曲 寅 張 涵 張艷昕 章曉棟 沈文英

(紹興文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 紹興 312000)

隨著規(guī)?；呙芏人a(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展，養(yǎng)殖水體中的有機(jī)物、氨氮、亞硝酸鹽氮等污染物的濃度不斷累積升高，導(dǎo)致水質(zhì)惡化，養(yǎng)殖動(dòng)物病害頻繁發(fā)生，養(yǎng)殖水體生態(tài)遭到嚴(yán)重破壞，水產(chǎn)品品質(zhì)下降[1].亞硝酸鹽含量升高，說明池塘底部缺氧，養(yǎng)殖水質(zhì)惡化，同時(shí)也是水生動(dòng)物發(fā)病的前期征兆[2].亞硝酸鹽是三態(tài)氮(氨氮-亞硝酸鹽-硝酸鹽)的中間形態(tài)，受微生物的作用而活化，是一種不穩(wěn)定的形式，在溶解氧充足時(shí)可轉(zhuǎn)化為無毒的硝酸鹽，而在缺氧的條件下轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的氨[3].與物理去氮、化學(xué)去氮相比，生物去氮被認(rèn)為是一種經(jīng)濟(jì)、有效和最有發(fā)展前途的方法，具有工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、較易推廣等特點(diǎn)[4].

中華鱉(Trionyxsinensis)，俗稱甲魚，是我國(guó)重點(diǎn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物之一[5]，主要采用高密度池塘養(yǎng)殖模式.在中華鱉養(yǎng)殖后期，養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮等污染物的濃度增加[6-7]，水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病的發(fā)生率也增加[1].本試驗(yàn)從高密度中華鱉養(yǎng)殖水體中篩選出降亞硝酸鹽氮的好氧反硝化菌種[8]，分析了其降亞硝酸鹽氮效果及其最適培養(yǎng)條件，為進(jìn)一步研制降亞硝酸鹽氮微生物制劑提供試驗(yàn)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用中華鱉高密度養(yǎng)殖池水樣取自紹興大畈水產(chǎn)合作社(浙江，紹興).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 好氧反硝化菌的篩選

菌落的分離與培養(yǎng)：水樣用PBS緩沖液進(jìn)行梯度稀釋至原液的1、10、100和1 000倍，取200 μL均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)挑取100個(gè)生長(zhǎng)良好的單菌落接種于液體營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)基中，于180 rpm,37 ℃培養(yǎng)24 h.按照1%的接種量，將菌種接種到以亞硝酸鈉為氮源的液體培養(yǎng)基中，于180 r/min，37 ℃培養(yǎng)24 h，通過定性顯色反應(yīng)檢測(cè)不同菌株利用亞硝酸鹽氮的情況.

定性顯色反應(yīng)：培養(yǎng)液用亞硝酸鹽顯色劑點(diǎn)樣，若顯示紅色說明培養(yǎng)液中存在亞硝酸鹽氮，顏色越深濃度越大.若不顯示紅色說明培養(yǎng)基中不存在亞硝酸鹽氮，定性地鑒定該菌種可以消除培養(yǎng)基中亞硝酸鹽氮.顯色初篩之后通過N-(1-萘基)-乙二胺光度法測(cè)定亞硝酸鹽含量，計(jì)算亞硝酸鹽氮的消除率.

1.2.2 好氧反硝化菌的鑒定

采用16S rDNA序列鑒定方法鑒定菌種.用試劑盒法提取篩選獲得的菌株DNA，采用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(50 μL)為：10×Buffer5.0 μL，上下游引物各1.0 mL,dNTP4.0 μL，Taq酶0.5 μL，模板1.0 μL，dd H2O37.5 μL；反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃，變性50 s，52 ℃退火60 S，72 ℃延伸1 min30 s，共30個(gè)循環(huán).對(duì)陽性克隆的片段進(jìn)行測(cè)序(上海，生工生物有限公司)，測(cè)序結(jié)果與GenBank中的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析.

1.2.3 亞硝酸還原酶鑒定

以菌株DNA為模板，根據(jù)Genbank上亞硝酸還原酶基因nirS、nirK全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增.nirS F:5-ATGAGCAATGT(T/C)GGTAAACCTA-3，nirS R：5-TCAACACCATG(A/C)ACGACGTGTACTAA-3；nirK1 F:5-GGMATGGTKCCSTGGCA-3，nirK5 R：5-GCCTCGATCAGRTTRTGG-3.PCR反應(yīng)體系(50 μL)為：10×Buffer5.0 μL，正反向引物各2.0 μL，dNTP4.0 μL，Taq酶0.5 μL，模板1.0 μL，ddH2O35.5 μL；PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性40 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，反應(yīng)10個(gè)循環(huán)；94 ℃變性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，反應(yīng)22個(gè)循環(huán)；重組克隆菌進(jìn)行序列雙向測(cè)定(上海，生工生物有限公司)，測(cè)序結(jié)果采用BLAST程序進(jìn)行同源性檢索.

1.2.4 最適培養(yǎng)條件篩選

取-80 ℃保存的菌株活化擴(kuò)大培養(yǎng)，按1%的接種量接種至不同培養(yǎng)基.以亞硝酸鹽為氮源、檸檬酸鈉為碳源，設(shè)置不同初始亞硝酸鹽氮濃度、碳氮比、溫度和pH值篩選好氧反硝化菌的最適生長(zhǎng)和降亞硝酸鹽氮效果的培養(yǎng)條件.初始亞硝酸鹽氮濃度分別為10、20、40、60、80、100、120、140 mg/L，C/N分別為2、4、6、8、10、12，培養(yǎng)溫度分別為20、25、30、35 ℃，pH分別為5、6、7、8、9.每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù).培養(yǎng)24 h，取0 h和24 h菌液各10 mL，測(cè)定OD600，計(jì)算菌種生長(zhǎng)值.其余菌液于8 000 r/min離心5 min，取上清測(cè)亞硝酸鹽的濃度，計(jì)算亞硝酸鹽氮消除率.

1.2.5 養(yǎng)殖污水試驗(yàn)

取NO2-N濃度為5 mg/L的水產(chǎn)養(yǎng)殖污水，將菌株活化，按照最適培養(yǎng)條件培養(yǎng)獲得濃度為108CFU/mL的菌液，以1∶1 000的比例投入模擬污水中，設(shè)置對(duì)照組，水體不添加任何菌液，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù).分別于實(shí)驗(yàn)第2 d、5 d，用N-(1-萘基)-乙二胺光度法測(cè)定水體中亞硝酸鹽氮濃度.

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因子多重分析，P<0.05表示存在顯著性差異.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 養(yǎng)殖水體好氧反硝化菌的篩選

顯色鑒定結(jié)果表明，有8個(gè)菌株具有轉(zhuǎn)化亞硝酸鹽氮的能力，培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)基中亞硝酸鹽氮消除率均達(dá)到98%以上，顯著高于對(duì)照組消除率(65.50%).

2.2 好氧反硝化菌的鑒定

通過16S rDNA序列鑒定分析，具有降解亞硝酸鹽氮菌株為肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae).核酸序列相似性均為99%.

2.3 亞硝酸還原酶基因的鑒定

通過對(duì)肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的亞硝酸還原酶基因的nirS、nirK進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明該菌為nirS+、nirK-菌.對(duì)擴(kuò)增得到的nirS片段部分測(cè)序，并與GenBank其他細(xì)菌的nirS序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，基因同源性達(dá)99%.

2.4 最適生長(zhǎng)和降亞硝酸鹽氮效果的培養(yǎng)條件篩選

以NaNO2為氮源、以檸檬酸鈉為碳源，對(duì)肺炎克雷伯菌進(jìn)行最適培養(yǎng)條件優(yōu)化.結(jié)果表明：肺炎克雷伯菌最適培養(yǎng)條件：初始氮濃度為80 mg/L，碳氮比為10，溫度為35 ℃，pH為6-7(見圖1、圖2).

圖1 不同培養(yǎng)條件肺炎克雷伯菌的生長(zhǎng)值

圖2 不同培養(yǎng)條件肺炎克雷伯菌對(duì)亞硝酸鹽氮的消除率

2.5 好氧反硝化菌對(duì)模擬污水亞硝酸鹽氮含量的影響

利用肺炎克雷伯菌菌液處理水產(chǎn)養(yǎng)殖污水，第2 d、5 d添加菌液的實(shí)驗(yàn)組亞硝酸鹽氮的含量明顯降低(圖3)，且實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間均存在顯著性差異(P<0.05)；結(jié)果表明篩選得到的肺炎克雷伯菌能有效降低水體中亞硝酸鹽氮濃度.

圖3 降亞硝酸鹽菌對(duì)養(yǎng)殖污水亞硝酸鹽氮含量的影響

3 討論

多年來，我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖中養(yǎng)殖對(duì)象的活動(dòng)、攝食、排泄都在同一池塘中進(jìn)行，切斷了自然生態(tài)系統(tǒng)的食物鏈[5]，導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖的生態(tài)環(huán)境日趨惡化，氨氮和亞硝酸鹽超標(biāo)，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物產(chǎn)生毒害作用[6].1972年，首次有報(bào)道得到1株具有異養(yǎng)硝化能力的節(jié)細(xì)菌屬細(xì)菌(Arthrobactersp)[7].后來又發(fā)現(xiàn)糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenesfaecalis)[9]、施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)[10]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[11]等多個(gè)具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化的細(xì)菌.孫慶花等[12]從海底沉積物中分離篩選得到的1株耐鹽異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌被鑒定為肺炎克雷伯菌，研究表明，肺炎克雷伯菌具有良好的氮轉(zhuǎn)化功效[13]，在好氧條件下均能直接以NO3-N和NO2-N為底物進(jìn)行反硝化，并且亞硝酸鹽脫氮率高于硝酸鹽脫氮率[14].本實(shí)驗(yàn)從中華鱉養(yǎng)殖水體篩選出一株肺炎克雷伯菌，能以亞硝酸鹽為唯一氮源，利用亞硝酸還原酶，將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為NO或NO2.亞硝酸還原酶分為兩種，由nirS編碼的血紅素cd1型亞硝酸還原酶(cd1-NiR)和由nirK編碼的銅型亞硝酸還原酶(Cu-NiR)，在進(jìn)行反硝化的分子生態(tài)學(xué)研究中主要以nirS或nirK基因作為分子標(biāo)記.本實(shí)驗(yàn)從中華鱉養(yǎng)殖池篩選得到肺炎克雷伯菌，對(duì)菌種的亞硝酸還原酶基因進(jìn)行分析，nirS基因?yàn)殛栃?、nirK基因?yàn)殛幮?，表明該為nirS+，nirK-菌.

已報(bào)道的好氧反硝化菌中，能利用亞硝酸鹽氮為唯一氮源的很少.Wan等[15]研究表明，假單胞菌yy7隨著培養(yǎng)基中初始亞硝酸鹽氮濃度的增加，對(duì)亞硝酸鹽的去除率降低；當(dāng)初始亞硝酸鹽氮濃度為50 mg/L，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，亞硝酸鹽氮去除率小于50%.本實(shí)驗(yàn)中，在初始氮濃度從10 μg/L到80 μg/L時(shí)，肺炎克雷伯菌的生長(zhǎng)速率隨濃度的升高而增大，初始氮濃度在80 μg/L與140 μg/L時(shí)，菌株生長(zhǎng)速率無顯著差異.而在初始氮濃度為10 μg/L至120 μg/L時(shí)，肺炎克雷伯菌對(duì)亞硝酸鹽氮的利用率在47%左右，當(dāng)亞硝酸鹽濃度達(dá)到140 μg/L時(shí)，菌株對(duì)其的利用率提高了大約20%左右.說明氮濃度太低時(shí)，菌體沒有足夠的氮源，不能很好地生長(zhǎng)繁殖，脫氮能力低.因此，氮濃度在一定的范圍內(nèi)，菌株才能保持最高的脫氮能力.

C/N在反硝化過程中同樣起著很重要的作用，Cervantes等[16]認(rèn)為C/N是獲得高效反硝化效率的主要控制參數(shù).Kumar等[17]研究表明，當(dāng)生物反應(yīng)器的C/N為9∶3時(shí)，工業(yè)廢水反硝化率和總氮去除率達(dá)到最大值.本實(shí)驗(yàn)中碳氮比對(duì)肺炎克雷伯菌的生長(zhǎng)和脫氮效率的影響幾乎一致，在一定范圍內(nèi)，隨著碳氮比的增大，菌株的生長(zhǎng)速率增大，且脫氮效果變好，當(dāng)碳氮比達(dá)到10時(shí)，肺炎克雷伯菌的生長(zhǎng)和脫氮效率達(dá)到最佳.碳源缺乏會(huì)導(dǎo)致菌株的生長(zhǎng)繁殖受限，反硝化過程酶系合成不完全，使中間產(chǎn)物累積造成反硝化不徹底[18].同時(shí)反硝化關(guān)鍵酶硝酸鹽還原酶的表達(dá)受到碳源的影響，碳源消耗越多，其酶活性越高.因此作為能源的有機(jī)碳濃度越高，反硝化速率越快；碳源不足，易引起不完全反硝化，導(dǎo)致高濃度的硝酸鹽和亞硝酸鹽殘留[19].

閻勝利等[20]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)及反硝化活性最適溫度范圍是25 ℃～35 ℃，當(dāng)溫度超過這一范圍時(shí)，均會(huì)抑制細(xì)菌快速生長(zhǎng)及反硝化性能的正常發(fā)揮.施氏假單胞菌(Pseudomonusstutzeri)在4 ℃～45 ℃的范圍內(nèi)均能正常生長(zhǎng)，但在30 ℃時(shí)亞硝酸鹽利用率最高，達(dá)5.53 mg/(L·h)[10]；托拉假單胞菌(Pseudomonastolaasii)Y-11在15 ℃下可以在初始亞硝酸鹽氮質(zhì)量濃度高達(dá)209.62 mg/L的情況下以2.04 mg/(L·h)的速率去除93.6%氨氮[21].本研究結(jié)果表明，肺炎克雷伯菌在22 ℃至35 ℃的培養(yǎng)條件下，其生長(zhǎng)速率無顯著差異，但隨著溫度的升高，肺炎克雷伯菌對(duì)亞硝酸鹽氮的利用率相應(yīng)提高.可見，溫度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)及反硝化性能發(fā)揮有重要的影響，這可能與菌株生長(zhǎng)及反硝化酶的機(jī)制有關(guān)，需進(jìn)一步研究.

王宏宇等[22]對(duì)好氧反硝化菌株C3研究表明，pH為中性條件最有利于菌株生長(zhǎng)及反硝化性能的發(fā)揮.已有研究表明，細(xì)菌生長(zhǎng)及反硝化酶活性的最適pH為中性或微堿性，pH過高或過低均會(huì)對(duì)菌株生長(zhǎng)及反硝化性能的發(fā)揮產(chǎn)生影響[23].本實(shí)驗(yàn)中肺炎克雷伯菌在pH為6、7時(shí)，菌株生長(zhǎng)狀況良好且對(duì)亞硝酸鹽氮的利用率也高，在偏酸和偏堿的環(huán)境中，酶活性受到巨大影響，不利于其正常進(jìn)行反硝化作用[24].

4 結(jié)論

本研究篩選出具有降解亞硝酸鹽氮的肺炎克雷伯菌，在以NaNO2為唯一氮源的培養(yǎng)基中，肺炎克雷伯菌最適生長(zhǎng)條件為初始氮濃度80 mg/L，碳氮比10，溫度35 ℃，pH 6～7.實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步將肺炎克雷伯菌開發(fā)成降亞硝酸鹽氮微生態(tài)制劑提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).