■劉 彬 粟勝蘭 張雅惠 趙小麗 石 波 李新一* 喬 宇

（1.全國畜牧總站，北京 100125；2.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，北京 100081）

雖然抗生素曾經(jīng)在治療動物疾病、提高養(yǎng)殖效益及保障動物生產(chǎn)安全等方面發(fā)揮了重要的作用，但因抗生素管理不規(guī)范、使用不合理、技術(shù)水平不足等因素致使細菌耐藥和藥物殘留等問題日益嚴重，對人類健康造成了嚴重的威脅。早在20世紀80年代，世界各國的畜牧業(yè)就開始了預防性及促生長性抗生素添加劑的減抗、限抗、禁抗之路。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第194號公告，規(guī)定“自2020年7月1日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料”，開啟了我國養(yǎng)殖業(yè)飼料無抗的新時代。飼料行業(yè)迎來新的契機，抗生素替代品的研究與應用成為行業(yè)面臨的首要問題。益生菌是一類對宿主健康有益的活的微生物，可以補充、調(diào)整或者維持畜禽腸道菌群平衡，抑制病原微生物，調(diào)節(jié)動物機體免疫功能，從而達到提高畜禽生長性能、預防動物疾病、減少環(huán)境污染、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)等目的。理想的益生菌需具備幾個特征：①在胃腸道環(huán)境中生存（即耐酸、耐膽汁）；②黏附腸上皮細胞；③在腸道內(nèi)快速生長、定植；④穩(wěn)定腸道菌群區(qū)系；⑤無致病力；⑥在食品和飼料加工過程中保持活力。芽孢桿菌是一類產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性菌，與其他益生菌相比具有營養(yǎng)要求簡單、耐熱、耐酸、抗干燥等特性，在家禽、豬、反芻動物、水產(chǎn)養(yǎng)殖中應用效果顯著。目前畜禽養(yǎng)殖中研究和應用最廣泛的主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）等。凝結(jié)芽孢桿菌除具有芽孢桿菌的特性外，能分泌乳酸，兼具乳酸菌的特性。凝結(jié)芽孢桿菌被稱為“益生菌之王”，作為抗病促生長的抗生素替代品，應用在動物生產(chǎn)中具有不可比擬的優(yōu)勢。文章從凝結(jié)芽孢桿菌菌種特性出發(fā)，重點闡述凝結(jié)芽孢桿菌在畜禽養(yǎng)殖中的益生機制。

1 凝結(jié)芽孢桿菌的菌種特性

凝結(jié)芽孢桿菌的首次發(fā)現(xiàn)可以追溯到1915年，Hammer發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌引起大規(guī)模的罐裝煉乳凝結(jié)，1932年凝結(jié)芽孢桿菌被首次分離。在發(fā)現(xiàn)之初凝結(jié)芽孢桿菌被稱為芽孢乳酸桿菌（Lactobacillus sporogenes），具有桿菌科和乳酸菌科的共同特征，后來才更名為凝結(jié)芽孢桿菌（B.coagulans）。凝結(jié)芽孢桿菌在細菌分類上屬厚壁菌門（Firmicutes），桿菌綱（Bacilli），芽孢桿菌目（Bacillales），芽孢桿菌科（Bacillaceae），芽孢桿菌屬（Bacillus）。凝結(jié)芽孢桿菌屬革蘭氏陽性菌，細胞呈桿狀，兩端鈍圓，單個或成對，少數(shù)呈鏈狀。芽孢端生，芽孢體呈橢圓形。菌落為白色圓形，表面突出。凝結(jié)芽孢桿菌的生理生化特征具體表現(xiàn)為葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣，精氨酸發(fā)酵不產(chǎn)氨；凝結(jié)芽孢桿菌利用D-甘露糖、D-木糖、淀粉，不利用檸檬酸、D-甘露醇、L-阿拉伯糖；V-P測定、接觸酶、氧化酶陽性；明膠液化反應、酪氨酸水解反應、氨基酸脫羧酶反應陰性；凝結(jié)芽孢桿菌不產(chǎn)黏性物質(zhì)、不產(chǎn)硫化氫（H2S）、不產(chǎn)吲哚。

凝結(jié)芽孢桿菌是兼性厭氧菌，在不良條件下形成芽孢，具有強抗逆性和耐熱性，抵抗胃腸道內(nèi)的極端環(huán)境，具有益生菌特征。凝結(jié)芽孢桿菌最適生長溫度為35～50℃，最適生長pH為5.5～6.5。少數(shù)耐高溫凝結(jié)芽孢桿菌在pH 6.2、60～65℃也能生長。在pH 4.5、65℃的環(huán)境中也曾分離得到凝結(jié)芽孢桿菌。凝結(jié)芽孢桿菌在100℃處理10 min，存活率可達96%，能耐受飼料加工過程中的高溫、高壓環(huán)境。固體劑型保存3～5年后仍保持較高的存活率。Hyronimus等（2000）發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌能耐受0.3%的膽鹽；姚勇芳等（2017）發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌在pH為2.0～6.0及0.2%～0.4%豬膽鹽溶液環(huán)境中存活率超過100%；汪攀等（2017）發(fā)現(xiàn)，在池塘底泥中分離到的凝結(jié)芽孢桿菌在pH 2.5的模擬胃液中12 h存活率為71.9%，在膽鹽濃度為0.3%的模擬腸液中12 h存活率為84.4%；韓明渠等（2020）從雞腸道內(nèi)容物中篩選到一株凝結(jié)芽孢桿菌，在模擬胃液中處理180 min存活率達到72.7%，在0.6%的膽鹽溶液中處理6 h存活率達到54.5%。

凝結(jié)芽孢桿菌缺乏黏附腸上皮的能力，飼喂動物后4～5 d內(nèi)會從腸道內(nèi)完全消失，需長期服用。將凝結(jié)芽孢桿菌按芽孢計以109個/d的劑量飼喂大鼠30 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠的腸道菌群區(qū)系得到改善。

2 凝結(jié)芽孢桿菌的有益代謝物

益生菌在生長過程中會合成一些對微生物的生命活動無明確功能的物質(zhì)（如短鏈脂肪酸、細菌素等），這些代謝物與益生菌的功能息息相關。凝結(jié)芽孢桿菌分泌的代謝物如表1所示。凝結(jié)芽孢桿菌最重要的代謝物是乳酸，可作為工業(yè)生產(chǎn)菌在以葡萄糖和木糖為碳源、50℃厭氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)乳酸。其他碳源如蔗漿、高粱汁、咖啡萃取物、小麥秸稈、玉米芯、木質(zhì)纖維素水解物和玉米淀粉等發(fā)酵凝結(jié)芽孢桿菌也產(chǎn)乳酸。

表1 凝結(jié)芽孢桿菌分泌代謝物匯總

凝結(jié)芽孢桿菌分泌多種促進營養(yǎng)物質(zhì)消化的酶（如β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-淀粉酶、脂肪酶、木聚糖酶和蛋白酶等）。Batra等（2002）從溫泉中分離到產(chǎn)β-半乳糖苷酶的凝結(jié)芽孢桿菌RCS3，分泌的β-半乳糖苷酶具有良好的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性以及水解能力，酶在65℃、pH 6～7時活性最高，與乳糖和乳清在50℃共孵育36 h后能完全水解。凝結(jié)芽孢桿菌KM-1產(chǎn)嗜熱的α-半乳糖苷酶，α-半乳糖苷酶是飼料中重要的酶制劑，通過斷裂豆粕中棉子糖、水蘇糖等的α-半乳糖苷鍵，消除豆粕中半乳甘露聚糖的抗營養(yǎng)作用。Babu等（1995）發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌B49在以麥麩為基質(zhì)的固體發(fā)酵中產(chǎn)生熱穩(wěn)定的α-淀粉酶。Tang等（2005）發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)脂肪酶。工業(yè)上利用椰子油餅等發(fā)酵凝結(jié)芽孢桿菌生產(chǎn)脂肪酶。凝結(jié)芽孢桿菌還能產(chǎn)木聚糖酶，Heck等（2005）用固體發(fā)酵凝結(jié)芽孢桿菌BL69生產(chǎn)無纖維素酶活性的木聚糖酶。Prihanto等（2013）和Reyes-Mendez等（2015）的研究證明凝結(jié)芽孢桿菌能產(chǎn)生蛋白酶。

凝結(jié)芽孢桿菌分泌細菌素，抑制多種病原菌生長。Abada等（2008）報道凝結(jié)芽孢桿菌分泌的細菌素能抑制大腸桿菌NCTC-10418、綠膿桿菌NCIB-9016、肺炎克雷伯菌NCIB-9111、枯草芽孢桿菌NCTC-6346、金黃色葡萄球菌NCTC7447和白色念珠菌CBS-562生長。Abdhula等（2015）從傳統(tǒng)發(fā)酵的魚制品中分離到凝結(jié)芽孢桿菌BDU3，其分泌的細菌素對食源性的蠟樣芽孢桿菌MTCC 430、金黃色葡萄球菌3160、腸球菌MTCC 9728，乳桿菌MTCCQ 0093和滕黃微球菌MTCC106的生長具有抑制作用。韓明渠等（2020）發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 16244對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有明顯抑制作用。Senna等（2017）發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌有抗真菌作用，抑制番茄灰霉菌、蒼白鐮刀菌、串珠鐮孢菌三種真菌的生長。佟德軍等（2020）分離到一株能降解玉米赤霉烯酮的凝結(jié)芽孢桿菌。張韻等（2017）從仔豬糞便中分離獲得的凝結(jié)芽孢桿菌對大腸桿菌K88、雞腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌表現(xiàn)出良好的抑菌作用。Donskey等（2001）研究了凝結(jié)芽孢桿菌對大鼠腸道中抗萬古霉素的腸球菌的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)用107CFU/g的凝結(jié)芽孢桿菌喂養(yǎng)大鼠4 d，能夠抑制抗萬古霉素的腸球菌生長。

研究人員解析了凝結(jié)芽孢桿菌的細菌素，發(fā)現(xiàn)有一類是脂肽類的表面活性素，這類細菌素由兩對表面活性素異構(gòu)體構(gòu)成，含四種分子量均在1 000 u左右的組分，以β-羥基-異-C14或反異-C15脂肪酸通過酰胺基團和內(nèi)酯鍵連接在7個氨基酸肽鏈上的[Leu7]或[Val7]組成環(huán)肽。細菌素編碼基因在凝結(jié)芽孢桿菌中普遍存在，錢文江等（2020）分析了33個凝結(jié)芽孢桿菌的基因組，發(fā)現(xiàn)每個菌株都有1～2個細菌素的基因簇。Hyronimus等（1998）發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌分泌一種對蛋白酶敏感、分子量在3～4 ku的抑菌物質(zhì)，稱為凝固素，對腸球菌、明串珠菌、酒球菌、李斯特菌和片球菌的生長有抑制作用。Riazi等（2009）發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌ATCC 7050分泌分子量約為37 ku的抗菌蛋白（lactosporin），該蛋白對熱穩(wěn)定，等電點為3.5～4.0，經(jīng)蛋白酶和脂肪酶降解后失活，對藤黃微球菌有抑制作用。

3 飼用凝結(jié)芽孢桿菌的作用機制

近年來，對飼用凝結(jié)芽孢桿菌作用機制的研究主要集中在提高動物生長性能、優(yōu)化動物腸道的微生物組成、增強動物免疫功能以及提高機體抗氧化能力等方面（見圖1）。

圖1 飼用凝結(jié)芽孢桿菌作用機制

3.1 提高動物生長性能

凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)生的乳酸能降低腸道pH，抑制病原菌生長，促進雙歧桿菌、乳酸菌等增殖并合成多種B族維生素。腸道內(nèi)的低pH有利于提高胃蛋白酶活性，提高蛋白質(zhì)利用率，促進鈣、磷、鐵等微量元素的利用和維生素D的吸收。而且，腸道內(nèi)低pH環(huán)境能改變小腸絨毛高度和隱窩深度，間接提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率。凝結(jié)芽孢桿菌在代謝過程分泌大量消化酶，作用于飼料中的碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)等，釋放更多易于消化的小分子，提高飼料利用率。

凝結(jié)芽孢桿菌在動物腸道增殖過程產(chǎn)生氨基酸、維生素等代謝物，這些物質(zhì)能與腸道內(nèi)的其他菌產(chǎn)生協(xié)同作用促進小腸的蠕動，增強機體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。凝結(jié)芽孢桿菌還通過改變菌體代謝流，提高營養(yǎng)物質(zhì)吸收和運輸相關基因的表達水平，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收。Cavazzoni等（1998）證實了凝結(jié)芽孢桿菌通過產(chǎn)生氨基酸、維生素和分泌的淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶和脂肪酶來提高飼料消化率和肉雞生長性能。

3.2 優(yōu)化腸道微生物區(qū)系組成

凝結(jié)芽孢桿菌在動物腸道內(nèi)發(fā)揮“生物奪氧”效應，低氧狀態(tài)為厭氧有益菌（如雙歧桿菌、乳酸菌等）創(chuàng)造了生長的有利條件，同時抑制需氧致病菌的生長，減少產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量。凝結(jié)芽孢桿菌代謝產(chǎn)生的乳酸降低了腸道內(nèi)的pH，酸性環(huán)境對乳酸菌等有益菌的增殖有利，對嗜堿性致病菌有頡頏作用。而且，凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)生細菌素，抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、綠膿桿菌、白色念珠菌等有害細菌和真菌生長。Zhou等（2020）的體內(nèi)試驗也證實凝結(jié)芽孢桿菌能預防家禽、豬感染致病性大腸桿菌和葡萄球菌。

3.3 增強動物免疫功能

凝結(jié)芽孢桿菌能誘導炎癥介質(zhì)和抗炎細胞因子產(chǎn)生，激發(fā)免疫系統(tǒng)保護宿主減少炎癥反應。研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌的免疫調(diào)節(jié)功能是通過細胞因子實現(xiàn)的。當細胞暴露于病毒，如腺病毒和甲型、乙型流感病毒時，凝結(jié)芽孢桿菌能顯著增加細胞因子白細胞介素（IL-6、IL-8)、腫瘤壞死因子（TNF-α）和干擾素（IFN-γ）的產(chǎn)生。凝結(jié)芽孢桿菌免疫調(diào)節(jié)作用還表現(xiàn)通過減少IL-8，增加IL-10的分泌，降低宿主的炎癥反應。益生菌免疫調(diào)節(jié)的機制主要有兩個方面：一是細菌細胞壁上組分脂多糖、鞭毛蛋白、脂磷壁酸和脂蛋白和免疫細胞上的受體識別，免疫細胞膜的Toll樣受體（TLR）激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號通路并誘導產(chǎn)生炎性細胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、IL-12、IFN-γ和共刺激因子。凝結(jié)芽孢桿菌的磷壁酸是甘油磷酸酯聚合物能與TLR-2受體結(jié)合，激活上述免疫細胞的信號通路。Jensen等（2017）證明滅活的凝結(jié)芽孢桿菌也有免疫激活和抗炎功能，能激活免疫細胞并促使趨化因子和細胞因子的產(chǎn)生。二是益生菌分泌的活性物質(zhì)能增強免疫功能。Benson等（2012）發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌的代謝物能促進抗原呈遞細胞的成熟，由單核吞噬細胞向巨噬細胞和樹突狀細胞表型轉(zhuǎn)變，同時導致CD14+和CD16+促炎細胞的數(shù)量減少。

3.4 提高機體抗氧化能力

凝結(jié)芽孢桿菌增加異育銀鯽幼魚血液中髓過氧化物酶和抗超氧陰離子自由基活性，降低丙二醛含量。調(diào)節(jié)肝臟中抗氧化酶和抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)水平來緩解氧化應激Nrf2-Keap1信號分子水平。重金屬（如鎘和汞），通過誘導產(chǎn)生活性氧（ROS）引起動物氧化應激反應。凝結(jié)芽孢桿菌由于其細菌細胞壁高含量的肽聚糖和磷壁酸而具有較高的金屬吸附能力。能保護宿主免受汞引起的氧化應激研究。研究用凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌和菊粉組成的合生元對鎘引起的大鼠中毒的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)宿主體內(nèi)抗氧化酶活性增加，組織中的鎘水平降低，鎘中毒反應有所緩解。

4 凝結(jié)芽孢桿菌的安全性

研究表明，芽孢桿菌的安全性問題主要有細胞毒性、溶血、生物胺、抗生素抗性基因轉(zhuǎn)移等。能引起動物中毒具有安全性隱患的芽孢桿菌多為蠟樣芽孢桿菌，該菌作為益生菌使用有腹瀉型疾病或嘔吐型疾病發(fā)生的風險。凝結(jié)芽孢桿菌不具有上述安全性問題，也從未檢測出毒性。凝結(jié)芽孢桿菌被美國食品及藥物管理局（FDA）和歐洲食品安全局（EFSA）認定是安全的菌株，被列入GRAS（Generally Recognized As Safe）和QPS（Qualified Presumption of Safety）名單中。

Endres等（2009）對凝結(jié)芽孢桿菌GBI-30、6086進行了毒理學評價，包括細菌逆轉(zhuǎn)突變、體外染色體畸變實驗，小鼠微核實驗、大鼠急性和90 d亞慢性口服毒性試驗以及兔急性眼和皮膚刺激試驗，研究發(fā)現(xiàn)這兩株凝結(jié)芽孢桿菌無致突變性、致畸性或遺傳毒性。Endres等（2011）對凝結(jié)芽孢桿菌GBI-30、6086還進行了一年的慢性口服毒性試驗、繁殖毒性等毒理學評價，結(jié)果表明即使是在最高劑量的條件下也未發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌具有毒性。

Salvetti等（2016）通過全基因測序結(jié)合傳統(tǒng)表型分析凝結(jié)芽孢桿菌GBI-30、6086的毒力因子編碼基因、抗生素抗性基因和有害代謝物編碼基因（生物胺合成基因），發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌對鏈霉素和卡那霉素具有抗性，但基因組分析結(jié)果表明這兩個抗生素抗性基因不易轉(zhuǎn)移給其他細菌，基因組也不存在毒力因子編碼基因和有害代謝物編碼基因。此外，沒有發(fā)現(xiàn)可能導致基因組重排的不穩(wěn)定元素。另一項研究顯示凝結(jié)芽孢桿菌MTCC 5856基因表型具有穩(wěn)定性，經(jīng)過3年商業(yè)化生產(chǎn)，該菌株無突變、無細胞毒性、無腸毒素基因。菌株在（25±2）℃環(huán)境溫度下放置36個月穩(wěn)定。

5 未來展望

我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2004年第372號公告批準天津市新星獸藥廠申請的飼用凝結(jié)芽孢桿菌TQ33作為飼料添加劑使用，并將凝結(jié)芽孢桿菌列入2008年公布的《飼料添加劑品種目錄》中。凝結(jié)芽孢桿菌已廣泛用于豬、雞、鴨和魚等養(yǎng)殖動物中，在動物日糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌，具有顯著的防病抗病、促生長的功效。凝結(jié)芽孢桿菌具有優(yōu)良的益生特性，作為替抗類飼料添加劑有著廣闊的應用前景。

目前，飼用凝結(jié)芽孢桿菌的應用體系尚不完善，存在著一些亟待解決的問題。主要表現(xiàn)為：凝結(jié)芽孢桿菌對動物促生長和抗病的作用機制還不完全明確，飼用凝結(jié)芽孢桿菌的應用技術(shù)尚不完善，凝結(jié)芽孢桿菌的基礎研究、應用研究和技術(shù)推廣等工作有待進一步開展；市場上的凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品存在著種類少、其他芽孢桿菌冒用現(xiàn)象，產(chǎn)品標準制定工作滯后，生產(chǎn)和使用缺乏統(tǒng)一的規(guī)范，迫切需要科研工作者、凝結(jié)芽孢桿菌的生產(chǎn)者和使用者以及行業(yè)管理部門的共同努力，健全凝結(jié)芽孢桿菌的市場應用體系，為實現(xiàn)無抗養(yǎng)殖、推動畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展貢獻力量。