張 晗 李萬(wàn)婷 石海龍 李 琰

(紹興文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，浙江 紹興 312000)

0 引言

ROS包括一系列的氧自由基和非自由基型ROS.在正常的生理?xiàng)l件下，ROS在生物體系中可通過(guò)很多刺激因素生成，但在抗氧化酶的作用下，它又會(huì)被反應(yīng)消耗掉從而保持著一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡[1].作為信號(hào)分子的一種，ROS被證實(shí)可以參與很多細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程，對(duì)維持機(jī)體正常的生理功能至關(guān)重要[2].而另一方面，細(xì)胞內(nèi)ROS的生成一旦超負(fù)荷，會(huì)導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)等很多細(xì)胞重要大分子的結(jié)構(gòu)破壞、功能紊亂，觸發(fā)氧化還原敏感的細(xì)胞死亡信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制甚至死亡[3].研究表明，癌細(xì)胞具有線粒體功能缺陷、無(wú)限制增殖、新血管快速形成、向其他組織轉(zhuǎn)移等惡性特征.為了滿足其快速失控的生長(zhǎng)所需要的能量供給，癌細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)相比正常細(xì)胞發(fā)生了明顯的變化，其ROS的水平明顯升高.因此破壞細(xì)胞抗氧化的能力或增加細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的程度，對(duì)于癌細(xì)胞來(lái)說(shuō)顯得更加致命[4].癌細(xì)胞與正常細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的不同成為癌細(xì)胞的一大致命弱點(diǎn)，也成為通過(guò)促ROS生成的策略來(lái)實(shí)現(xiàn)癌癥治療的依據(jù).這一新的抗癌策略受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注和認(rèn)同.即利用促氧化劑誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，破壞癌細(xì)胞正常生長(zhǎng)增殖所依賴的氧化還原調(diào)控能力，使癌細(xì)胞先于正常細(xì)胞到達(dá)死亡線，而正常細(xì)胞由于其較低的ROS本底水平而免受其害[4].

據(jù)報(bào)道，很多導(dǎo)致細(xì)胞功能異常，細(xì)胞周期紊亂及凋亡從而殺死癌細(xì)胞的毒性試劑都是通過(guò)誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生來(lái)發(fā)揮作用的，包括常用的化療試劑如市售的抗癌藥5-氟尿嘧啶[5]和紫杉醇[6].更有意思的是，在基于ROS的抗癌藥物中，很多都含有Michael受體單元.Michael受體作為親電試劑可以靶向很多細(xì)胞防御體系的功能蛋白，包括負(fù)責(zé)機(jī)體防御反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及腫瘤生長(zhǎng)抑制過(guò)程信息傳遞的NF-κB或負(fù)責(zé)維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的硫氧還蛋白還原酶等.Michael受體單元可與靶蛋白功能區(qū)域的巰基(-SH)殘基發(fā)生共價(jià)加成反應(yīng)破壞其功能性，或通過(guò)蛋白半胱氨酸上-SH和其二硫鍵(-S-S-)的轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)對(duì)靶蛋白的氧化修飾，導(dǎo)致氧化還原體系的破壞，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.因此含有Michael受體單元(a,b-不飽和酮)藥效團(tuán)的親電小分子已成為近年來(lái)抗癌藥物研究的一大熱點(diǎn)[7].例如姜黃素[8]、二甲基富馬酸[9]、肉桂醛[10]、6-姜烯酚[11]、小白菊內(nèi)酯[12]及蓽茇酰胺[13]等含有a,b-不飽和酮結(jié)構(gòu)的天然來(lái)源的親電小分子都可通過(guò)促進(jìn)ROS的生成而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡.尤其是小白菊內(nèi)酯和蓽茇酰胺都具有非常優(yōu)越的癌細(xì)胞選擇性，不阻滯正常細(xì)胞的生長(zhǎng)[12-13]，這也進(jìn)一步證實(shí)了利用癌細(xì)胞的氧化還原缺陷來(lái)選擇性殺死癌細(xì)胞的策略具有合理性[4].

喹唑啉雜環(huán)是很多藥物結(jié)構(gòu)中重要的核心骨架，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等非常廣譜的生理活性[14].在近年來(lái)基于喹唑啉骨架的藥物優(yōu)化設(shè)計(jì)工作中也發(fā)現(xiàn)了很多具有促氧化作用的喹唑啉類抗癌先導(dǎo)化合物[15].QNZ(圖1)也是一種喹唑啉類化合物，由于其優(yōu)異的NF-κB抑制活性而成為明星分子[16]，最近的研究發(fā)現(xiàn)它同時(shí)具有抗癌細(xì)胞增殖的活性[17].抗癌藥物阿法替尼也有著與QNZ相同的喹唑啉母環(huán)結(jié)構(gòu)(如圖1)，并且在喹唑啉環(huán)的6位具有一個(gè)Michael受體單元，Michael受體單元的存在對(duì)其不可逆地抑制表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)起著重要的作用.這引起了我們對(duì)這一喹唑啉母環(huán)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步修飾的極大興趣.

本文基于NF-κB抑制劑QNZ與EGFR抑制劑阿法替尼的結(jié)構(gòu)共性，通過(guò)分子骨架雜合，設(shè)計(jì)合成一種新型親電分子QNZ-Afa(圖1).

圖1 QNZ、阿法替尼及化合物QNZ-Afa的分子結(jié)構(gòu)

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料及所用儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)(MTT)、2′,7′-二氯熒光黃(DCFH-DA)等購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich有限公司；凋亡試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司；人宮頸癌細(xì)胞(Hela)、人肝癌細(xì)胞(HepG2)及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)；其他試劑均為分析純以上級(jí)別.Bruker AV 400核磁共振儀(瑞士布魯克拜厄斯賓)；SX-500高壓滅菌鍋(日本Tomy Digital)；5430R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)艾本德)；FACSCanto流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD)；CryoCube F570h超低溫冰箱(德國(guó)艾本德)；SB-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)海道夫)；真空干燥箱(上海一恒)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒)；RCT磁力攪拌器(IKA公司，德國(guó))；Infinite M200酶標(biāo)儀(瑞士Tecan).

1.2 化合物QNZ-Afa的合成

化合物QNZ-Afa可根據(jù)圖2中所示的路線進(jìn)行合成，具體步驟如下：

圖2 化合物QNZ-Afa的合成路線

叔丁基(4-羥基苯乙基)氨基甲酸酯(2)[18]

首先將4-(2-氨乙基)苯酚(1，0.15 mol)溶解于200 mL四氫呋喃中，并依次加入碳酸氫鈉(0.3 mol)和二碳酸二叔丁酯(0.165 mol)，于室溫下攪拌過(guò)夜.反應(yīng)液過(guò)濾后得到淺棕色的粗產(chǎn)物2，不再分離純化，待用.

叔丁基(4-苯氧基苯乙基)氨基甲酸酯(3)[18]

將化合物2(0.15 mol)溶解于400 mL干燥的乙腈中，并在O2氛下于室溫中依次加入苯基硼酸(0.225 mol)、吡啶(1.5 mol)及無(wú)水醋酸銅(0.15 mol).反應(yīng)液在35 ℃下攪拌過(guò)夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑.將得到的固體殘?jiān)匦氯苡?00 mL乙酸乙酯，攪拌2 h后過(guò)濾，收集濾液，依次用氨水(33%，100 mL)、純水(200 mL)、鹽酸溶液(6 N，150 mL)和飽和食鹽水(50 mL)洗兩次，用無(wú)水NaSO4干燥，過(guò)濾后旋干.得到的固體粗產(chǎn)物再經(jīng)過(guò)柱層析(石油醚/乙酸乙酯，100/1至10/1)分離純化得到白色固體氨基甲酸酯3(產(chǎn)率86.7%).

2-(4-苯氧基)苯乙胺(4)[18]

將化合物3(0.10 mol)溶于60 mL乙酸乙酯，并于室溫下逐滴加入60 mL三氟乙酸，然后回流12 h.旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后，加入500 mL二氯甲烷和200 mL水溶解反應(yīng)殘?jiān)?，向此兩相體系中緩慢加入碳酸鈉直至無(wú)明顯的氣泡生成，此時(shí)pH≈10.水相用200 mL二氯甲烷進(jìn)行萃取，合并所有有機(jī)相，洗滌(飽和食鹽水)，無(wú)水NaSO4干燥，過(guò)濾后旋干.得到的固體粗產(chǎn)物再經(jīng)過(guò)柱層析(二氯甲烷/甲醇，50/1至30/1)分離純化得到淺黃色油狀產(chǎn)物4(產(chǎn)率91.3%).

6-硝基-4-(4-苯氧基苯乙氨基)喹唑啉(5)[18]

將化合物(0.09 mol)、4-氯-6-硝基喹唑啉(0.086 mol)及三乙胺(0.129 mol)溶解于異丙醇，并分別在室溫下攪拌4 h，在15 ℃下攪拌4 h.過(guò)濾得到反應(yīng)沉淀物，依次用冷的異丙醇/水(5/1，100 mL)和異丙醇(50 mL)進(jìn)行洗滌，真空干燥后得到黃色結(jié)晶狀固體硝基喹唑啉5(產(chǎn)率84.8%).

6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙氨基)喹唑啉(QNZ)[18]

將化合物5(0.073 mol)溶解于400 mL四氫呋喃中，并在氫氣氛下向溶液中添加催化量的Pd/C(5%).反應(yīng)液在室溫下攪拌5 h，過(guò)濾除去Pd/C，收集濾液并濃縮，得到的固體殘余物在乙酸乙酯中進(jìn)行重結(jié)晶，得到淺黃色粉末狀固體產(chǎn)物QNZ(產(chǎn)率89.3%).

6-(4-溴巴豆酰氨基)-4-(4-苯氧基苯乙氨基)喹唑啉(6)

將4-溴巴豆酸(0.073 mol)溶解于20 mL干燥的二氯甲烷中，室溫下加入草酰氯(0.08 mol)，滴加2滴N,N-二甲基甲酰胺，繼續(xù)攪拌0.5 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后，得到4-溴巴豆酰氯，待用.將化合物QNZ(0.56 mmol)和三乙胺(1.12 mmol)溶于5 mL干燥的四氫呋喃和1 mL N,N-二甲基甲酰胺的混合溶劑中，在0 ℃磁力攪拌下滴加現(xiàn)制的4-溴巴豆酰氯(0.73 mmol)，升高溫度至室溫，并繼續(xù)攪拌0.5 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑.得到的固體粗產(chǎn)物經(jīng)過(guò)柱層析(二氯甲烷/甲醇，50/1至25/1)分離純化得到淺黃色粉末狀固體產(chǎn)物6(產(chǎn)率66.3%).

6-(4-二甲氨基巴豆酰氨基)-4-(4-苯氧基苯乙胺基)喹唑啉(QNZ-Afa)

將化合物6(0.33 mmol)和鹽酸二甲胺(0.39 mmol)溶解于4 mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入三乙胺(0.99 mmol)，室溫下攪拌3 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后，得到的粗產(chǎn)物經(jīng)過(guò)柱層析(二氯甲烷/甲醇，50/1至10/1)分離純化得到淺黃色粉末狀固體產(chǎn)物QNZ-Afa(產(chǎn)率56.4%).

QNZ-Afa：熔點(diǎn)131.4～132.0 ℃；1H NMR(400 MHz,DMSO-d6),δ2.21(s,6H),2.95-2.99(t,J=7.2 Hz,2H),3.10-3.12(d,J=5.6 Hz,2H),3.76-3.78(d,J=7.2 Hz,2H),6.35-6.39(d,J=15.6 Hz,1H),6.78-6.85(m,1H),6.95-6.99(t,J=7.6 Hz,4H),7.10-7.14(t,J=7.6 Hz,1H),7.29-7.30(d,J=8.8 Hz,2H),7.36-7.40(m,2H),7.66-7.68(d,J=9.2 Hz,1H),7.73-7.76(m,1H),8.30-8.32(t,J=5.2 Hz,1H),8.43(s,1H),8.59-8.60(d,J=1.2 Hz,1H),10.38(s,1H);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6),δ34.3(1C),42.7(1C),45.5(2C),60.1(1C),112.1(1C),115.5(1C),118.7(2C),119.3(2C),123.6(1C),126.3(1C),126.8(1C),128.5(1C),130.4(2C),130.7(2C),135.3(1C),136.6(1C),142.0(1C),146.3(1C),154.5(1C),155.2(1C),157.5(1C),159.4(1C),163.7(1C);MS(ESI)M/Z468[M+H]+.

1.3 化合物QNZ-Afa對(duì)癌細(xì)胞增殖抑制活性的測(cè)定

采用MTT比色法測(cè)定化合物QNZ-Afa對(duì)癌細(xì)胞的增殖抑制活性.將Hela或HepG2細(xì)胞以3×103個(gè)/孔，HUVEC細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度分別種于96孔板中，37 ℃孵育過(guò)夜后加入一定濃度梯度(0、5 mM、10 mM、15 mM、20 mM、25 mM、30 mM、40 mM、50 mM)的QNZ-Afa，同時(shí)設(shè)定不加藥處理的對(duì)照孔，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入100 mL MTT，37 ℃下作用4 h.棄去MTT培養(yǎng)液，每孔加入100 mL色譜純的DMSO，混勻5 min，使生成的有色結(jié)晶溶于DMSO中.通過(guò)酶標(biāo)儀在570 nm處進(jìn)行吸光度值的檢測(cè).抗氧化劑對(duì)QNZ-Afa細(xì)胞增殖抑制活性的影響也采用相同的MTT法測(cè)定，抗氧化劑處理組需提前1 h加入NAC(10 mM)或VE(500 mM)，再加入指定濃度的待測(cè)化合物孵育48 h.細(xì)胞存活率表示為相對(duì)于對(duì)照組的百分比，計(jì)算公式如下：細(xì)胞存活率(%)=加藥組吸光度值/對(duì)照組吸光度值×100%.每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次.

1.4 細(xì)胞凋亡的測(cè)定

本文采用Annexin V-PI雙染色法測(cè)定化合物誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的能力.將Hela細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度種至六孔板，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后換液，加入化合物QNZ-Afa(5 mM、10 mM、15 mM)，孵育48 h，同時(shí)設(shè)定不加藥處理的對(duì)照孔.藥物處理后吸出培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶消化并分別收集各孔細(xì)胞于2 mL的離心管中，250 g轉(zhuǎn)速離心6 min除去培養(yǎng)基后，用4 ℃預(yù)冷的PBS緩沖液(1 mL/管)以相同轉(zhuǎn)速離心洗1～2次.對(duì)每管中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果用稀釋至1×的Binding緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度，每管中分別取兩份進(jìn)行Annexin V與PI的單染.室溫下染色15 min，然后加入1×的Binding緩沖液稀釋，并于1 h內(nèi)通過(guò)FACSCanto流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，每管采集細(xì)胞數(shù)104個(gè)，激發(fā)波488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm.通過(guò)FACSDiva軟件分析得到細(xì)胞不同狀態(tài)的比例.抗氧化劑對(duì)QNZ-Afa誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的影響也采用相同的方法測(cè)定，抗氧化劑處理組需要提前加入NAC(10 mM)預(yù)處理1 h，再加入15 mM的QNZ-Afa孵育48 h，同時(shí)設(shè)定抗氧化劑處理后不加藥的對(duì)照孔.每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次.

1.5 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的測(cè)定

熒光探針DCFH-DA具有細(xì)胞膜滲透性，它進(jìn)入細(xì)胞后可在細(xì)胞酯酶的作用下水解得到不可透膜的DCFH，水解產(chǎn)物被胞內(nèi)ROS氧化生成DCF.DCF是熒光物質(zhì)，其熒光強(qiáng)度的大小就可反映細(xì)胞內(nèi)ROS的濃度.將Hela細(xì)胞以3×105個(gè)/孔的密度種至六孔板中，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后換液，加入化合物QNZ-Afa(5 mM、10 mM、15 mM)，藥物作用3 h、6 h或9 h后吸出培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶消化并分別收集各孔細(xì)胞于2 mL離心管中，250 g離心6 min除去培養(yǎng)基后用PBS緩沖液(1 mL/管)以相同轉(zhuǎn)速離心洗1～2次，然后加入DCFH-DA染料(終濃度為3 mM)，置于37 ℃溫箱中避光染色0.5 h.用PBS緩沖液洗去殘余染料后通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè).所測(cè)熒光的激發(fā)波為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm.抗氧化劑對(duì)QNZ-Afa誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響也采用相同的方法測(cè)定，抗氧化劑處理組需要提前加入NAC(10 mM)或VE(500 mM)預(yù)處理1 h，再加入15 mM的QNZ-Afa孵育9 h，同時(shí)設(shè)定抗氧化劑處理后不加藥的對(duì)照孔.結(jié)果相對(duì)于對(duì)照組進(jìn)行歸一化處理.每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次.

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的合成

基于喹唑啉類抗癌藥物QNZ與阿法替尼的結(jié)構(gòu)共性，通過(guò)分子骨架雜合，設(shè)計(jì)合成了一種新型親電分子QNZ-Afa(圖1)，以4-(2-氨乙基)苯酚為原料通過(guò)圖2所示的合成路線首先合成化合物QNZ，再與4-溴巴豆酰氯反應(yīng)得到a,b-不飽和酰胺結(jié)構(gòu)，最后引入二甲氨基，得到目標(biāo)化合物QNZ-Afa.

2.2 QNZ-Afa通過(guò)ROS依賴的方式選擇性地抑制癌細(xì)胞增殖

通過(guò)MTT法測(cè)定了化合物QNZ-Afa對(duì)Hela、HepG2及HUVEC的細(xì)胞增殖抑制活性，如圖3A所示，化合物作用48 h后，細(xì)胞存活率都表現(xiàn)出濃度依賴的降低.QNZ-Afa對(duì)Hela、HepG2及HUVEC三種細(xì)胞增殖抑制的IC50值分別為10.8 mM、16.7 mM和23.2 mM，從結(jié)果可知，QNZ-Afa在正常細(xì)胞HUVEC中表現(xiàn)出最小的細(xì)胞毒性，說(shuō)明癌細(xì)胞相比于正常細(xì)胞更容易受到QNZ-Afa的毒性影響而被殺死，尤其Hela細(xì)胞對(duì)QNZ-Afa的耐受性最弱(圖3A).

基于QNZ-Afa對(duì)Hela細(xì)胞明顯的選擇性，采用Hela細(xì)胞作為模型進(jìn)一步對(duì)其細(xì)胞毒性機(jī)制進(jìn)行了研究.ROS是導(dǎo)致癌細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯并死亡的重要誘因之一.通過(guò)使用兩種ROS清除劑，N-乙酰半胱氨酸(NAC)和a-生育酚(VE)來(lái)闡明ROS在QNZ-Afa的毒性機(jī)制中是否發(fā)揮作用.如圖3B所示，NAC預(yù)處理1 h導(dǎo)致QNZ-Afa對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用被完全逆轉(zhuǎn).NAC是含有巰基的抗氧化劑，它們既可利用抗氧化活性清除ROS，也可以作為親核試劑與QNZ-Afa發(fā)生反應(yīng)從而消除其Michael加成活性位點(diǎn).相比之下，非親核性的VE只能作為抗氧化劑發(fā)揮作用，而VE預(yù)處理1 h后對(duì)QNZ-Afa抗癌細(xì)胞增殖的活性也表現(xiàn)出顯著的抑制效果.上述結(jié)果清晰地表明：ROS的產(chǎn)生對(duì)QNZ-Afa的細(xì)胞毒性起著至關(guān)重要的作用，而另一方面，Michael受體單元在這一過(guò)程中也作出了一定貢獻(xiàn).

2.3 QNZ-Afa通過(guò)ROS依賴的方式誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡

抑制細(xì)胞增殖導(dǎo)致細(xì)胞死亡的機(jī)制有很多種，通過(guò)PI染色及Annexin-V-FITC/PI雙染的方法探究了QNZ-Afa的增殖抑制活性是否來(lái)自于細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用.從圖4可以看出，不同濃度的QNZ-Afa處理48 h后顯著地誘導(dǎo)了Hela細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并且具有濃度依賴關(guān)系，15 mM的QNZ-Afa使細(xì)胞凋亡的比例超過(guò)了65%.ROS清除劑NAC預(yù)處理后可明顯地逆轉(zhuǎn)QNZ-Afa所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而NAC單獨(dú)作用不會(huì)引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生.這與細(xì)胞毒性測(cè)定中得到的結(jié)果相一致.以上結(jié)果也證實(shí)了QNZ-Afa誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是其細(xì)胞增殖抑制活性機(jī)制的重要部分，并且這個(gè)過(guò)程中ROS扮演著重要的角色.

2.4 QNZ-Afa誘導(dǎo)Hela細(xì)胞中ROS的大量產(chǎn)生

基于前期實(shí)驗(yàn)所證實(shí)的ROS的重要作用，采用流式細(xì)胞儀對(duì)Hela細(xì)胞內(nèi)ROS的水平進(jìn)行了檢測(cè).結(jié)果如圖5所示，化合物QNZ-Afa能顯著地誘導(dǎo)Hela細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，ROS水平隨著濃度的增大而升高，從不同時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)可以看出ROS的產(chǎn)生有時(shí)間依賴性.15 μM的QNZ-Afa作用9 h后可將細(xì)胞內(nèi)ROS的水平提升到對(duì)照組水平的3.5倍.

圖5 QNZ-Afa作用后Hela細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化及抗氧化劑NAC、VE對(duì)QNZ-Afa誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS累積的影響

值得注意的是，采用NAC或者VE都會(huì)導(dǎo)致QNZ-Afa促進(jìn)ROS生成的能力大大削弱甚至喪失，在抗氧化劑的預(yù)孵育1 h后，同樣作用9 h，15 μM的QNZ-Afa對(duì)細(xì)胞內(nèi)的ROS的水平幾乎沒(méi)有影響(圖5).而抗氧化劑NAC或VE單獨(dú)預(yù)處理1 h后以不含QNZ-Afa的培養(yǎng)基孵育相同時(shí)間，測(cè)得的胞內(nèi)ROS含量與對(duì)照組也無(wú)明顯變化(圖5).上述結(jié)果表明，QNZ-Afa的促氧化能力很大程度上貢獻(xiàn)了其細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的活性，并且Michael受體單元也起到了必不可少的作用.

3 總結(jié)

本文基于NF-κB抑制劑QNZ與EGFR抑制劑阿法替尼的結(jié)構(gòu)共性，通過(guò)分子骨架雜合，設(shè)計(jì)合成了一種新型喹唑啉類親電分子QNZ-Afa.并首次證實(shí)QNZ-Afa是一種優(yōu)異的選擇性抗癌試劑，它可以選擇性地阻滯Hela細(xì)胞的增殖，而對(duì)正常細(xì)胞HUVEC的細(xì)胞毒性卻大大減弱.抗氧化劑NAC或VE對(duì)QNZ-Afa抗癌細(xì)胞增殖能力的逆轉(zhuǎn)作用明確地表明了ROS在QNZ-Afa對(duì)Hela細(xì)胞增殖抑制的活性機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用.值得一提的是，與非親核性抗氧化劑VE不同，作為含有巰基的抗氧化劑，NAC既可作為抗氧化劑清除ROS也可以作為親核試劑與QNZ-Afa發(fā)生反應(yīng)從而消除其Michael加成活性位點(diǎn).相比VE，NAC能更徹底地消除QNZ-Afa對(duì)Hela細(xì)胞的增殖抑制活性.這一結(jié)果清晰地表明：ROS的產(chǎn)生對(duì)QNZ-Afa的細(xì)胞毒性有著很大的貢獻(xiàn)，且Michael受體單元在其中也作出了一定貢獻(xiàn).另一方面，細(xì)胞凋亡的發(fā)生是QNZ-Afa抑制Hela細(xì)胞增殖的關(guān)鍵原因，而在這一過(guò)程中，Michael受體依賴的ROS的產(chǎn)生也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用.同時(shí)，也證實(shí)了QNZ-Afa作用后的確可以顯著地引起Hela細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高，并且NAC與VE均可以完全逆轉(zhuǎn)QNZ-Afa誘導(dǎo)的ROS累積，這也進(jìn)一步支持了ROS作為細(xì)胞凋亡重要調(diào)控者的結(jié)論.綜上所述，本文設(shè)計(jì)了一種新型喹唑啉類化合物QNZ-Afa，并發(fā)現(xiàn)它通過(guò)Michael受體依賴的促氧化作用而表現(xiàn)出選擇性的抗癌活性.QNZ-Afa可作為親電分子靶向癌細(xì)胞氧化還原缺陷，誘導(dǎo)Hela細(xì)胞內(nèi)ROS的大量累積進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡體系的崩潰，ROS升高，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.以上結(jié)論可為基于促氧化策略設(shè)計(jì)喹唑啉類抗癌試劑提供有價(jià)值的依據(jù).