何洛迪, 陳 杰, 趙 文, 魏 杰, 馬悅欣, 張 灣, 王 宇, 尹東鵬
(大連海洋大學(xué) 遼寧省水生生物學(xué)重點實驗室,遼寧 大連 116023)
隨著生活水平的不斷提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變,人們對海產(chǎn)品的需求量日漸增加。在市場需求和經(jīng)濟利益的驅(qū)動下,水產(chǎn)養(yǎng)殖的規(guī)模和產(chǎn)量迅速提高。但傳統(tǒng)養(yǎng)殖方式由于存在規(guī)范化程度低、養(yǎng)殖模式簡單、水資源浪費大、污染嚴(yán)重等問題,因此發(fā)展一種高效的優(yōu)化養(yǎng)殖模式,已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的必然趨勢[1]。海水混合養(yǎng)殖(也稱生態(tài)養(yǎng)殖)是近年來水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要形式,生態(tài)養(yǎng)殖是根據(jù)不同生物間的共生互補原理,利用自然界物質(zhì)循環(huán)系統(tǒng)形成的一種多元立體綜合養(yǎng)殖模式,該模式對于提高餌料利用率,減少環(huán)境污染均有積極意義。細(xì)菌在養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)中扮演重要角色,其種類與數(shù)量直接影響水質(zhì)和生物生長繁殖[2],在物質(zhì)循環(huán)與能量轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用[3]。一方面可以合成溶解性有機質(zhì),另一方面也可將有機化合物轉(zhuǎn)化成各種無機化學(xué)成分,是調(diào)節(jié)水體環(huán)境生源要素的重要參與者[4]。此外,某些致病菌在達(dá)到適宜生長環(huán)境條件時呈爆發(fā)性增長可導(dǎo)致養(yǎng)殖生物疾病發(fā)生[5-6]。細(xì)菌數(shù)量常做為判斷水體污染程度的指標(biāo)之一,其變化特征對優(yōu)化養(yǎng)殖水質(zhì),有效改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境和防控生物疾病等方面具有重要意義。國外對單一和混合養(yǎng)殖池塘水體與沉積物中細(xì)菌豐度、多樣性及其與環(huán)境因子之間的相互關(guān)系報道較多[7-9],國內(nèi)學(xué)者曹煜成等[10]研究了蝦-魚-蟹海水養(yǎng)殖池塘細(xì)菌數(shù)量及其與環(huán)境因子的相關(guān)性,李秋芬等[11]研究了魚蝦混養(yǎng)生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)菌的動態(tài)變化,閆法軍等[12]研究了草魚養(yǎng)殖池溏細(xì)菌群落代謝特征與環(huán)境因子之間的相互關(guān)系,范立民等[13]研究了淡水精養(yǎng)養(yǎng)殖池溏中浮游動植物群落和非生物環(huán)境與細(xì)菌群落之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系,但對同一養(yǎng)殖周期多種海水生態(tài)養(yǎng)殖池塘中細(xì)菌數(shù)量及其與環(huán)境因子相關(guān)性的比較研究未見報道。本研究分析比較了遼寧省錦州市“參-蝦”養(yǎng)殖池塘與丹東東港市“蟹-蟶”和“蜇-蟶”養(yǎng)殖池塘中浮游細(xì)菌的時空分布特征,通過對細(xì)菌數(shù)量與環(huán)境因子的相關(guān)性分析,篩選影響細(xì)菌數(shù)量的主要環(huán)境驅(qū)動因子,旨在為黃渤海區(qū)海珍品生態(tài)高效養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為多元立體綜合養(yǎng)殖模式中的水質(zhì)安全與生物疾病防控提供參考。
1.1.1 實驗樣品 水樣采自遼寧省錦州市達(dá)蓮公司“刺參(Oplopanaxelatus)-日本對蝦(Penaeusjaponicus)”(簡稱參-蝦)養(yǎng)殖池塘,生物養(yǎng)殖周期為6個月(5月至10月);丹東東港市北井子鎮(zhèn)“海蜇(Rhopilemaesculentum)-縊蟶(Sinonovaculaconstricta)-牙鲆(Paralichthysolivaceus)-三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)”(簡稱蟹-蟶)、“海蜇(Rhopilemaesculentum)-縊蟶(Sinonovaculaconstricta)-牙鲆(Paralichthysolivaceus)-中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)”(簡稱蜇-蟶)養(yǎng)殖池溏,生物養(yǎng)殖周期為4~5個月(4月至8月)。
1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 無顆粒甲醛固定液(遼寧泉瑞試劑有限公司),0.1%吖啶橙染液(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)和熒光顯微鏡鏡油(IMMOIL-F30CC,日本奧林巴斯有限公司)?,F(xiàn)場環(huán)境因子測定設(shè)備為便攜式多參數(shù)水質(zhì)分析儀(HQ30d,美國Hach公司);采水裝置(自制)為水生80型采水器;抽濾所需設(shè)備及用具為循環(huán)水式多用真空泵(SHZ-D(Ⅲ),河南省予華儀器有限公司);玻璃過濾器(T-50,天津市津騰實驗設(shè)備有限公司);微孔濾膜(孔徑0.2 μm,直徑25 mm,上海興亞凈化材料廠);計數(shù)設(shè)備為蔡司熒光顯微鏡(Zess,HBO50/AC,德國)。
1.2.1 采樣時間及樣站設(shè)置 2021年5月至10月對錦州市“參-蝦”養(yǎng)殖池塘,2021年4月至8月對丹東東港市“蟹-蟶”和“蜇-蟶”養(yǎng)殖池溏分別進行5次采樣,樣站設(shè)置見表1。
表1 三種生態(tài)養(yǎng)殖池塘樣站設(shè)置Table 1 Point setting of three ecological breeding ponds
1.2.2 采樣方法 每個池塘采用3點采樣法,即在進水口、中間位置及出水口設(shè)置采樣點,每個采樣點分表(水下0.5 m)、中、底(距底0.5 m)三層采水,由于池塘水深變化不大,采用混合采集方式,取混合水樣100 mL置于滅菌塑料瓶中加入3%無顆粒甲醛用于細(xì)菌計數(shù),同時取2 L水樣至采樣瓶中用于水質(zhì)指標(biāo)測定,水樣均置于保溫箱中低溫儲存,并盡快帶回室內(nèi)測定。
1.2.3 細(xì)菌計數(shù)方法 采用熒光顯微鏡計數(shù)法(AODC)[14]測定細(xì)菌數(shù)量,取一定體積固定后經(jīng)無菌水稀釋一定倍數(shù)的水樣,加入0.1倍吖啶橙染液染色,5 min后將過濾后的濾膜置于載玻片上,滴加無熒光潤油后蓋上蓋玻片進行計數(shù)。在顯微鏡100×物鏡下,統(tǒng)計隨機10個視野下的細(xì)菌數(shù)量。浮游細(xì)菌密度的計算公式如下:
式中:Na為每個視野平均菌數(shù);X為樣品稀釋倍數(shù);S為濾膜濾水面積(cm2);St為視野面積(cm2);V為過濾水的體積(mL)。
1.2.5 數(shù)據(jù)整理與分析 使用 Excel 2019 對細(xì)菌數(shù)量和環(huán)境因子數(shù)據(jù)進行計算與繪圖,利用 Canoco 5.0 軟件進行典范對應(yīng)分析(CCA)。
三種生態(tài)養(yǎng)殖池塘水體細(xì)菌數(shù)量時空分布如圖1所示。細(xì)菌數(shù)量時間分布特征表明(圖1a),參-蝦池塘細(xì)菌密度月均值為1.62×105cell/mL,變化范圍為(0.49~3.32)×105cell/mL,7月份最高為2.32×105cell/mL,10月份最低為0.54×105cell/mL,6月、7月和9月細(xì)菌密度顯著高于5月和10月(P<0.05);蟹-蟶池塘細(xì)菌密度月均值為1.48×105cell/mL,變化范圍為(0.52~2.98)×105cell/mL,6月份最高為2.62×105cell/mL,5月份最低為0.61×105cell/mL;蜇-蟶池塘細(xì)菌密度月均值為1.52×105cell/mL,變化范圍為(0.47~2.55)×105cell/mL,6月份最高為2.41×105cell/mL,5月份最低為0.75×105cell/mL。蟹-蟶池塘6月細(xì)菌密度顯著高于其他月份(P<0.05),7月和8月細(xì)菌密度顯著高于4月和5月(P<0.05)。蜇-蟶池塘6月細(xì)菌密度顯著高于4月、5月和7月(P<0.05),7月和8月細(xì)菌密度顯著高于4月和5月(P<0.05)。除5月參-蝦池塘細(xì)菌數(shù)量顯著高于蟹-蟶和蜇-蟶池塘外,其他月份差異均不顯著(P>0.05)。
細(xì)菌數(shù)量空間分布特征表明(圖1b),參-蝦池塘細(xì)菌密度總體表現(xiàn)為進水口>中間位置>出水口;蟹-蟶池塘為中間位置>進水口>出水口;蜇-蟶池塘為出水口>中間位置>進水口。
圖1 三種生態(tài)養(yǎng)殖池塘細(xì)菌數(shù)量時間(a)和空間(b)變化Fig.1 Time (a) and space (b) changes of bacteria in three ecological aquaculture ponds小寫字母為同一池塘細(xì)菌數(shù)量時空比較,大寫字母為不同池塘間細(xì)菌數(shù)量時空比較,不同字母表示組間有顯著差異(P<0.05)Lowercase letters refer to the spatial and temporal comparison of the number of bacteria in the same pond, and uppercase letters refer to the spatial and temporal comparison of the number of bacteria in different ponds. Different letters indicate significant difference between groups (P<0.05)
綜合三種模式的海水生態(tài)養(yǎng)殖池塘,細(xì)菌平均密度相差不大,但時間差異明顯,夏季(6月、7月、8月)細(xì)菌密度高于春季(4月、5月)和秋季(9月、10月);細(xì)菌數(shù)量空間分布規(guī)律不明顯。
三種生態(tài)養(yǎng)殖池塘的環(huán)境因子測定結(jié)果見表2。從表2中可見,參-蝦池塘透明度、水溫、pH、溶解氧、活性磷、總氮和總磷月變化不明顯,透明度、水溫和pH均值分別為(133.0±24.8) cm、(22.8±5.0) ℃和(8.21±0.20);溶解氧、活性磷、總氮和總磷均值分別為(7.76±0.70) mg/L、(0.007±0.002) mg/L、(2.23±0.12) mg/L和(0.009±0.001) mg/L,總氮和總磷在5月和6月較高。參-蝦池塘化學(xué)耗氧量和亞硝態(tài)氮月變化較明顯,化學(xué)耗氧量變化范圍在(0.44~2.56) mg/L之間,亞硝態(tài)氮在(0.002~0.004) mg/L之間,5月化學(xué)耗氧量最高而亞硝態(tài)氮最低,9月亞硝態(tài)氮最高,7月化學(xué)耗氧量最低。參-蝦池塘葉綠素a、氨態(tài)氮和硝態(tài)氮變化顯著,葉綠素a 5月最高達(dá)3.84 μg/L,隨時間逐漸降低,均值為1.46 μg/L;氨態(tài)氮隨時間先升后降,變化范圍(0.020~0.510) mg/L,9月最高;硝態(tài)氮隨時間逐漸上升,變化范圍(0.003~0.032) mg/L,10月達(dá)最高。
表2 三種生態(tài)養(yǎng)殖池塘環(huán)境因子的季節(jié)變化Table 2 The seasonal dynamics of environmental factors in three ecological aquaculture ponds
蟹-蟶池塘水溫、溶解氧、pH月變化不明顯,其均值分別為(24.8±5.6) ℃、(8.47±1.04) mg/L和(8.30±0.12)。透明度、葉綠素a、總氮和總磷月變化較明顯,透明度變化范圍在(21.7~88.3) cm之間,4月最高,5月最低;葉綠素a變化范圍在(0.03~0.07)μg/L之間,隨時間逐漸上升;總氮和總磷變化范圍分別在(2.28~9.80) mg/L和(0.007~0.045) mg/L?;瘜W(xué)耗氧量、活性磷、亞硝態(tài)氮、氨態(tài)氮和硝態(tài)氮變化顯著,化學(xué)耗氧量在4月高達(dá)2.18 mg/L,隨時間逐漸降低,均值為(1.21±0.77) mg/L;活性磷變化范圍(0.018~0.280) mg/L,均值為(0.107±0.091)mg/L;亞硝態(tài)氮和氨態(tài)氮變化范圍分別為(0.003~0.029) mg/L和(0.010~0.256) mg/L,6月二者均達(dá)最高,7月達(dá)最低;硝態(tài)氮隨時間先升后降,變化范圍為(0.009~0.063) mg/L,5月最高。
蜇-蟶池塘水溫、溶解氧、pH月變化不明顯,其均值分別為(23.5±5.4) ℃、(8.00±1.06) mg/L和(8.02±0.12)。透明度、葉綠素a、化學(xué)耗氧量、亞硝態(tài)氮、氨態(tài)氮、總氮和總磷月變化較明顯,透明度變化范圍(20.0~84.3) cm,4月最高,5月最低;葉綠素a隨時間先升后降,變化范圍(0.02~0.04) μg/L,6月和7月最高;化學(xué)耗氧量變化范圍(0.02~1.89) mg/L,隨時間先升后降,5月最高;亞硝態(tài)氮和氨態(tài)氮變化范圍分別為(0.001~0.069) mg/L和(0.068~0.615) mg/L,4月二者均達(dá)最低,6月亞硝態(tài)氮最高,7月氨態(tài)氮最高;總氮和總磷的變化范圍分別為(2.24~8.18) mg/L和(0.009~0.059) mg/L,4月總氮最高而總磷最低,5月總氮最低,8月總磷最高?;钚粤缀拖鯌B(tài)氮變化顯著,變化范圍分別為(0.030~0.199)mg/L和(0.023~0.173) mg/L,4月活性磷最高而硝態(tài)氮最低,5月活性磷最低而硝態(tài)氮最高。
綜合三種模式的海水生態(tài)養(yǎng)殖池塘,水溫、溶解氧和pH變化均不明顯,且相差不大;硝態(tài)氮均發(fā)生顯著變化。其中,蜇-蟶和蟹-蟶池塘的硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、活性磷、總氮和總磷均高于參-蝦池塘,透明度、葉綠素a和化學(xué)耗氧量則均低于參-蝦池塘。
2.3.1 參-蝦池塘細(xì)菌數(shù)量的驅(qū)動因子 參-蝦生態(tài)養(yǎng)殖池塘細(xì)菌數(shù)量與環(huán)境因子的 CCA 分析表明(圖2),水溫(P=0.001)、化學(xué)耗氧量(P=0.001)、氨態(tài)氮(P=0.003)、溶解氧(P=0.009)、pH(P=0.013)、亞硝態(tài)氮(P=0.034)、葉綠素a(P=0.046)和透明度(P=0.048)是影響細(xì)菌數(shù)量的主要環(huán)境驅(qū)動因子(P<0.05)。5月細(xì)菌數(shù)量與葉綠素a和總磷呈正相關(guān),其中與葉綠素a的相關(guān)性較明顯;6月與透明度呈正相關(guān);7月與水溫呈正相關(guān);而9月與pH、氨態(tài)氮和亞硝態(tài)氮均呈正相關(guān),其中與氨態(tài)氮相關(guān)性最明顯;10月與總氮呈正相關(guān)。
圖2 參-蝦生態(tài)養(yǎng)殖池塘細(xì)菌數(shù)量與環(huán)境因子的 CCA 分析Fig.2 CCA analysis of bacterial quantity and environmental factors in Oplopanax elatus-Penaeusjaponicus ecological culture pond
2.3.2 蟹-蟶池塘細(xì)菌數(shù)量的驅(qū)動因子 蟹-蟶生態(tài)養(yǎng)殖池塘細(xì)菌數(shù)量與環(huán)境因子的 CCA 分析表明(圖3),水溫(P=0.001)、溶解氧(P=0.003)、pH(P=0.004)、活性磷(P=0.006)、總氮(P=0.010)、總磷(P=0.025)、亞硝態(tài)氮(P=0.032)和透明度(P=0.043)是影響細(xì)菌數(shù)量的主要環(huán)境驅(qū)動因子(P<0.05)。4月細(xì)菌數(shù)量與活性磷、pH和總氮呈正相關(guān);6月與亞硝態(tài)氮呈正相關(guān);7月與水溫和總磷呈正相關(guān),其中與水溫相關(guān)性更明顯;而8月與溶解氧和透明度呈正相關(guān),其中與溶解氧相關(guān)性最為明顯。
圖3 蟹-蟶生態(tài)養(yǎng)殖池塘細(xì)菌數(shù)量與環(huán)境因子的 CCA 分析Fig.3 CCA analysis of bacteria quantity and environmental factors in Portunus trituberculatus-Sinonovacula constricta ecological culture pond
2.3.3 蜇-蟶池塘細(xì)菌數(shù)量的驅(qū)動因子 蜇-蟶生態(tài)養(yǎng)殖池塘細(xì)菌數(shù)量與環(huán)境因子的 CCA 分析表明(圖4),水溫(P=0.001)、化學(xué)耗氧量(P=0.008)、總磷(P=0.011)和葉綠素a(P=0.034)是影響細(xì)菌數(shù)量的主要環(huán)境驅(qū)動因子(P<0.05)。6月細(xì)菌數(shù)量與化學(xué)耗氧量呈正相關(guān);7月與葉綠素a和水溫呈正相關(guān),其中與水溫的相關(guān)性更明顯;8月細(xì)菌數(shù)量與總磷呈正相關(guān)。
圖4 蜇-蟶生態(tài)養(yǎng)殖池塘細(xì)菌數(shù)量與環(huán)境因子的 CCA 分析Fig.4 CCA analysis of bacteria quantity and environmental factors in Rhopilema esculentum-Sinonovacula constricta ecological culture pond
綜合CCA分析結(jié)果顯示,不同養(yǎng)殖模式細(xì)菌數(shù)量的主要環(huán)境驅(qū)動因子不同,細(xì)菌數(shù)量均與水溫呈顯著正相關(guān),蟹-蟶和蜇-蟶池塘細(xì)菌數(shù)量均與總磷呈顯著正相關(guān);細(xì)菌數(shù)量的驅(qū)動因子有明顯的時間差異,但規(guī)律不明顯。
本研究表明,三種模式海水生態(tài)養(yǎng)殖池塘的細(xì)菌數(shù)量變化范圍在104~105cell/mL之間,其中參-蝦池塘浮游細(xì)菌數(shù)量均值較高,蟹-蟶池塘浮游細(xì)菌數(shù)量均值較低。近年來,不少學(xué)者對養(yǎng)殖池溏水體浮游細(xì)菌進行了相關(guān)調(diào)查。楊星星等[16]采用平板菌落計數(shù)法檢測縊蟶養(yǎng)殖池塘細(xì)菌全年變化范圍為1.2×103~2.4×105cell/mL,本次調(diào)查蟹-蟶、蜇-蟶池塘細(xì)菌數(shù)量與其較接近。曹煜成等[10]采用平板菌落計數(shù)法對蝦養(yǎng)殖池塘水體細(xì)菌數(shù)量計數(shù),其平均值為7.64×104cell/mL;高菲等[17]采用吖啶橙熒光顯微鏡計數(shù)法發(fā)現(xiàn)5~7月份刺參養(yǎng)殖池塘細(xì)菌數(shù)量為(2.14~4.27)×106cell/mL;而本次調(diào)查參-蝦池塘細(xì)菌數(shù)量變化范圍為(0.49~3.32)×105cell/mL。造成差異的原因,可能是樣品會受到采樣計數(shù)方法、調(diào)查時間、養(yǎng)殖種類、養(yǎng)殖模式以及地域環(huán)境等綜合因素的影響,從而導(dǎo)致不同養(yǎng)殖系統(tǒng)中微生物群落的組成結(jié)構(gòu)各不相同。
細(xì)菌受人為因素和環(huán)境因子及生物群落等影響,在養(yǎng)殖池塘生態(tài)系統(tǒng)中具有重要意義,常被用于反應(yīng)水體污染情況[18-19]。溫度變化會影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的分泌,是微生物生長的重要因素[20-21]。曹煜成等[10]研究表明,細(xì)菌數(shù)量隨水溫升高而增加,本研究表明,三種養(yǎng)殖模式池塘細(xì)菌數(shù)量均與水溫呈顯著正相關(guān),夏季(6月、7月、8月)的細(xì)菌數(shù)量高于春季(4月、5月)和秋季(9月、10月)。浮游細(xì)菌與浮游植物密切相關(guān),細(xì)菌在吸收浮游植物產(chǎn)生的有機質(zhì)同時,也為浮游植物的生長提供了必要的營養(yǎng)物質(zhì)和生長環(huán)境。在一定程度上,葉綠素a含量代表浮游植物的豐富度[22-24]。有研究報道,細(xì)菌豐度與葉綠素之間具有一定的相關(guān)性[25-26],本次調(diào)查也表明,參-蝦和蜇-蟶池塘細(xì)菌數(shù)量與葉綠素a含量呈顯著正相關(guān)?;瘜W(xué)耗氧量也是評價水體污染狀況的重要指標(biāo),本次調(diào)查的參-蝦和蜇-蟶池塘細(xì)菌數(shù)量與化學(xué)耗氧量呈顯著正相關(guān),參-蝦池塘可能與浮游植物進行光合作用形成大量有機物質(zhì)有關(guān),刺參夏眠在一定程度上也會造成有機物的積累,這些為細(xì)菌大量繁殖提供了物質(zhì)基礎(chǔ);蜇-蟶池塘混養(yǎng)生物種類多,分泌代謝產(chǎn)物及人工投喂的巧料等均可為細(xì)菌提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和適宜的生存環(huán)境。氮磷等物質(zhì)是影響細(xì)菌生長繁殖所需的營養(yǎng)成分,同時也是導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化的因素[27]?;钚粤妆徽J(rèn)為是水中浮游植物生長所需的重要物質(zhì),主要為可溶性磷酸鹽。本研究發(fā)現(xiàn),參-蝦池塘活性磷含量低于蟹-蟶和蜇-蟶池塘,分析可能由于參蝦池塘中活性磷被較多的浮游植物所吸收利用;此外,有研究表明,某些細(xì)菌具有使不溶性磷轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄粤椎慕饬啄芰28],這可能是蟹-蟶與蜇-蟶池塘中含有較多具有解磷功能的細(xì)菌,還需進一步研究證實;本研究表明,蟹-蟶與蜇-蟶池塘細(xì)菌數(shù)量與總磷呈顯著正相關(guān),總磷可能為浮游細(xì)菌生長的限制因子。氨態(tài)氮是水體中主要氮元素的來源,可促進浮游細(xì)菌繁殖生長[29],養(yǎng)殖過程中會產(chǎn)生大量的亞硝態(tài)氮和氨態(tài)氮[30-31],在細(xì)菌繁殖速度較慢的情況下,亞硝態(tài)氮向硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化可能變慢[32],氮的轉(zhuǎn)化過程復(fù)雜,同時與池塘理化因子和生物因子等相互影響,其存在形式在養(yǎng)殖池溏中存在單個因子與細(xì)菌數(shù)量相關(guān)性無法描述的情況。三種模式池塘細(xì)菌數(shù)量與氮和磷相互關(guān)系復(fù)雜,相關(guān)性上存在較大差異。
微生物與生境之間具有復(fù)雜的相互作用:一方面環(huán)境因子對微生物的生長和繁殖有影響,另一方面微生物生長繁殖也會影響和改變環(huán)境。因此,在池塘養(yǎng)殖過程中,可以通過控制環(huán)境條件來利用微生物有益的一面,并利用微生物參與水質(zhì)調(diào)控,為養(yǎng)殖生物提供良好的生存環(huán)境,同時防止致病菌的爆發(fā)性增長,防控養(yǎng)殖生物疾病發(fā)生。