王春萍，郭宏宇，霍玉珠，王麗霞，馬成倉，王銀華

（1.天津師范大學生命科學學院，天津 300387：2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

近年來，隨著人類社會的快速發(fā)展，氮污染日益增加，已成為全球性生態(tài)問題之一. 當前人為活動導致的大氣氮沉降約占表層海洋年氮輸入的20%[1]，氮輸入的急劇增加使全球主要地區(qū)水體氮污染趨勢明顯. 氮污染引起沿海地區(qū)濕地和水體的富營養(yǎng)化，將會導致大量水生生物死亡，降低生物多樣性，破壞濕地和水體系統(tǒng)生態(tài)功能，威脅沿海地區(qū)生態(tài)環(huán)境健康. 天津濱海濕地位于渤海之濱，是京津冀區(qū)域濕地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[2]，在維持區(qū)域氣候穩(wěn)定、維護生物多樣性、防護海岸線等方面發(fā)揮著重要的生態(tài)服務功能[3-4]. 但天津濱海濕地也面臨著較為嚴重的氮污染問題[5]. 研究表明，渤海灣水域可溶性無機氮含量呈逐年顯著上升趨勢[6]，其中渤海灣近岸水體中氮營養(yǎng)鹽含量較高，達到（0.80 ± 0.12）mg/L[7]，氮污染已對天津濱海濕地的生態(tài)服務功能造成了威脅.

生物脫氮法具有操作簡單、穩(wěn)定高效、不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點，已成為當前氮污染治理的研究熱點[8].硝化細菌所驅(qū)動的將氨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽和硝酸鹽的硝化作用是生物脫氮的重要過程[9-10]. 同自養(yǎng)型硝化細菌相比，異養(yǎng)型硝化細菌生長速率快，對環(huán)境適應性強，在生物脫氮技術(shù)中具有很好的應用前景[11].目前已分離出的具有較高硝化能力的異養(yǎng)硝化細菌多為芽胞桿菌屬（Bacillussp.）[12]、產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenessp.）[13]、假單胞菌屬（Pseudomonassp.）[14]、不動桿菌屬（Acinetobactersp.）[15]，且均在各自來源生境條件下具有最高的適應性和最佳的脫氮性能. 本研究從天津濱海濕地土壤中分離篩選得到一株具有高效脫氮能力的異養(yǎng)硝化細菌菌株WP5，利用分子生物學方法對其進行鑒定，并進一步研究碳源、氨氮負荷、溫度、接種量對該菌株生長和脫氮特性的影響，應用正交實驗探究其脫氮的優(yōu)化條件. 本研究將為應用生物脫氮技術(shù)高效治理天津濱海濕地的氮污染提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基（LB 培養(yǎng)基）：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、pH 值為7.0～7.2.

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基：K2HPO47.0 g/L、KH2PO43.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L、（NH4）2SO40.943 g/L、FeSO4·7H2O 0.05 g/L、pH 值為7.2～7.4.

在以上培養(yǎng)基中分別加入2%的瓊脂粉，制成平板培養(yǎng)基.

1.2 實驗方法

1.2.1 異養(yǎng)硝化菌株的分離篩選與鑒定

稱取10.0 g 土樣，加入裝有100 mL 無菌水的三角瓶中，振蕩10 min 后，吸取懸浮液10 mL，接種到LB 液體培養(yǎng)基中，置于35 ℃、120 r/min 恒溫旋轉(zhuǎn)搖床中培養(yǎng)3 d. 采用梯度稀釋法將菌液稀釋，在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基上進行涂布，于35 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d后，挑取濕潤圓滑的單個菌落，采用平板劃線法對形態(tài)不同的菌株進行菌株純化，進一步分離純化3～4次，直至形成均勻單一菌落.

將分離得到的菌株分別接種于100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，置于35 ℃、120 r/min 恒溫旋轉(zhuǎn)搖床中培養(yǎng)12～16 h. 在細菌的細胞光密度（OD600）達到約為1.0后，按5%的接種量將細菌懸浮液分別接種在異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基中，并置于35 ℃、150 r/min 恒溫旋轉(zhuǎn)搖床中培養(yǎng)48 h，每隔24 h 取樣，10 000 r/min 下離心10 min，吸取上清液. 用標準方法分別測定氨態(tài)氮和總氮含量，計算氮去除率[16-18]，挑選出氮去除效果最優(yōu)的異養(yǎng)硝化菌株.

用細菌基因組DNA 提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取細菌基因組DNA. 以基因組DNA 為模板，利用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對細菌基因組DNA 的16S rRNA 片段進行PCR 擴增. 經(jīng)純化后的PCR 擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析，獲得16S rRNA 片段序列數(shù)據(jù). 將該菌株的16S rRNA 片段序列數(shù)據(jù)提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫，使用BLAST 程序（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行比對分析，鑒定到屬分類學水平.

1.2.2 不同因素對菌株異養(yǎng)硝化特性的影響

（1）碳源. 在異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基中分別加入不同單一碳源：檸檬酸鈉（C6H5Na3O7·2H2O）8.17 g/L、蔗糖（C12H22O11）4.75 g/L、醋酸鈉（CH3COONa）6.84 g/L，使不同單一碳源具有相同的碳含量. 將篩選獲得的菌株接種于100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，置于35 ℃、150 r/min的恒溫旋轉(zhuǎn)搖床中過夜培養(yǎng)至OD600約為1.0，以5%的接種量接種至含有不同單一碳源、pH 值為7、硫酸銨為唯一氮源、初始氨態(tài)氮質(zhì)量濃度為200 mg/L 的異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基中. 置于35 ℃、150 r/min 的恒溫旋轉(zhuǎn)搖床中培養(yǎng)24 h，每4 h 取樣，分別測定OD600、氨態(tài)氮（NH4+-N）質(zhì)量濃度和總氮（TN）質(zhì)量濃度. 每種碳源設置3個重復，并以不接菌培養(yǎng)基作為空白對照.

（2）氨態(tài)氮負荷. 初始氨態(tài)氮質(zhì)量濃度分別設置為50、100、200 mg/L.將篩選獲得的菌株接種于100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，置于35 ℃、150 r/min 恒溫旋轉(zhuǎn)搖床中過夜培養(yǎng)至OD600約為1.0，以5%的接種量接種至含有不同初始氨態(tài)氮質(zhì)量濃度、pH 值為7、以蔗糖為單一碳源（2 g/L）、硫酸銨為單一氮源的異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基中. 置于35 ℃、150 r/min 恒溫旋轉(zhuǎn)搖床中培養(yǎng)24 h，每4 h 取樣，分別測定OD600、氨態(tài)氮質(zhì)量濃度和總氮質(zhì)量濃度. 每個氨態(tài)氮負荷水平設置3個重復，并以不接菌培養(yǎng)基作為空白對照.

（3）溫度. 溫度分別設置為15、25、35 ℃. 將篩選獲得的菌株接種于100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，置于35 ℃、150 r/min 恒溫旋轉(zhuǎn)搖床中過夜培養(yǎng)至OD600約為1.0，以5%的接種量接種至pH 值為7、以蔗糖為單一碳源（2 g/L）、硫酸銨為單一氮源、初始氨態(tài)氮質(zhì)量濃度為200 mg/L 的異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基中. 置于不同溫度條件下，150 r/min 的恒溫旋轉(zhuǎn)搖床中培養(yǎng)24 h，每4 h 取樣，分別測定OD600、氨態(tài)氮質(zhì)量濃度和總氮質(zhì)量濃度. 每個溫度條件設置3個重復，并以不接菌培養(yǎng)基作為空白對照.

（4）接種量. 接種量分別設置為1%、5%、10%. 將篩選獲得的菌株接種于100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，置于35 ℃、150 r/min 恒溫旋轉(zhuǎn)搖床中過夜培養(yǎng)至OD600約為1.0，以不同接種量分別接種至pH 值為7、以蔗糖為單一碳源（2 g/L）、硫酸銨為單一氮源、初始氨態(tài)氮質(zhì)量濃度為200 mg/L 的異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基中. 置于35 ℃、150 r/min 恒溫旋轉(zhuǎn)搖床中培養(yǎng)24 h，每4 h取樣，分別測定OD600、氨態(tài)氮質(zhì)量濃度和總氮質(zhì)量濃度. 每個接種量水平設置3個重復，并以不接菌培養(yǎng)基作為空白對照.

1.2.3 正交實驗

選擇碳源、溫度、氨態(tài)氮負荷和接種量4個因素進行正交實驗，每個因素設置3個水平，每組設置3個重復，如表1 所示. 以培養(yǎng)24 h 時的總氮去除率為依據(jù)，探究菌株脫氮的優(yōu)化條件及其影響因素.

表1 正交實驗各因素和水平Tab.1 Factors and levels in the orthogonal experiment

1.2.4 測定方法

菌體生長量的測定采用測量菌液細胞光密度的方法，即在600 nm 波長處測定菌液的吸光度（OD600）[19]；采用水楊酸分光光度法[16]測定氨態(tài)氮質(zhì)量濃度；采用堿性過硫酸鉀消解-紫外分光光度法[17]測定總氮質(zhì)量濃度.

1.3 數(shù)據(jù)分析

氨態(tài)氮和總氮去除率計算公式[18]：

式中：C0（mg/L）為氨態(tài)氮或總氮的初始質(zhì)量濃度；Ct（mg/L）為氨態(tài)氮或總氮處理t小時后的質(zhì)量濃度.

用JMP11 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用SigmaPlot12.5 軟件作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選和鑒定

本研究從天津濱海濕地土壤中分離篩選獲得一株具有高效脫氮能力的異養(yǎng)硝化細菌WP5，該菌株對氨態(tài)氮和總氮均有較強的去除能力.對菌株WP5 基因組DNA 的16S rRNA 片段PCR 擴增產(chǎn)物的測序和對比分析結(jié)果表明，WP5 與數(shù)據(jù)庫中腸桿菌屬（Enterbacter）的相似性達99%，因此應屬于腸桿菌屬，將其命名為Enterbactersp.WP5.

2.2 碳源對菌株生長和脫氮效果的影響

不同碳源條件下WP5 菌株生長及其對氨態(tài)氮和總氮的去除效果如圖1 所示.

圖1 不同碳源條件下菌株生長及其對氨態(tài)氮和總氮的去除效果Fig.1 Growth of strain and its removal of NH4+-N and TN under different carbon sources

由圖1（a）可知，以檸檬酸鈉和蔗糖為單一碳源時，菌株生長狀況較好，4～12 h 由培養(yǎng)初期進入對數(shù)期，16 h 后進入穩(wěn)定期；以醋酸鈉為單一碳源時，菌株在0～12 h 時生長較為緩慢，12 h 后進入對數(shù)期，約20 h后進入穩(wěn)定期.由圖1（b）可知，以蔗糖為碳源時，菌株對氨態(tài)氮的去除效果最好，在8～16 h 期間氨態(tài)氮質(zhì)量濃度快速下降，在16 h 后趨于穩(wěn)定，24 h 時氨態(tài)氮去除率達98.38%；以檸檬酸鈉和醋酸鈉為單一碳源時，菌株對氨態(tài)氮的去除分別在16 h 和20 h 趨于穩(wěn)定，24 h 時氨態(tài)氮去除率分別達92.77%和84.60%.由圖1（c）可知，以蔗糖為單一碳源時，24 h 時總氮去除率達77.34%；以檸檬酸鈉和醋酸鈉為單一碳源時，24 h時總氮去除率分別達75.81%和71.38%. 單因素方差分析結(jié)果如表2 所示，碳源對菌株的生長和脫氮效果均有顯著影響（P<0.05）.

表2 碳源、溫度、氨氮負荷、接種量對菌株生長和脫氮效果影響的方差分析結(jié)果Tab.2 ANOVA results of the effects of carbon source，temperature，initial NH4+-N concentration and inoculum amount on the growth and nitrogen removal efficiency of the strain

2.3 溫度對菌株生長和脫氮效果的影響

不同溫度條件下菌株的生長、對氨態(tài)氮和總氮的去除效果如圖2 所示.

由圖2（a）可知，在35 ℃條件下，菌株生長狀況最佳，經(jīng)過短暫的遲緩期后進入對數(shù)期，12 h 后進入穩(wěn)定期；25 ℃條件下，菌株的生長曲線變化趨勢與35 ℃條件下較為相似；15 ℃條件下，培養(yǎng)初期菌株生長緩慢，8 h 后進入對數(shù)期，約16 h 后進入穩(wěn)定期.由圖2（b）可知，在35 ℃條件下，菌株對氨態(tài)氮的去除效果最好，氨態(tài)氮的質(zhì)量濃度呈快速下降趨勢，在16 h后趨于穩(wěn)定，24 h 時氨態(tài)氮去除率達99.41%；25 ℃和15 ℃條件下，菌株在24 h 時的氨態(tài)氮去除率分別為98.10%和87.94%.由圖2（c）可知，35 ℃、25 ℃和15 ℃條件下，菌株在24 h 時的總氮去除率分別達78.74%、73.81%和67.36%.由此可見，在35 ℃條件下，該菌株具有較高的生長率和較強的脫氮能力.表2 中的單因素方差分析結(jié)果表明，溫度對菌株的生長和脫氮效果均有顯著影響（P<0.05）.

2.4 氨氮負荷對菌株生長和脫氮效果的影響

不同初始氨態(tài)氮負荷條件下菌株的生長、對氨態(tài)氮和總氮的去除效果如圖3 所示.

圖3 不同氨氮負荷條件下菌株生長及其對氨態(tài)氮和總氮的去除效果Fig.3 Growth of strain and its removal of NH4+-N and TN under different initial NH4+-N concentrations

由圖3（a）可知，初始氨態(tài)氮質(zhì)量濃度為50 mg/L條件下，菌株生長狀況最佳，培養(yǎng)4 h 后進入對數(shù)期，12 h 后進入穩(wěn)定期；初始氨態(tài)氮質(zhì)量濃度為100 mg/L和200 mg/L 條件下，菌株生長相對緩慢，培養(yǎng)8 h 后進入對數(shù)期，約12 h 后進入穩(wěn)定期.由圖3（b）可知，初始氨態(tài)氮質(zhì)量濃度為50 mg/L 條件下，氨態(tài)氮去除效果最佳，在8 h 內(nèi)大部分氨態(tài)氮已被去除，24 h 時的氨態(tài)氮去除率達98.77%；初始氨態(tài)氮質(zhì)量濃度為100 mg/L 和200 mg/L 條件下，24 h 時的氨態(tài)氮去除率分別達98.10%和97.47%. 由圖3（c）可知，初始氨態(tài)氮質(zhì)量濃度為50、100 和200 mg/L 條件下，24 h 時的總氮去除率分別達95.81%、94.19%和71.54%.表2中的單因素方差分析結(jié)果表明，初始氨態(tài)氮質(zhì)量濃度對菌株的生長和脫氮效果均有顯著影響（P<0.05）.

2.5 接種量對脫氮效果的影響

不同接種量條件下菌株的生長、對氨態(tài)氮和總氮的去除效果如圖4 所示. 由圖4（a）可知，接種量為5%條件下，培養(yǎng)初期菌株生長較為緩慢，12 h 后進入對數(shù)期，16 h 后進入穩(wěn)定期，菌株穩(wěn)定期時的OD600值最高；接種量為1%時，菌株的生長趨勢與接種量為5%條件下大致相似；接種量為10%時，菌株生長遲緩期較短，生長率較高，4 h 后進入對數(shù)期，12 h 后進入穩(wěn)定期，但菌株穩(wěn)定期時的OD600值最低.由圖4（b）可知，接種量為1%、5%和10%條件下，菌株24 h 時對氨態(tài)氮的去除率分別達到99.16%、99.75%和81.22%. 由圖4（c）可知，接種量為1%、5%和10%條件下，菌株24 h 時對總氮的去除率分別達到75.53%、76.79%和64.46%.表2 中的單因素方差分析結(jié)果表明，接種量對菌株的生長和脫氮效果均有顯著影響（P<0.05）.

圖4 不同接種量下菌株生長及其對氨態(tài)氮和總氮的去除效果Fig.4 Growth of strain and its removal of NH4+-N and TN under different inoculum amount

2.6 正交實驗

正交實驗結(jié)果如表3 所示. 由表3 可以看出，4個因素中溫度的極差值（R）最大，為21.60；其次為碳源的R值，為12.45；再次為氮負荷的R值，為9.99；接種量的R最小，為2.98.由此可知，4個因素對該菌株總氮去除效果的影響由高到低的順序為：溫度>碳源>氨氮負荷>接種量.正交實驗結(jié)果表明，獲得最佳總氮去除率（91.41%）的條件為：碳源為蔗糖、溫度為35 ℃、初始氨氮負荷為50 mg/L、接種量為5%.

表3 正交實驗結(jié)果Tab.3 Results of the orthogonal experiment

3 討論與結(jié)論

本研究從天津濱海濕地土壤中分離到一株具有高效脫氮能力的異養(yǎng)硝化細菌，對其基因組DNA 的16S rRNA 片段進行PCR 擴增，結(jié)果表明該菌株屬于腸桿菌屬（Enterbacter），將其命名為Enterbactersp.WP5.研究碳源、溫度、氨氮負荷和接種量對該菌株生長和脫氮特性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與檸檬酸鈉和醋酸鈉相比，以蔗糖為唯一碳源時，菌株Enterobactersp.WP5的生長狀況、對氨態(tài)氮和總氮的去除效果均為最佳，這與余水靜等[20]、陳猛等[21]對脫氮微生物最佳碳源的研究結(jié)果一致.碳源的主要作用是為微生物提供細胞生命活動所需的能量，以及作為硝化過程中的電子供體，且不同碳源由于分子結(jié)構(gòu)差異，不同微生物對其利用程度也不同，進而會對硝化作用產(chǎn)生影響[22].另有一些研究也表明，脫氮微生物可利用其他碳源獲得最佳脫氮性能，如白潔等[23]的研究表明，從禽畜糞便發(fā)酵沼液中分離獲得的脫氮菌株P(guān)seudomonassp.GK-01 以檸檬酸鈉為最佳脫氮碳源；杜全能等[24]發(fā)現(xiàn)從養(yǎng)殖池塘污泥中分離得到的脫氮菌株Diutina rugosaDW-1 以乙酸鈉為最佳脫氮碳源.

菌株Enterobactersp.WP5 的最適脫氮溫度為35℃，在15～35 ℃范圍內(nèi)，相對較高的溫度可提高該菌株的生長速率和脫氮效能.張峰峰等[25]研究了溫度對從養(yǎng)殖池活性污泥中分離得到的異養(yǎng)硝化細菌菌株P(guān)seudomonas alcaliphilaAD-28 氨態(tài)氮去除能力的影響，發(fā)現(xiàn)該菌株生長和去除氨態(tài)氮的最適溫度為25～35 ℃.汪旭暉等[26]探究了溫度對從SBR 活性污泥反應器中分離得到的異養(yǎng)硝化細菌菌株P(guān)seudomonas putidaYH 氨態(tài)氮去除性能的影響，發(fā)現(xiàn)37 ℃條件下，此菌株氨態(tài)氮去除率達到最高值99.85%.本研究結(jié)果與這些研究較為相近.溫度會顯著影響微生物細胞膜的流動性和生物大分子的活性，從而影響微生物的新陳代謝過程，因此較低或過高的溫度均不利于硝化細菌的生長，進而降低其硝化性能[27-28].

本研究發(fā)現(xiàn)，雖然較高的氨氮負荷會在一定程度上使菌株Enterobactersp.WP5 的脫氮性能有所降低，但在不同初始氨態(tài)氮質(zhì)量濃度條件下，該菌株對氨態(tài)氮和總氮的去除率均保持較高的水平. 張多英等[29]從松花江水體中分離得到5 株脫氮菌株，發(fā)現(xiàn)初始氨態(tài)氮質(zhì)量濃度高于45.94 mg/L 時，這些菌株對氨態(tài)氮的去除率隨初始氨態(tài)氮質(zhì)量濃度增加而降低.顏薇芝等[30]從污水處理池活性污泥中分離出脫氮菌株，發(fā)現(xiàn)在50～250 mg/L 濃度范圍內(nèi)，隨著初始氨態(tài)氮質(zhì)量濃度的提高，該菌株對氨態(tài)氮的去除效能逐漸降低.本研究結(jié)果與這些研究一致，均表明隨初始氨態(tài)氮濃度的增加，硝化細菌的生長將受到一定程度的抑制，從而影響菌株去除氨態(tài)氮的能力.另一方面，本研究也表明菌株Enterobactersp.WP5 對初始氨態(tài)氮質(zhì)量濃度水平具有較為寬泛的適應范圍，可有效去除較高水平的氨態(tài)氮污染.

本研究中菌株Enterobactersp. WP5 的接種量為5%的條件下，氨態(tài)氮和總氮去除率最高.王田野等[31]從長期施用農(nóng)家肥的土壤中篩選出一株脫氮菌株Acinetobactersp.SQ2，發(fā)現(xiàn)接種量為5%時此菌株對氨態(tài)氮去除率達到100%.劉淳等[32]從公園土壤中分離獲得了一株異養(yǎng)硝化菌株P(guān)seudomonas stutzeriHJ-7，發(fā)現(xiàn)接種量為5%時此菌株對氨態(tài)氮和總氮均有最佳的去除效能.本研究結(jié)果與這些研究相一致.本研究還發(fā)現(xiàn)，菌株接種量較低時，接種量的增加有利于菌群生長，從而促進氮污染的去除；但菌株接種量過高時，菌群生長反而受到一定程度的抑制，使氮去除率降低.因此，要獲得較高的脫氮效能，菌株接種量應控制在適宜水平.

本研究中正交實驗結(jié)果表明，各因素對菌株Enterobactersp.WP5 總氮去除效能的影響從大到小依次為：溫度>碳源>氨氮負荷>接種量，在碳源為蔗糖、溫度35 ℃、初始氨氮負荷為50 mg/L、接種量為5%的條件下，該菌株達到最佳總氮去除率91.41%.一些研究也探討了不同脫氮菌株的最佳脫氮條件，如孫將等[33]從垃圾滲濾液處理廠的活性污泥中篩選得到一株脫氮菌株P(guān)aracoccus denitrificansZ53，通過正交實驗得到其最佳脫氮條件為溫度30 ℃、pH 值為7、裝液量40 mL，各因素對其脫氮效能影響排序為：裝液量＞溫度＞pH值；李海紅等[34]從活性污泥中分離篩選出一株脫氮菌株P(guān)aracoccus denitrificansTS-1，通過正交實驗得到其最佳脫氮條件為接種量5%、溫度為30 ℃、pH 值為8，各因素對其脫氮效能影響的順序為：pH 值＞溫度＞接種量.這些研究結(jié)果表明，不同脫氮菌株的最佳脫氮條件存在明顯差異.因此，針對不同脫氮菌株研究其特定的最佳脫氮條件十分必要.本研究結(jié)果為異養(yǎng)硝化菌株Enterobactersp. WP5 在治理濱海濕地氮污染的實際應用中獲得最佳脫氮效能提供了理論依據(jù).