿主，引發(fā)人畜共患的鉤蟲病[1]。該病是一種極易被忽視，但呈世界性流行的腸道寄生蟲病，在熱帶及亞熱帶經(jīng)濟(jì)落后地區(qū)的感染尤為嚴(yán)重，盡管該病的死亡率相對較低，但在一些貧窮落后的國家仍可造成健康隱患與嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。錫蘭鉤蟲（Ancylostoma ceylanicum）是一種能夠在人體內(nèi)發(fā)育為成蟲的動物源性鉤蟲，既可感染犬、貓也可感染人，研究表明，錫蘭鉤蟲已成為亞洲地區(qū)感染人的第二大鉤蟲，感染后可引起腹痛、腹瀉、營養(yǎng)不良和缺鐵性貧血等癥狀[4]。多項研究證實錫蘭鉤蟲已在中國、尼日利亞、柬埔寨等地的人和伴侶動物之間傳播，尤其是在犬貓中高度流行，使得人感染錫蘭鉤蟲的風(fēng)險顯著上升[5-6]。因此，研究控制該病的新方法已成為當(dāng)務(wù)之急。本研究室一直致力于錫蘭鉤蟲的分泌蛋白候選抗原的研究，前期已對谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、血小板抑制劑和天冬氨酸蛋白酶抑制劑進(jìn)行了克隆表達(dá)，并對其生物學(xué)功能進(jìn)行了探究[7-9]。

鞘脂激活蛋白樣蛋白（Saposin-like proteins，SLPs）又稱皂素樣蛋白，是由鞘脂激活蛋白原（Prosaposin）衍生的一類蛋白家族，具有改變細(xì)胞膜通透性及裂解紅細(xì)胞等的作用。該蛋白廣泛分布于各種原生動物及哺乳動物體內(nèi)，目前已發(fā)現(xiàn)235 個家族成員，它們具有溶血、抗菌等多種生物學(xué)功能[10]。Don 等在犬鉤蟲（Ancylostoma caninum）中克隆表達(dá)了一種可以致紅細(xì)胞破裂的蛋白，通過與肝片吸蟲（Fasciola hepatica）FhSAP 基因序列的比對，證實其屬于SLPs[11]。隨后Willis 等完成了對美洲鉤蟲（Necator americanus）和犬鉤蟲SLPs 晶體結(jié)構(gòu)的測定與功能分析[12]。但迄今未見對錫蘭鉤蟲SLPs 的報道。基于此，本研究克隆錫蘭鉤蟲Ace-SLP-1 基因，并對其編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；將該基因經(jīng)原核表達(dá)，對其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫學(xué)特性分析，為進(jìn)一步研究該蛋白的生物學(xué)功能及其作為鉤蟲疫苗候選分子的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 犬源錫蘭鉤蟲的獲得錫蘭鉤蟲三期幼蟲（L3幼蟲）采用離心管“T”型濾紙法從犬糞便中分離所得，成蟲通過L3 幼蟲人工感染金黃倉鼠而獲得；所有蟲體樣品均參照文獻(xiàn)[13]方法鑒定為錫蘭鉤蟲，置于RNA 樣品保存液中-20 ℃保存?zhèn)溆茫诲a蘭鉤蟲感染犬和健康犬均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院臨床外科教研室提供。

1.2 主要試劑pMD-19T 與pET-28a 克隆載體、BamH I、Hind III 均購自TaKaRa 公司；改良BCA 蛋白濃度測定試劑盒、CCK-8 試劑盒、兔抗犬IgGHRP、兔抗鼠IgG-HPR 和鼠His 標(biāo)簽單克隆抗體（MAb）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；E. coliDH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自廣州擎科生物科技有限公司；蛋白Marker 購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；MicroElute Total RNA Kit、MMLV First Strand cDNA Synthesis Kit 和Gel Extraction Kit D2500 均購自廣州歐米伽生物工程有限公司；His 標(biāo)簽純化試劑盒購自碧云天生物技術(shù)（上海）公司；外周血淋巴細(xì)胞分離試劑盒購自天津灝洋華科生物科技有限公司。

1.3 Ace-SLP-1 基因的PCR 擴(kuò)增與測序根據(jù)GenBank 中犬鉤蟲Ac-SLP-1 基因序列（DQ855414.1），設(shè)計特異性引物SLP-1-F：5'-ATGACTCGCTTGAT CTTCGTCGT-3'/SLP-1-R：5'-TCAACAAGCATGCA GAGTTGTGC-3'。采用Total RNA Kit 提取成蟲總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈作為模板，利用上述引物經(jīng)PCR 擴(kuò)增Ace-SLP-1 基因，反應(yīng)條件：94 ℃5 min；94 ℃30 s、56.5 ℃30 s、72 ℃80 s，共35個循環(huán)； 72 ℃8 min。采用BamHI、Hind III 分別雙酶切pMD19-T 和目的基因PCR 產(chǎn)物，經(jīng)T4 連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-Ace-SLP-1，并經(jīng)雙酶切鑒定，陽性克隆由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4 Ace-SLP-1 編碼蛋白的生物信息學(xué)及同源性分析根據(jù)Ace-SLP-1 基因測序結(jié)果推導(dǎo)其氨基酸序列，利用DNAMAN 軟件將其與11 種不同蟲種SLPs 的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對。利用在線軟件（https://web.expasy.org/protparam/）分析該蛋白的分子量大小、氨基酸組成、等電點（PI）等性質(zhì)；分別利用在線軟件SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、TMHMMServer2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和ProtScale（http://web. expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）對該蛋白的信號肽序列、跨膜結(jié)構(gòu)域與疏/親水性進(jìn)行分析；利用SWISS-MODEL預(yù)測軟件（http://swissmodel.expasy.org/）預(yù)測并構(gòu)建該蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型。

1.5 Ace-SLP-1 成熟肽基因（Ace-XL-SLP-1）重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其重組蛋白（rAce-XL-SLP-1）的表達(dá)、純化及鑒定根據(jù)1.4 的分析結(jié)果，選擇錫蘭鉤蟲Ace-XL-SLP-1 的成熟肽基因序列進(jìn)行蛋白表達(dá)：設(shè)計擴(kuò)增其成熟肽基因序列Ace-XL-SLP-1 的上下游引物XL-SLP-1-F：5'-AAGCTTTCAACAAGCAT GCAGAG-3'/XL-SLP-1-R：5'-GGATCCACTCCAGT AGTGATCAAC-3'。參照1.3 方法經(jīng)PCR 擴(kuò)增Ace-XL-SLP-1 基因，采用BamH I、Hind III 雙酶切質(zhì)粒pET-28a 和目的基因PCR 產(chǎn)物，并利用T4 連接酶連接，構(gòu)建錫蘭鉤蟲Ace-XL-SLP-1 成熟肽重組質(zhì)粒pET28a-Ace-XL-SLP-1 并經(jīng)雙酶切鑒定，陽性克隆由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將pET28a-Ace-XL-SLP-1 轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coliBL21（DE3），37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)至OD600nm值為0.6 時，加入1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)6 h～8 h，4 ℃離心收集菌體，超聲破碎后分別取上清和沉淀經(jīng)SDS-PAGE電泳，分析重組蛋白的表達(dá)。將離心收集的包涵體置于8 mol/L尿素緩沖液中溶解過夜，離心收集上清，用0.22 μm濾膜過濾后，上樣于Ni-NTA親和層析柱，分別用10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L、80 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、500 mmol/L 的咪唑緩沖液洗脫，收集洗脫液及純化后的蛋白，以鼠His 標(biāo)簽MAb（1∶3 000）為一抗，兔抗鼠HRP-IgG（1∶20 000）為二抗，同時以誘導(dǎo)的pET-28a/BL21（DE3）菌液與鼠His 標(biāo)簽MAb 孵育后作為陰性對照。經(jīng)western blot 進(jìn)一步分析rAce-XL-SLP-1 的純化效果。

1.6 rAce-XL-SLP-1 的反應(yīng)原性分析分別從錫蘭鉤蟲感染犬和健康犬經(jīng)前肢靜脈無菌采血，分離血清。對純化的rAce-XL-SLP-1 分別以感染犬血清（1∶4 000）和健康犬血清（1∶4 000）為一抗，兔抗犬IgG-HRP（1∶20 000）為二抗，通過western blot 分析rAce-XL-SLP-1 的反應(yīng)原性。

1.7 rAce-XL-SLP-1 對犬外周血淋巴細(xì)胞（PBMC）增殖影響的檢測從前肢靜脈無菌采集健康犬EDTA抗凝血5 mL，采用外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒分離健康犬PBMC，用臺盼藍(lán)染色計算活細(xì)胞數(shù)量，活細(xì)胞比率大于95%即可用于后續(xù)試驗。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL PBMC懸液，再加入Ace-XL-SLP-1重組蛋白至終濃度分別為0、10 μg/mL、20 μg/mL、和40 μg/mL，同時設(shè)置ConA（刀豆球蛋白A）陽性對照和空白對照（細(xì)胞培養(yǎng)液），用細(xì)胞培養(yǎng)液將酶標(biāo)儀調(diào)零，每個濃度3 個重復(fù)，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后利用酶標(biāo)儀測定其OD450nm值，并按公式計算PBMC 的增殖指數(shù)（SI），SI=實驗組OD450nm值/對照組OD450nm值，SI＞1.5 時，判為有效刺激。所得數(shù)據(jù)采用SPSS軟件分析，兩組間比較采用Studentt檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 Ace-SLP-1 基因的PCR 擴(kuò)增及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析以錫蘭鉤蟲cDNA 為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增Ace-SLP-1 基因。結(jié)果顯示，獲得了全長為315 bp 的Ace-SLP-1 基因序列（圖1）。測序結(jié)果顯示錫蘭鉤蟲Ace-SLP-1 基因全長315 bp，共編碼104 個氨基酸。將犬源Ace-SLP-1 基因編碼的氨基酸序列與其他蟲種的SLPs 進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，Ace-SLP-1 含有SLP 家族特有的6 個Cys-X-Cys 特征性序列，其與犬鉤蟲Ac-SLP-1 和Ac-SLP-2 編碼氨基酸序列的同源性分別為95.28%和19.81%。利用在線軟件對其氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示該蛋白分子質(zhì)量和PI 分別為11.4 ku 和7.0；疏水性平均系數(shù)（GRAVY）大于0，推測其為疏水性蛋白（圖1B）；有跨膜結(jié)構(gòu)域（圖1C），且該蛋白前17 個氨基酸為信號肽序列（圖1D）；其三維結(jié)構(gòu)模型（圖1E）結(jié)果顯示，Ace-SLP-1 編碼蛋白的全球性模型質(zhì)量估值（GMQE 值）為0.64（可信度范圍為0～1，值越大表明質(zhì)量越好），表明該蛋白三維結(jié)構(gòu)模型建模質(zhì)量良好。

圖1 Ace-SLP-1基因的PCR擴(kuò)增及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.1 PCR amplification of Ace-SLP-1 gene and bioinformatics analysis of Ace-SLP-1 protein

2.2 Ace-XL-SLP-1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定以錫蘭鉤蟲cDNA 為模板經(jīng)PCR 擴(kuò)增Ace-XL-SLP-1，并克隆至pET-28a 中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-Ace-XLSLP-1，經(jīng)Hind III/BamH I酶切鑒定，結(jié)果顯示獲得了約260 bp 的目的條帶，與預(yù)期目的片段相符（圖2）。測序結(jié)果表明，正確構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-Ace-XL-SLP-1。

圖2 pET-28a-Ace-XL-SLP-1重組粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion pET-28a-Ace-XL-SLP-1

2.3 錫蘭鉤蟲Ace-XL-SLP-1 的表達(dá)、純化及鑒定結(jié)果將重組質(zhì)粒pET-28a-Ace-XL-SLP-1 轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)并經(jīng)Ni-NTA 親和層析法純化，將誘導(dǎo)前后菌液、破碎后沉淀、上清以及純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE 檢測，結(jié)果顯示，在14.4 ku處出現(xiàn)目的條帶，且該目的蛋白主要在包涵體中表達(dá)（圖3A）；western blot 結(jié)果顯示，該重組蛋白能被鼠His 標(biāo)簽MAb 識別，在14.4 ku 處出現(xiàn)特異性條帶（圖3B）；通過western blot 分析錫蘭鉤蟲rAce-XL-SLP-1 的反應(yīng)原性，結(jié)果顯示該重組蛋白能夠被感染錫蘭鉤蟲的犬陽性血清特異性識別，在14.4 ku 處出現(xiàn)特異性條帶，而健康犬血清與該重組蛋白反應(yīng)后未出現(xiàn)該條帶（圖3C）。上述結(jié)果表明，錫蘭鉤蟲重組成熟肽蛋白rAce-XL-SLP-1 具有良好的反應(yīng)原性。

圖3 rAce-XL-SLP-1表達(dá)、純化的SDS-PAGE（A）及western blot（B、C）鑒定結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE(A)and western blot(B,C)identification results of rAce-XL-SLP-1 expression and purification

2.4 Ace-XL-SLP-1 對PBMC 增殖影響的檢測結(jié)果將不同濃度的rAce-XL-SLP-1與PBMC共孵育4 h后利用酶標(biāo)儀測定其OD450nm值。結(jié)果顯示，與陰性對照相比，20 μg/mL 和40 μg/mL 的rAce-XL-SLP-1 對PBMC 均具有明顯的刺激增殖作用（P＜0.05），且與其濃度有關(guān)，當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?0 μg/mL 時，SI 最大（2.15），與陽性對照組的SI 相當(dāng)。當(dāng)?shù)鞍诐舛鹊椭?0 μg/mL 時，刺激效果不明顯（表1）。表明，獲得的rAce-XL-SLP-1 具有一定的免疫原性。

表1 rAce-XL-SLP-1對犬PBMC增殖效應(yīng)的檢測結(jié)果Table 1 Detection results of the effect of recombinant protein Ace-XL-SLP-1 on canine PBMC proliferation

3 討 論

鉤蟲被世界衛(wèi)生組織列為易被忽視的主要土源性線蟲之一[14]。我國多次對家養(yǎng)犬進(jìn)行的蠕蟲流行病學(xué)調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，錫蘭鉤蟲是寄生在犬體內(nèi)的優(yōu)勢蟲種，嚴(yán)重危害犬的健康[15]。目前主要采取藥物治療和環(huán)境衛(wèi)生措施防治鉤蟲病，但由于鉤蟲抗藥性的產(chǎn)生和重復(fù)感染使其療效不佳。近年來，研究人員試圖從鉤蟲致病機(jī)理角度來探究該病新的防治方法，其中能夠改變細(xì)胞膜通透性并使紅細(xì)胞破裂的SLPs 成為研究熱點。

本研究首次從錫蘭鉤蟲成蟲克隆了Ace-SLP-1的cDNA 序列。通過對其氨基酸序列的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白前17 個氨基酸為信號肽序列，不利于該重組蛋白的表達(dá)。為了提高其表達(dá)量，本研究設(shè)計了一對引物擴(kuò)增Ace-SLP-1 基因的成熟肽序列，并在E. coliBL21（DE3）菌株中表達(dá)出了該蛋白。同源性分析發(fā)現(xiàn)該蛋白的氨基酸序列含有6 個保守的半胱氨酸殘基，可參與二硫鍵的形成，對高熱下多肽的穩(wěn)定性具有重要作用[16]?？扇苄苑治霭l(fā)現(xiàn)該蛋白主要在大腸桿菌中以包涵體的形式表達(dá)，可能由于其與二硫鍵配對的半胱氨酸含量較多，所以易形成包涵體。

SLPs 是一類作用于細(xì)胞膜的蛋白，具有作為疫苗候選分子或診斷分子的潛力。據(jù)報道采用肝片吸蟲的重組SLP 蛋白（rFh-SAP-2）免疫小鼠，可獲得81.2%的減蟲率，顯示其是一種潛在的疫苗候選分子[17]；而曼氏血吸蟲和日本血吸蟲的SLPs 具有良好的反應(yīng)原性，可以被感染動物（小鼠和兔）的血清和人血清所識別[10]，具有潛在的血清學(xué)診斷意義[18]。本研究結(jié)果顯示經(jīng)原核表達(dá)的rAce-XL-SLP-1 能夠被錫蘭鉤蟲感染的犬陽性血清所識別，顯示其具有作為錫蘭鉤蟲血清學(xué)診斷的潛在候選抗原。

近年來，CCK-8 試劑盒因檢測靈敏度高，操作簡單，無需有機(jī)溶劑，對細(xì)胞無毒性，已廣泛用于細(xì)胞增殖的快速檢測。通過該試劑檢測經(jīng)不同濃度rAce-XL-SLP-1 刺激后的犬PBMC 的增殖效應(yīng)能夠反映該重組蛋白的細(xì)胞免疫功能，在有效刺激（SI＞1.5）的情況下，SI 越大，淋巴細(xì)胞群體的反應(yīng)能力和免疫功能越強(qiáng)[19]。Huang 等通過該試劑盒的檢測結(jié)果證實錫蘭鉤蟲血小板抑制劑（Ace-HPI）能夠刺激犬PBMC 的增殖和細(xì)胞因子的分泌，有助于鉤蟲在宿主體內(nèi)建立慢性感染[20]。本研究分別將不同濃度的rAce-XL-SLP-1 與PBMC 共孵育時，當(dāng)該重組蛋白濃度為20 μg/mL 和40 μg/mL 時，PBMC 的SI 明顯高于對照組（P＜0.05）。表明rAce-XL-SLP-1 能夠誘導(dǎo)犬PBMC 的增殖，具有良好的免疫原性，提示rAce-XL-SLP-1 具有作為鉤蟲疫苗候選抗原分子的潛力。

綜上所述，本研究克隆了錫蘭鉤蟲Ace-SLP-1基因，對其編碼的氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析后，構(gòu)建了該基因成熟肽的重組質(zhì)粒pET-28a-Ace-XL-SLP-1 并誘導(dǎo)表達(dá)與純化了rAce-XL-SLP-1，對其免疫學(xué)特性進(jìn)行了初步分析，為鉤蟲病的血清學(xué)診斷及鉤蟲疫苗候選分子的篩選與功能學(xué)等研究奠定了基礎(chǔ)。