馬善治,潘傳波,郭定彬,漆偉,劉才英▲,袁海洲,謝輝,彭文忠

(1．重慶市中醫(yī)骨科醫(yī)院，重慶 400012；2.成都圣洪生物科技有限公司，四川 成都 611130)

筋傷凝膠系由三七、降香、大黃、沒藥、乳香等藥材組成的復(fù)方制劑，來源于郭劍華主任中醫(yī)師臨床常用“筋傷酒”，具有化瘀消腫、止痛、止血之功效，臨床上主要用于跌撲損傷、血瘀疼痛、外傷出血等病癥的治療?！敖顐啤迸R床使用效果較好，但酊劑在使用中有不便攜帶，污染衣物、療效不夠穩(wěn)定等缺點(diǎn)，使其應(yīng)用受限。為充分發(fā)揮其散瘀、消腫、促進(jìn)血液循環(huán)的作用，同時(shí)為方便臨床使用，課題組將酊劑變更為凝膠劑，使得藥物的有效成分可以達(dá)到長(zhǎng)期、穩(wěn)定的釋放。[1-2]

質(zhì)量控制是保證療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，筋傷凝膠劑中君藥三七依據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》用HPLC法對(duì)其活性成分人參皂苷Rg1和Rb1及三七皂苷R1的總量進(jìn)行定量控制，臣藥乳香、沒藥在2015年版《中國(guó)藥典》無明確定量的活性成分，故擬用薄層色譜法定性研究。本研究在分別對(duì)大黃、乳香、沒藥進(jìn)行薄層鑒別的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索了簡(jiǎn)化鑒定方法操作步驟的可能性，最終實(shí)現(xiàn)了采用同一供試品溶液和展開劑，同板鑒別大黃、乳香、沒藥三種藥味。該操作方法簡(jiǎn)便，靈敏度高。

1 材料與設(shè)備

1.1 藥材和對(duì)照品

大黃對(duì)照藥材(批號(hào)：120984-201202)、沒藥對(duì)照藥材(批號(hào)：120967-201405)和乳香對(duì)照藥材(批號(hào)：120970-201305)，均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品鑒定研究院。薄層層析硅膠G購(gòu)于青島海洋化工有限公司。薄層板自制，含0.25%羥甲基纖維素鈉。筋傷凝膠劑為自主中試規(guī)模生產(chǎn)的樣品(批號(hào):20180801，20180802，20180901)。

1.2 試劑

乙酸乙酯(批號(hào)：2018120501)、乙醇(批號(hào)：2018080801)、環(huán)己烷(批號(hào)：2018061801)、乙醚(批號(hào)：2018061501)、香草醛(批號(hào)：2018072401)、硫酸(批號(hào)：2018091301)，均為分析純，購(gòu)于成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.3 設(shè)備

ZF-2型三用紫外分析儀(上海安亭電子儀器廠)。

2 方法與結(jié)果

本研究采用薄層色譜鑒別法，對(duì)處方中的主要藥味大黃、沒藥、乳香進(jìn)行定性鑒別。三種藥味的鑒別采用同一供試品溶液，展開劑為環(huán)己烷：乙醚(4∶1)。

2.1 大黃的薄層鑒別

2.1.1 供試品溶液制備

取筋傷凝膠劑8 g，加入乙酸乙酯20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液作為薄層鑒別的供試品溶液。

2.1.2 陰性對(duì)照液制備

依照原筋傷凝膠所用各種藥材處方比例，去掉大黃，同筋傷凝膠制備方法制成缺大黃的陰性凝膠，再用與筋傷凝膠中大黃藥材鑒別用供試品溶液制備方法相同的方法，制成筋傷凝膠大黃薄層鑒別的陰性對(duì)照溶液。

2.1.3 對(duì)照藥材溶液制備

取大黃對(duì)照藥材1 g，置燒瓶中，加60%乙醇50 mL，水浴回流1 h，濾過，濾液揮至無醇味。加水30 mL，混勻，加乙酸乙酯20 mL萃取，分取乙酸乙酯液，恒溫水浴80 ℃揮至約1 mL，制備成大黃對(duì)照藥材溶液[3-4]。

2.1.4 結(jié)果

照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)進(jìn)行試驗(yàn)操作，分別吸取上述筋傷凝膠供試品溶液、大黃對(duì)照藥材溶液、大黃陰性對(duì)照溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷:乙醚(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈365 nm下檢視[5]。筋傷凝膠大黃藥材薄層鑒別的供試品色譜中，在與大黃對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上顯示相同淺黃色的熒光斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照溶液在相應(yīng)位置上無斑點(diǎn)，如圖1(a)所示。多批樣品采用此相同方法檢查，均獲得相同穩(wěn)定結(jié)果，在與大黃對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上顯示相同淺黃色的熒光斑點(diǎn)，如圖1(b)所示。

圖1 大黃薄層色譜圖

2.2 沒藥的薄層鑒別

2.2.1 供試品溶液制備

沒藥的活性成分為揮發(fā)油，其主要化學(xué)成分為單萜、倍半萜、三萜、甾體、木脂素等[6-8]，故鑒別研究首先考慮以沒藥的揮發(fā)性成分為對(duì)照對(duì)其進(jìn)行鑒別。對(duì)照藥材用乙醇提取，水浴揮干乙醇，水溶殘?jiān)颐烟崛√崛]發(fā)性成分；凝膠樣品、陰性樣品分別用乙醇超聲提取，水浴揮干乙醇，水溶殘?jiān)颐烟崛√崛]發(fā)性成分。對(duì)照藥材溶液、供試品溶液、陰性樣品供試液分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷:乙醚(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外光燈365 nm下檢視。專屬性不強(qiáng),如圖2所示。因此，本研究考慮從沒藥的乙酸乙酯部位考察其專屬性。取2.1.1項(xiàng)下供試品溶液作為供試品溶液。

圖2 沒藥揮發(fā)性成分薄層色譜圖

2.2.2 陰性對(duì)照溶液制備

依原處方比例，去掉沒藥，同筋傷凝膠制備方法制成缺沒藥的陰性凝膠，并使用同2.1.1項(xiàng)下供試品溶液相同方法，制成缺沒藥的陰性對(duì)照溶液。

2.2.3 對(duì)照藥材溶液制備

取沒藥對(duì)照藥材1 g，置燒瓶中，加60%乙醇50 mL，置水浴回流1 h，濾過，濾液揮至無醇味。加水30 mL，混勻，加乙酸乙酯20 mL萃取，分取乙酸乙酯液，恒溫水浴80℃揮至約1 mL制備成沒藥藥材薄層鑒別的對(duì)照藥材溶液。

2.2.4 結(jié)果

照薄層色譜法(《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則0502)試驗(yàn)操作，分別吸取上述供試品溶液、沒藥薄層鑒別的對(duì)照藥材溶液、沒藥薄層鑒別的陰性對(duì)照溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷:乙醚(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外光燈365 nm下檢視。筋傷凝膠沒藥藥材薄層鑒別的供試品色譜中，在與沒藥對(duì)照藥材薄層色譜相應(yīng)的位置上顯相同淡藍(lán)顏色的熒光斑點(diǎn),而陰性對(duì)照溶液在相應(yīng)位置上無斑點(diǎn)，如圖3(a)所示。多批樣品采用此相同方法，均清晰檢視淡藍(lán)色的熒光斑點(diǎn)，結(jié)果穩(wěn)定，在與沒藥對(duì)照藥材薄層色譜相應(yīng)的位置上顯相同淡藍(lán)顏色的熒光斑點(diǎn)，如圖3(b)所示。

圖3 沒藥薄層色譜圖

2.3 乳香的薄層鑒別

2.3.1 供試品溶液制備

乳香的活性成分為揮發(fā)油，其主要化學(xué)成分為五環(huán)三萜類化合物[9-10]?！吨袊?guó)藥典》2015年版一部規(guī)定了乳香藥材(氣相色譜法)鑒別揮發(fā)性成分，故試驗(yàn)研究中首先嘗試用藥材的揮發(fā)性成分為對(duì)照，對(duì)方中乳香進(jìn)行鑒別。對(duì)照藥材和凝膠成品均用乙醇超聲提取，將提取液分別揮至少量，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷∶乙醚(4∶1)為展開劑，展開，取出晾干，噴10%硫酸乙醇，置105 ℃烘箱中加熱至顯色，發(fā)現(xiàn)對(duì)照藥材和供試品色譜中斑點(diǎn)均不明顯，專屬性不強(qiáng)。如圖4所示。因此考慮從乳香的乙酸乙酯部位考察其專屬性。故取2.1.1項(xiàng)下供試品溶液作為供試品溶液。

圖4 乳香揮發(fā)性成分薄層色譜圖

2.3.2 陰性對(duì)照溶液制備

依原處方比例，去掉乳香，同筋傷凝膠制備方法制成缺乳香的陰性凝膠，并同供試品溶液相同方法制成缺乳香的陰性對(duì)照溶液。

2.3.3 對(duì)照藥材溶液制備

取乳香對(duì)照藥材1 g，置燒瓶中，加60%乙醇50 mL，置水浴回流1 h，濾過，濾液揮至無醇味。加水30 mL，混勻，加乙酸乙酯20 mL萃取，分取乙酸乙酯液，恒溫水浴80℃揮至約1 mL制備成乳香對(duì)照藥材溶液。

2.3.4 結(jié)果

照薄層色譜法(《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則0502)試驗(yàn),分別吸取上述供試品溶液、乳香薄層鑒別的對(duì)照藥材溶液、乳香薄層鑒別的陰性對(duì)照溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以環(huán)己烷∶乙醚(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴1%香草醛硫酸溶液顯色,在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在日光下檢視。供試品色譜中，在與乳香對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同的紅色斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照溶液在相應(yīng)位置上無斑點(diǎn)，如圖5(a)所示。多批樣品采用此相同方法，均獲得相同穩(wěn)定結(jié)果，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，如圖5(b)所示。

圖5 乳香薄層色譜圖

2.4 三味藥材的同板薄層鑒別

將大黃、沒藥、乳香的對(duì)照藥材溶液與筋傷凝膠的供試品溶液點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷 ∶乙醚(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光燈365 nm下檢視，分別檢視大黃藥材(淺黃顏色的熒光斑點(diǎn)，比移值Rf約為0.48、0.58)和沒藥藥材(淡藍(lán)顏色的熒光斑點(diǎn)，比移值Rf約為0.33，然后再噴1%香草醛硫酸溶液顯色，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在日光下檢視乳香紅色斑點(diǎn)(比移值Rf約為0.52、0.68)，結(jié)果如圖6所示，(a)為紫外光下檢視結(jié)果，可以看見樣品色譜在大黃、沒藥對(duì)照藥材色譜各自在相應(yīng)的位置上顯示的相同顏色的熒光斑點(diǎn)，(b)為噴灑1%香草醛硫酸溶液顯色后日光下的檢視結(jié)果，可以看見樣品色譜在乳香對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。由此可見，在實(shí)際的操作中，可以通過同一張薄層板，同一展開系統(tǒng)一次展開，同時(shí)完成大黃、沒藥、乳香三味藥味的薄層色譜鑒別。

圖6 大黃、沒藥、乳香的同板薄層色譜圖

3 討論

《中國(guó)藥典》2015年版一部乳香、沒藥藥材薄層鑒別均鑒別其各自含有揮發(fā)性成分[11]，故本研究首先對(duì)乳香、沒藥揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒別考察研究，結(jié)果均未找到其專屬性的揮發(fā)性成分的特征斑點(diǎn)。分析原因：本品為凝膠劑，1 g筋傷凝膠成品載生藥材1 g，乳香、沒藥藥材含揮發(fā)性成分均為3%左右，由于提取過程的損失，加上從凝膠中提取揮發(fā)性成分的難度，未找到乳香、沒藥的揮發(fā)性特征斑點(diǎn)。所以，我們需要考慮選取乳香和沒藥的其他特征成分進(jìn)行鑒別。根據(jù)文獻(xiàn)[12-14]報(bào)道，乙酸乙酯部位的五環(huán)三萜類化合物是乳香中具有特征性的有效成分，包括β-乳香酸、乙酰基-β-乳香酸、α-乳香酸、乙?；?α-乳香酸、表羽扇豆醇乙酸酯、羽扇-20(29)-烯-3α-乙酰氧基-24-酸等；乙酸乙酯部位的倍半萜成分是沒藥鎮(zhèn)痛功效的有效成分，包括呋喃桉烷-1，3-二烯、莪術(shù)烯、烷吉酮等。因此，我們確定乙酸乙酯部位的活性成分作為3種藥材的特征鑒定部位。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)筋傷凝膠中大黃、沒藥、乳香三味中藥材的探索性研究，發(fā)現(xiàn)有共同的薄層行為，遂大膽采用同一供試品溶液，同一展開劑對(duì)大黃、乳香、沒藥進(jìn)行薄層鑒別研究，結(jié)果顯示，本鑒別方法靈敏度高，專屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便，色譜特征斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無干擾，重現(xiàn)性好，為中藥多藥味鑒別提供了新的思路。