胡莉 白辰 龍超君 卓麗清 朱敬儒 劉邵陽(yáng) 于河 谷曉紅 劉鐵鋼

銀萊湯以肺與胃腸同治法組方，系首都名中醫(yī)谷曉紅教授治療小兒肺炎經(jīng)驗(yàn)方，臨床效果顯著[1]?！皽匦吧鲜?，首先犯肺”，小兒處于肺炎肺熱證時(shí)，易傳變至陽(yáng)明。根據(jù)中醫(yī)“既病防變”的治未病思想，在小兒肺炎肺熱證階段時(shí)，以肺與胃腸同治立法組方的銀萊湯，除可清肺臟之邪熱，也可調(diào)暢胃腸氣機(jī)，清泄胃腸積熱，并阻斷肺經(jīng)邪熱向胃腸的傳變。前期研究[2-5]發(fā)現(xiàn)，銀萊湯具有明確的抗炎作用，但其作用機(jī)制尚未明確。本研究以霧化吸入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)制備幼年大鼠肺炎模型為基礎(chǔ)，探討銀萊湯對(duì)本模型肺、腸組織的干預(yù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD幼年大鼠40只，體質(zhì)量(100±10)g，購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：110011211102012854。飼養(yǎng)條件：室溫(25±2)℃，濕度(50±10)%，每天換氣，保持12小時(shí)/12小時(shí)光暗照明，食水不限。研究方案獲動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：BUCM-4-2021030305-1046)。

1.2 試劑

銀萊湯藥物顆粒，由金銀花30 g、萊菔子10 g、連翹15 g、黃芩10 g、魚腥草20 g、全瓜蔞15 g、前胡10 g組成，共110 g，購(gòu)自北京康仁堂藥業(yè)有限公司；醋酸潑尼松片(規(guī)格5mg/片)，購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司；LPS(批號(hào)：L2880)，購(gòu)自Sigma公司；通用型組織固定液(批號(hào)：G1101)，購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；大鼠腫瘤壞死因子-α(transforming necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA試劑盒(批號(hào)：E-EL-R2856c、E-EL-R0015c、E-EL-R0012c)，購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；兔多抗腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor-1，TNFR1,50KD)、兔多抗TNFR1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(TNFR1-associated death domain protein，TRADD,35KD)、兔單抗腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TNF receptor associated factor2，TRAF2,53KD)、鼠單抗受體相互作用蛋白1(receptor interacting protein1，RIP1,76kd)、兔單抗IκB 激酶 β(ikappaB kinaseβ，IKKβ,87KD)(批號(hào)：Ab19139、Ab223040、Ab126758、Ab72139、Ab178870)，購(gòu)自Abcam公司；兔多抗細(xì)胞核因子-κBp65(nuclear factor-κBp65，NF-κBp65,65KD)(批號(hào)：10745-1-AP)，購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

微量移液器(Eppendorf)；電泳儀電源、垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀(型號(hào)：DYY-7C、DYCZ-24DN、DYCZ-40，北京六一儀器廠)；磁力攪拌器(型號(hào)：T8-1，江蘇省金壇市中大儀器廠)；電子天平(型號(hào)：CPA，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；離心機(jī)(型號(hào)：HI650，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；酶標(biāo)儀(型號(hào)：mμlISKANMK3，Thermo)。

1.4 分組、造模及給藥方法

將40只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為正常組(normal control group，N)、肺炎組(pneumonia group，P)、銀萊湯治療組(pneumonia treatment group，PT)和醋酸潑尼松組(prednisone acetate，PRE)，每組10只。肺炎組、銀萊湯治療組、醋酸潑尼松組以LPS(0.5 mg/mL)霧化造模，持續(xù)3天，2次/天，30分鐘/次，正常組以純水霧化吸入。霧化造模[6]后，銀萊湯治療組、醋酸潑尼松組分別以銀萊湯和醋酸潑尼松溶液灌胃(1 mL/100 g)，正常組和肺炎組以等量純水灌胃。肺炎模型成模標(biāo)準(zhǔn)：取大鼠肺組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片后，以HE染色法檢測(cè)肺病理，鏡下觀察到炎性改變[6]。

1.5 肺、結(jié)腸組織病理切片制作

經(jīng)過3天的霧化、灌胃造模后；第4天上午，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.2 mL/100 g)麻醉。冰上取肺、結(jié)腸組織，組織固定液固定，室溫?fù)u床放置24小時(shí)；蒸餾水清洗后進(jìn)行梯度乙醇脫水，制作組織蠟塊；冰上預(yù)冷切片(4 μm)，60℃烤片1小時(shí)。使用前將組織切片常規(guī)脫蠟復(fù)水，HE染色細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，使用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察肺、結(jié)腸組織病理變化。

1.6 肺、結(jié)腸組織炎癥因子檢測(cè)

每組取6只大鼠檢測(cè)炎癥因子。先制備組織樣品上清液：準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量(g)9倍的體積(mL)比例加入生理鹽水勻漿，3500 r/分鐘離心10分鐘，取上清作為待測(cè)樣品檢測(cè)。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(optical density，OD值)，計(jì)算肺、結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β含量。

1.7 肺、腸組織目標(biāo)蛋白檢測(cè)

分別取20 mg大鼠肺、結(jié)腸組織，加入RIPA裂解液裂解，于自動(dòng)勻漿機(jī)中勻漿，勻漿完成后置于冰上30分鐘充分裂解。BCA法測(cè)定蛋白濃度，等量蛋白經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2小時(shí)；分別加入TNFR1(1∶1000)、TRADD(1∶2000)、TRAF2(1∶1000)、RIP1(1∶500)、IKKβ(1∶1000)、NF-κBp65(1∶1000)一抗，4℃孵育過夜；TBST充分漂洗5次，每次5分鐘；滴加HRP標(biāo)記二抗(1∶50000)，室溫孵育2小時(shí)，TBST充分漂洗5次，每次5分鐘。將ECL試劑中增強(qiáng)液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液按1∶1比例混勻，滴加工作液于PVDF膜上，置凝膠成像系統(tǒng)顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺、結(jié)腸組織病理變化

2.1.1 大鼠肺組織病理變化 HE染色顯示，正常組肺組織肺泡結(jié)構(gòu)完整、肺泡壁薄，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)支氣管結(jié)構(gòu)完整清晰。肺炎組大鼠肺組織出現(xiàn)損傷，肺泡壁增厚，出現(xiàn)大面積炎癥浸潤(rùn)，部分肺泡腔結(jié)構(gòu)消失。銀萊湯治療組和醋酸潑尼松組大鼠肺組織損傷較肺炎組減輕，肺泡結(jié)構(gòu)完整性較好，炎性浸潤(rùn)減輕(見圖1)。

注：A 正常組；B 肺炎組；C銀萊湯治療組；D醋酸潑尼松組。

2.1.2 大鼠結(jié)腸組織病理變化 HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，隱窩較深，杯狀細(xì)胞排列整齊，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無潰瘍。肺炎組大鼠結(jié)腸組織大部分呈現(xiàn)黏膜完整性破壞，結(jié)腸隱窩和杯狀細(xì)胞明顯減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多。銀萊湯治療組和醋酸潑尼松組大鼠結(jié)腸組織均有明顯改善，隱窩變淺，杯狀細(xì)胞增多，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少(見圖2)。

2.2 大鼠肺組織、結(jié)腸組織炎癥因子表達(dá)水平

2.2.1 大鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)水平 與正常組比較，肺炎組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β相對(duì)表達(dá)明顯升高(P<0.01)，銀萊湯治療組和醋酸潑尼松組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)也明顯升高(P<0.01)。與肺炎組比較，銀萊湯治療組和醋酸潑尼松組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β相對(duì)表達(dá)明顯降低(P<0.01)。見表1。

注：A 正常組；B 肺炎組；C銀萊湯治療組；D醋酸潑尼松組。

表1 各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)水平比較

2.2.2 大鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)水平 與正常組比較，肺炎組大鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β相對(duì)表達(dá)明顯升高(P<0.01)，銀萊湯治療組和醋酸潑尼松組大鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)也明顯升高(P<0.01)。與肺炎組比較，銀萊湯治療組和醋酸潑尼松組大鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β相對(duì)表達(dá)明顯降低(P<0.01。見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)水平比較

2.3 大鼠肺、結(jié)腸組織蛋白表達(dá)水平

2.3.1 大鼠肺組織中TNF-α/NF-κB信號(hào)通路上TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表達(dá) 與正常組比較，肺炎組大鼠肺組織TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；銀萊湯治療組和醋酸潑尼松組大鼠肺組織TNFR1、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表達(dá)也明顯升高(P<0.05、P<0.01)，銀萊湯治療組和醋酸潑尼松組大鼠肺組織TRADD蛋白表達(dá)呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與肺炎組比較，銀萊湯治療組和醋酸潑尼松組大鼠肺組織中TNFR1、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05、P<0.01)，TRADD蛋白表達(dá)呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖3、表3。

表3 各組大鼠肺組織中TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表達(dá)水平比較

注：A 正常組；B 肺炎組；C銀萊湯治療組；D醋酸潑尼松組。

2.3.2 大鼠結(jié)腸組織中TNF-α/NF-κB信號(hào)通路上TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表達(dá) 與正常組相比，肺炎組大鼠結(jié)腸組織TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；銀萊湯治療組大鼠結(jié)腸組織TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05、P<0.01)；醋酸潑尼松組大鼠結(jié)腸組織TNFR1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05、P<0.01)，TRADD、TRAF2、RIP1蛋白表達(dá)與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與肺炎組比較，銀萊湯治療組大鼠結(jié)腸組織中TNFR1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05、P<0.01)，TRADD、TRAF2、RIP1蛋白表達(dá)呈現(xiàn)降低趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；醋酸潑尼松組大鼠結(jié)腸組織TNFR1、TRADD、TRAF2、IKKβ、NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05、P<0.01)，RIP1蛋白表達(dá)呈現(xiàn)降低趨勢(shì)但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表4、圖4。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織中TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表達(dá)水平比較

注：A 正常組；B 肺炎組；C銀萊湯治療組；D醋酸潑尼松組。

3 討論

肺與胃腸同治是小兒外感發(fā)熱的核心治法之一。宣透衛(wèi)分邪氣，可清解肺經(jīng)郁熱；運(yùn)化中焦氣機(jī)，消導(dǎo)胃腸積滯，可清泄陽(yáng)明氣分熱邪，肺胃腸同治共奏解熱良效[7]。銀萊湯全方由金銀花、萊菔子、連翹、黃芩、全瓜蔞、魚腥草、前胡組成；金銀花善清肺胃之熱，萊菔子下氣化積、導(dǎo)滯祛邪，二者共用為君藥；連翹上可清宣肺熱，下能通利小便；黃芩彰顯清肺之功，魚腥草清熱宣肺化痰，全瓜蔞肺腸同治，前胡下氣降痰；全方諸藥入肺、胃、大腸經(jīng)，共同發(fā)揮肺與胃腸同治的作用。

由于肺與腸具有相同的胚胎起源，他們除了在結(jié)構(gòu)上具有相似性[8]，在生理和病理狀態(tài)下還可以相互影響[9]。目前肺—腸軸的研究包括兩方面[10]：一是共同黏膜免疫反應(yīng)，肺與腸之間免疫信號(hào)的傳遞以淋巴液為載體，當(dāng)外來抗原被淋巴集結(jié)捕獲后[11]，促使幼稚的T淋巴和B淋巴細(xì)胞致敏，通過腸系膜淋巴結(jié)進(jìn)入血液，引發(fā)各個(gè)效應(yīng)點(diǎn)的黏膜免疫。二是肺部疾病特別是感染性疾病造成的菌群紊亂可以通過免疫調(diào)節(jié)影響消化道，如注射IL-25的小鼠在其肺部發(fā)現(xiàn)了激活的腸道內(nèi)固有淋巴細(xì)胞ILC2s，肺炎模型小鼠的肺部同樣檢測(cè)了腸道內(nèi)固有淋巴細(xì)胞ILC3s，這些反應(yīng)都可幫助機(jī)體抵抗感染[12]；肺部的微生物可以以Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)非依賴的方式協(xié)同激活宿主p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)，以放大促炎反應(yīng)[13]；腸道菌群的代謝產(chǎn)物會(huì)影響肺部的免疫反應(yīng)，腸道菌群可以通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞促進(jìn)抗炎反應(yīng)，產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子破壞黏膜屏障，也可以通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子抑制劑α(inhibitor a of NF-κB，IκBα)下調(diào)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽、分泌性免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，SIgA)防御黏膜損傷[14]，故肺臟疾病治療肺的同時(shí)需增強(qiáng)腸道防護(hù)功能來減輕肺部的免疫反應(yīng)。

肺—腸軸作為連接呼吸道與胃腸道之間的雙向通道，在疾病的發(fā)生發(fā)展上表現(xiàn)為“肺病及腸”和“腸病及肺”兩個(gè)方面[6,15-16]，如腸黏膜有極其豐富的毛細(xì)血管，是對(duì)缺血缺氧最敏感的部位，這一代謝活躍的器官在慢阻肺患者日?；顒?dòng)中反復(fù)出現(xiàn)局部缺氧而影響其功能[17]；且在團(tuán)隊(duì)前期前瞻性研究的基礎(chǔ)上，可以發(fā)現(xiàn)胃腸積熱與呼吸道感染存在相關(guān)性[18]；實(shí)驗(yàn)研究證明，高熱量飲食已被證明會(huì)加重肺炎的病情并延遲康復(fù)，尤其是在兒童中[19]。銀萊湯可以通過調(diào)節(jié)宿主免疫炎癥反應(yīng)、血管生成和血管通透性、氣道上皮細(xì)胞的屏障功能、激素釋放和細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡來減輕肺炎的癥狀和體征[6]。在共同黏膜免疫和腸道菌群對(duì)呼吸道和胃腸道的聯(lián)系外，目前對(duì)肺與腸直接聯(lián)系較少，且前期通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，得到銀萊湯相關(guān)通路中與炎癥關(guān)系最為密切的是TNF信號(hào)通路和TLRs信號(hào)通路，兩者又共同包含NF-κB信號(hào)通路，故基于TNF-α/NF-κB信號(hào)通路，探討銀萊湯治療肺炎中對(duì)肺、腸組織的干預(yù)機(jī)制具有重要意義。

TNF-α是免疫的中間調(diào)節(jié)因子[20]。TNF-α是NF-κB的主要激活因子之一[21]，TNF-α能通過刺激NF-κB p65的磷酸化并幫助它轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，同時(shí)它又能激活許多靶基因，其中包括TNF-α自身[22]，形成促炎反應(yīng)的積極循環(huán)。TNF-α刺激的TNF-α受體1(tumor necrosis factor receptor-1，TNFR1)通過招募上游信號(hào)分子，如TNF受體相關(guān)因子2(TNF receptor associated factor 2，TRAF2)和IκB 激酶(IκB kinase β，IKK)，觸發(fā)TNF-α/NF-κB的反應(yīng)，形成TNFR1復(fù)合物[23]。在TNF-α未與TNFR1結(jié)合前，TNFR1在胞內(nèi)區(qū)域和一種抑制蛋白(silencer of death domain，SODD)結(jié)合，防止TNFR1胞內(nèi)區(qū)在無TNF-α的狀態(tài)下發(fā)生自聚反應(yīng)引起通路的激活[24]。只有當(dāng)TNF-α三聚體結(jié)合到TNFR1的胞外區(qū)后，胞內(nèi)區(qū)上的SODD隨之被釋放[24]，TRADD通過與TNFR1的死亡結(jié)構(gòu)結(jié)合，形成TNFR1/TRADD復(fù)合體，隨后招募一系列的受體相關(guān)蛋白到復(fù)合體上，包括TRAF2、RIP，形成TNFR1復(fù)合體引發(fā)下游的信號(hào)通路[25]。

NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)是一種關(guān)鍵的促炎癥途徑，NF-κB由RelA(p65)/p50異源二聚體組成[26]，p65是NF-κB通路激活的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑[27]，通過將p65DNA結(jié)合因子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核發(fā)出信號(hào)[28]。在靜息狀態(tài)下，無活性的NF-κB被一種稱為IκB的抑制性亞基保留在細(xì)胞質(zhì)中[29]。含有IKKα、IKKβ的IKK和調(diào)節(jié)蛋白NF-κB必需修飾劑(NF-kappaB essential modulato，NEMO)對(duì)IκB的磷酸化是NF-κB激活對(duì)各種刺激的關(guān)鍵步驟[26,30]，被磷酸化后的IκBα和p65進(jìn)入核內(nèi)起始轉(zhuǎn)錄。

本研究結(jié)果顯示，LPS激活幼年大鼠肺組織，使得大鼠肺組織和結(jié)腸組織TNF-α/NF-κB信號(hào)通路上TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表達(dá)均增多，促進(jìn)了IKKα和IKKβ的磷酸化，NF-κBp65表達(dá)隨之增多，促進(jìn)肺組織和腸組織中的促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)增多；釋放的促炎因子TNF-α又可反饋激活TNF-α/NF-κB信號(hào)通路，形成積極的促炎反應(yīng)循環(huán)，加重肺組織和結(jié)腸組織的炎癥損傷。給予銀萊湯和醋酸潑尼松后，可減輕肺組織和結(jié)腸組織的炎性損傷和病理變化，并調(diào)控TNF-α/NF-κB信號(hào)通路上TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κBp65蛋白水平的表達(dá)，降低肺組織和結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。本研究結(jié)果明確了銀萊湯通過抑制IKKα、IKKβ磷酸化和p65核易位來抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB激活。本研究表明銀萊湯通過抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB調(diào)節(jié)靶基因產(chǎn)物，改善肺組織、腸組織的炎性損傷和病理變化。