■呂仁龍 曾慶羚 李 茂 王定發(fā) 陳世永 周漢林*

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南?？?571101；2.海南大學(xué)林學(xué)院，海南儋州 571737；3.海南盛旭生物科技有限公司，海南儋州 571746）

發(fā)酵型全混合日糧（Fermented total mixed ration，F(xiàn)TMR）是將粗飼料、精飼料、添加劑和必需礦物質(zhì)等混合后密封發(fā)酵的反芻動(dòng)物日糧產(chǎn)品，不僅可以保持營(yíng)養(yǎng)穩(wěn)定還可以長(zhǎng)期保存[1]。在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸（Volatile fatty acid，VFA）還可以顯著提升產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和反芻動(dòng)物適口性[2]。近年來(lái)，F(xiàn)TMR產(chǎn)品在海南地區(qū)逐漸被推廣應(yīng)用，不僅在山羊育肥和肉牛飼養(yǎng)上起到了良好的效果，還大大緩解了海南島內(nèi)冬季飼料短缺問題，同時(shí)還帶動(dòng)了粗飼料加工業(yè)發(fā)展，拉動(dòng)了副產(chǎn)物回收市場(chǎng)，對(duì)海南地區(qū)的發(fā)展起到了一定推動(dòng)作用。王草具有生長(zhǎng)速度快、生物量大、適口性好等特點(diǎn)，是熱帶地區(qū)不可替代的反芻動(dòng)物粗飼料來(lái)源。在海南地區(qū)加工FTMR過程中，由于王草糖分高、容易發(fā)酵，因此，它在日糧粗飼料部分中占據(jù)了主體地位。

甘蔗廣泛種植于我國(guó)南方地區(qū)，甘蔗制糖加工后副產(chǎn)物的年產(chǎn)量在2 000萬(wàn)噸以上[3]。甘蔗渣含有大量的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素（含量約為20%）[4-5]，粗蛋白質(zhì)含量為2%～4%[6]。甘蔗渣在反芻動(dòng)物體內(nèi)不易消化，代謝能利用率低[7]，在反芻動(dòng)物體內(nèi)的有機(jī)物消化率僅有20%～25%[8]，因此不宜直接將其作為飼料進(jìn)行飼喂[9]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，甘蔗渣經(jīng)過氨化處理[10]、堿化處理[11-12]、生物發(fā)酵處理[13]或膨化處理[14]后會(huì)降低非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量，提升瘤胃內(nèi)消化率，顯著改善其飼用價(jià)值。微生物發(fā)酵是粗飼料常用加工手段，有研究顯示，青貯甘蔗渣，可提升其蛋白質(zhì)含量，改善其營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)[5，15-16]。糖蜜也是制糖工業(yè)中的副產(chǎn)物，與甘蔗渣互補(bǔ)，二者混合發(fā)酵加工成為了粗飼料加工的一個(gè)熱點(diǎn)。胡詠梅等[17]研究發(fā)現(xiàn)，甘蔗渣與糖蜜混合發(fā)酵后，粗蛋白會(huì)提升10%以上。徐雅飛[18]的試驗(yàn)也表明二者混合發(fā)酵后會(huì)改善其品質(zhì)和產(chǎn)品風(fēng)味。擴(kuò)大甘蔗渣在反芻動(dòng)物日糧中的應(yīng)用，改善其加工方法和品質(zhì)，制備標(biāo)準(zhǔn)化的FTMR產(chǎn)品將提升飼料加工產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。綜上，本試驗(yàn)的目的是考察不同比例甘蔗渣在添加糖蜜的FTMR中，對(duì)產(chǎn)品發(fā)酵品質(zhì)和瘤胃消化率的影響，討論甘蔗渣作為原料在FTMR中應(yīng)用的可行性和最佳添加比例。

1 材料與方法

1.1 全混合日糧組成

FTMR由粗飼料（王草、甘蔗渣）和精飼料[玉米、麩皮、豆粕、食鹽、碳酸鈣、碳酸氫鈉（NaHCO3）和預(yù)混料]兩部分組成。王草栽培于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所畜牧實(shí)驗(yàn)基地（海拔149 m），于2020年5月26日，草高1.8～2.0 m時(shí)收割，收割的王草粉碎后自然晾曬1 d。甘蔗渣由海南盛旭生物科技有限公司在海南島內(nèi)收購(gòu)。日糧組成原料的營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 FTMR各組成的營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

各處理FTMR的組成成分如表2所示，F(xiàn)TMR中粗飼料部分占總比重50%，甘蔗渣添加比例分別為0（0甘蔗渣組）、5%（5%甘蔗渣組）和10%（10%甘蔗渣組）。本試驗(yàn)進(jìn)行了雙因素設(shè)計(jì)，在每個(gè)處理組分別做無(wú)添加（對(duì)照）組和糖蜜（M，2%）組添加。

表2 FTMR的原料組成成分（%DM）

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 FTMR制備

將處理組原料參照表2的比例稱取后，充分混合后裝入一個(gè)30 cm×20 cm聚乙烯青貯袋中，添加適當(dāng)純化水將各處理組水分控制在60%左右，再用真空打包機(jī)（SINBO，上海）真空密封，保存于暗室（室溫25～30℃）發(fā)酵60 d后開封。糖蜜添加方法是直接將糖蜜按照干物質(zhì)2%的比例在真空打包之前添加到青貯袋中，充分混合后真空密封。

1.3.2 體外培養(yǎng)試驗(yàn)

培養(yǎng)方法與呂仁龍等[19]的方法相同。選用3只平均體重為17.5 kg的成年海南黑山羊飼養(yǎng)于代謝籠中。以維持每日必需能量的餐食，每天上午8：30和下午16：00各飼喂一次（粗精比例為5∶5，粗飼料部分為新鮮王草），自由飲水和采食礦鹽。在早上飼喂黑山羊2 h后，分別抽取3只羊的瘤胃液，保存于玻璃密封瓶，39℃水浴保溫帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)4層紗布過濾，再將過濾后的瘤胃液等比例混合。將混合瘤胃液與緩沖液1∶2混合[緩沖液使用之前放入水浴中，并通入二氧化碳（CO2），排除溶液中氧氣]，置于39℃恒溫水浴，并持續(xù)通入5 min CO2。稱取待培養(yǎng)樣品約0.3 g裝入50 mL培養(yǎng)瓶中，抽取培養(yǎng)液30 mL加入培養(yǎng)瓶，CO2排凈空氣，使其保持真空狀態(tài)，用橡膠內(nèi)蓋和塑料外蓋密封，置于39℃的水浴搖床中培養(yǎng)6 h。

1.3.3 營(yíng)養(yǎng)成分分析

按照Van等[20]的方法對(duì)各處理組FTMR營(yíng)養(yǎng)成分中的干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分含量及酸性洗滌纖維含量進(jìn)行測(cè)定。按照Van等[20]的方法對(duì)NDF含量進(jìn)行測(cè)定；洗滌后，減去殘留灰分計(jì)算出NDF的含量。參照National Research Council（NRC）2001[21]的計(jì)算方法對(duì)NFC和碳水化合物總含量進(jìn)行計(jì)算。

NFC=100-CP-CA-EE-NDF

1.3.4 FTMR發(fā)酵品質(zhì)

FTMR開封后，取50 g樣品，切碎，浸泡在200 mL純化水中，使樣品置于液面下方浸泡24 h（4℃），浸泡過后，用四層紗布將汁液過濾，用雷磁PHS-3C精密pH計(jì)測(cè)定濾液的pH。取10 mL過濾液體到離心管，放入離心機(jī)離心（HERMLE，美國(guó)），設(shè)定轉(zhuǎn)速12 000 r/min，5 min，取部分上清液用一個(gè)0.22μm微孔濾膜過濾至進(jìn)樣瓶。采用高效液相色譜儀（HPLC）分析各揮發(fā)性脂肪酸（乳酸、甲酸、乙酸、丙酸和丁酸）的含量。HPLC設(shè)定條件為：色譜柱（RP-18，5μm，4.6 mm×25 mm），檢測(cè)器：日立-Primaide型紫外檢測(cè)器，流動(dòng)相：甲醇。流速：1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，進(jìn)樣體積：10μL。

用微量擴(kuò)散法分析揮發(fā)性氨態(tài)氮（NH3-N）的含量，在康衛(wèi)皿內(nèi)皿加入1 mL硼酸指示劑，外皿加入1 mL離心后的青貯汁液和1 mL飽和碳酸鉀溶液（K2CO3），使外皿的青貯汁液和碳酸鉀溶液充分混合，保持揮發(fā)狀態(tài)，靜置24 h后，用滴定鹽酸（0.01 mol/L HCl）滴定。

1.3.5 干物質(zhì)消化率與蛋白質(zhì)消化率

用過濾法測(cè)定干物質(zhì)消化率[22]，使用抽濾瓶和布氏漏斗將培養(yǎng)液和殘?jiān)闉V到濾紙上，隨后將包有殘?jiān)臑V紙放入干燥箱（100℃）中干燥12 h，取出進(jìn)行稱重。計(jì)算上述濾紙的蛋白質(zhì)總含量和蛋白質(zhì)消化率。

干物質(zhì)消化率（%）=[1-培養(yǎng)后干物質(zhì)重/（培養(yǎng)樣品鮮重×干物率）]×100

粗蛋白消化率（%）=（1-培養(yǎng)后粗蛋白含量/培養(yǎng)樣品中粗蛋白總量）×100

1.3.6 瘤胃發(fā)酵特性

培養(yǎng)結(jié)束后，加入100μL福爾馬林溶液停止微生物發(fā)酵反應(yīng)[22]。再用玻璃注射器測(cè)定培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)氣體總量，并測(cè)定培養(yǎng)液的pH。培養(yǎng)液各揮發(fā)性脂肪酸（VFA）組成含量采用高效氣相色譜儀（GC，安捷倫，7890B）測(cè)定。GC設(shè)定條件為，色譜柱：HP-INNOWAX（19091N-133）毛細(xì)管柱，30 m×0.25 mm×0.25μm；柱溫160℃，汽化室溫度200℃，氮?dú)饬魉?0 mL/min，氫氣流速60 mL/min，空氣流速360 mL/min，進(jìn)樣量1μL。揮發(fā)性氨態(tài)氮的含量利用苯酚次氯酸鈉比色法進(jìn)行分析，取1 mL培養(yǎng)液稀釋液，加入4 mL的0.2 mol/L鹽酸溶液，再加入苯酚和次氯酸鈉混勻后放入60℃水浴鍋加熱，顯色10 min后冷卻，用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，波長(zhǎng)設(shè)定為560 nm。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.1[23]軟件中的GLM程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以甘蔗渣添加比例和糖蜜作為主要影響因素，利用雙因素?cái)?shù)據(jù)模型分析發(fā)酵TMR的營(yíng)養(yǎng)成分含量、pH和有機(jī)酸組成。Tukey檢驗(yàn)用于確定同甘蔗渣添加比例間在糖蜜添加有無(wú)處理的平均值之間的差異。

2 結(jié)果與分析

表1顯示了FTMR組成原料的營(yíng)養(yǎng)成分，其中王草和甘蔗渣的粗蛋白和NDF含量分別為11.7%和56.2%，甘蔗渣的CP、NDF、ADF和EE含量分別為4.5%、82.7%、66.0%和0.6%。表3揭示了不同甘蔗渣添加比例的FTMR在糖蜜添加條件下營(yíng)養(yǎng)成分的變動(dòng)，結(jié)果表明，CP含量和EE含量顯著受到了甘蔗渣添加比例的影響，即隨甘蔗渣比例的增加，CP和EE含量逐漸降低（P＜0.05），但二者都沒有受到糖蜜組的影響（P＞0.05）。在三個(gè)甘蔗渣添加組中，與對(duì)照組相比，糖蜜組在發(fā)酵過后，NDF含量都顯著降低（P＜0.05），而ADF含量在隨著甘蔗渣添加比例增加而顯著升高（P＜0.05）。NFC和TC含量都受到了甘蔗渣添加量的影響，即NFC隨著甘蔗渣添加增加而降低，而TC含量則隨之升高。表4表明了各處理組的發(fā)酵品質(zhì)，結(jié)果顯示：pH同時(shí)受到了甘蔗渣添加量和糖蜜的影響，隨著甘蔗渣添加量的增加，pH顯著升高（P＜0.05），在糖蜜組中，pH顯著降低（P＜0.05）。在本試驗(yàn)中，隨著甘蔗渣添加比例的增加，乳酸含量逐漸降低（P＜0.05）,但沒有受到糖蜜添加的影響（P＞0.05）。糖蜜顯著提升了發(fā)酵后日糧中乙酸和丙酸的含量（P＜0.05），同時(shí)抑制了丁酸的產(chǎn)生（P＜0.05）。表5反映了在體外培養(yǎng)后，干物質(zhì)消化率以及對(duì)瘤胃發(fā)酵效果的影響。其中，干物質(zhì)消化率同時(shí)受到甘蔗渣添加量和糖蜜的影響，隨著甘蔗渣比例的增加，干物質(zhì)消化率顯著降低（P＜0.05），而糖蜜添加后的處理組，干物質(zhì)消化率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。在幾個(gè)處理組中，經(jīng)過培養(yǎng)后，瘤胃液的pH并沒有受到任何影響，但產(chǎn)氣量隨甘蔗渣添加量增加而降低（P＜0.05），糖蜜組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。各處理組的乙酸、丙酸、丁酸含量以及揮發(fā)性氨態(tài)氮含量沒有受到糖蜜添加和甘蔗渣添加比例的影響。

表3 不同甘蔗渣添加比例的FTMR在糖蜜添加有無(wú)條件下的營(yíng)養(yǎng)水平變動(dòng)（%）

表4 不同甘蔗渣添加比例的FTMR在糖蜜添加有無(wú)條件下對(duì)發(fā)酵品質(zhì)的影響

表5 不同甘蔗渣添加比例的FTMR在糖蜜添加有無(wú)條件下對(duì)體外培養(yǎng)后干物質(zhì)消化率和瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

3 討論

FTMR產(chǎn)品在反芻動(dòng)物飼養(yǎng)領(lǐng)域中具有較高的經(jīng)濟(jì)前景[24]，特別是近年來(lái)在海南地區(qū)，隨著FTMR產(chǎn)品的投放，不僅緩解了島內(nèi)冬季飼料短缺問題，而且也降低了飼養(yǎng)成本。利用飼料加工技術(shù)，將部分農(nóng)業(yè)廢棄物作為動(dòng)物日糧并應(yīng)用推廣是建立循環(huán)農(nóng)業(yè)的重要手段。盡管甘蔗渣消化率較低，但少量地添加或替代到FTMR中，也將大大縮減飼養(yǎng)成本。通常，F(xiàn)TMR水分控制在50%～60%，在我們前期多個(gè)研究中發(fā)現(xiàn)[19，25]，在60%水分條件下，F(xiàn)TMR的發(fā)酵品質(zhì)和動(dòng)物適口性都較好，并且在實(shí)際生產(chǎn)過程中，60%的水分相對(duì)易控制，有助于減少人工投入。關(guān)于主體粗飼料王草的利用，在2018-2020年持續(xù)測(cè)定過程中表明，王草（熱研4號(hào)）在1.6～2.0 m時(shí)收割，其利用率較高，蛋白質(zhì)含量為10%～13%，可以作為FTMR日糧原料的基本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1 不同甘蔗渣添加量對(duì)FTMR品質(zhì)和消化率的影響

研究表明，未經(jīng)過處理的甘蔗渣作為單一粗飼料飼喂羊，對(duì)山羊的日增重和纖維消化率都會(huì)產(chǎn)生顯著負(fù)面影響[26]。由于甘蔗渣含有較高的NDF和較低的CP和EE，隨甘蔗渣添加量的增加，F(xiàn)TMR中EE含量逐漸降低，NDF含量顯著提升。在發(fā)酵品質(zhì)方面，甘蔗渣使發(fā)酵后的pH顯著偏高（P＜0.05），這是由于甘蔗渣含量的增加，提升了青貯中總碳水化合物的含量（表3），使青貯中的緩沖能較高，進(jìn)而提升了pH[27]。高甘蔗渣添加組降低了乳酸含量，同時(shí)使揮發(fā)性氨態(tài)氮的比例升高，這是由于甘蔗渣中可發(fā)酵糖分含量較低，減少了合成乳酸的原料。隨著甘蔗渣比例的增大，精飼料部分的麩皮所占比例增加，導(dǎo)致了在發(fā)酵中可分解蛋白質(zhì)增加，進(jìn)而提升了揮發(fā)性氨態(tài)氮比例。甘蔗渣中過高的纖維含量抑制了瘤胃內(nèi)的干物質(zhì)消化率[28]，因此，在幾個(gè)處理組中，F(xiàn)TMR中甘蔗渣的添加量與干物質(zhì)消化率呈現(xiàn)了負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。瘤胃產(chǎn)氣是伴隨著日糧消化逐漸產(chǎn)生的，本研究中，F(xiàn)TMR的干物質(zhì)消化率與產(chǎn)氣量呈相同趨勢(shì)，這也再次表明，甘蔗渣在瘤胃內(nèi)不易被消化，在生產(chǎn)應(yīng)用過程中，要考慮其添加比例和加工方式。

3.2 糖蜜添加對(duì)FTMR品質(zhì)和消化率的影響

糖蜜中的水溶性碳水化合物（WSC）可以被乳酸菌直接利用，進(jìn)而快速發(fā)酵達(dá)到發(fā)酵穩(wěn)定[29]，在青貯發(fā)酵過程中，糖蜜提供了可發(fā)酵糖用于生產(chǎn)更多有機(jī)酸[30]，進(jìn)而提升了發(fā)酵品質(zhì)和動(dòng)物適口性。本試驗(yàn)中，糖蜜的添加降低了NDF含量，這與陶蓮等[31]的結(jié)果一致，甘蔗渣中含有較高的木質(zhì)素和半纖維素，添加糖蜜后，良好的發(fā)酵環(huán)境促進(jìn)降解部分纖維，但由于在青貯環(huán)境中并沒有對(duì)降解纖維效果顯著的酶類活動(dòng)，所以其降解程度相對(duì)較低[32]，另一方面，糖蜜添加后使pH進(jìn)一步降低，導(dǎo)致了細(xì)胞壁碳水化合物發(fā)生酸水解[33]，而進(jìn)一步促使NDF降低。本試驗(yàn)中，添加糖蜜后顯著提升了乙酸和丙酸并抑制了丁酸產(chǎn)量。乙酸主要來(lái)源于乙酸菌或異型發(fā)酵乳酸菌[34]，這表明了在發(fā)酵過程中可能含有較多的異型發(fā)酵乳酸菌，這可以有效提高青貯有氧穩(wěn)定性。丙酸主要由丙酸菌發(fā)酵乳酸而產(chǎn)生，其含量不影響發(fā)酵品質(zhì)，但可顯著降低發(fā)酵后的pH，這在本研究中也再次得到驗(yàn)證[35]。此外，本試驗(yàn)中，添加糖蜜并沒有顯著提升乳酸含量，這是因?yàn)樵贔TMR中已經(jīng)有充足的可發(fā)酵糖[36]。糖蜜處理增加了FTMR的干物質(zhì)消化率和產(chǎn)氣（表5），這與Shellito等[37]和Sahoo等[38]的研究結(jié)果相同，這是由于糖蜜增加了碳水化合物含量，為瘤胃微生物提供了良好的環(huán)境，提升了其活性，促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化。Cao等[36]的研究結(jié)果顯示，糖蜜可以顯著降低體外培養(yǎng)后瘤胃液的丁酸含量，但這一現(xiàn)象并沒有得到進(jìn)一步解釋，本試驗(yàn)中，糖蜜沒有顯著影響丁酸含量，我們猜測(cè)這可能與日糧發(fā)酵品質(zhì)和瘤胃微生物組成等存在關(guān)聯(lián)，這個(gè)現(xiàn)象有待進(jìn)一步探明。

3.3 互作效應(yīng)

FTMR中的CA、揮發(fā)性氨態(tài)氮含量表現(xiàn)出了顯著的互作效應(yīng)，在5%甘蔗渣處理下，二者的含量沒有受到來(lái)自糖蜜添加的影響，這個(gè)現(xiàn)象不能完全被解釋，但可能與FTMR的發(fā)酵效果以及青貯內(nèi)部環(huán)境存在關(guān)聯(lián)，特別是揮發(fā)性氨態(tài)氮含量可能受到青貯中微生物分解蛋白的效率的影響[19]，這將在未來(lái)研究中深入討論。

4 結(jié)論

甘蔗渣營(yíng)養(yǎng)成分含量較低，作為反芻動(dòng)物日糧添加到FTMR中會(huì)降低發(fā)酵品質(zhì)，并降低總?cè)占Z的干物質(zhì)消化率，但在添加糖蜜后，會(huì)提升發(fā)酵品質(zhì)和干物質(zhì)消化率，因此，甘蔗渣在FTMR利用過程，應(yīng)適當(dāng)補(bǔ)充促發(fā)酵的添加劑（如糖蜜）。此外，由于甘蔗渣適口性較差，不宜過多添加，在FTMR產(chǎn)品生產(chǎn)中，5%的添加量相對(duì)適宜。