周霖，王肖輝，李礪鋒，金建文，武婧，孫志，左莉華，趙杰▲，付智慧

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450052；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 超聲科，河南 鄭州 450052；3.陜西麗彩藥業(yè)有限公司，陜西 咸陽(yáng) 712000；4.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 中醫(yī)藥學(xué)部，河南 鄭州 450052)

骨折(Fracture)是指骨的完整性或連續(xù)性中斷，畸形、反?；顒?dòng)、骨擦音或骨擦感是本病的典型癥狀。臨床表現(xiàn)包括疼痛與壓痛、局部腫脹與瘀斑、功能障礙等，嚴(yán)重者可發(fā)生休克，甚至危及生命[1]。骨折可發(fā)生于不同年齡段，多見于兒童及老年人，中青年也時(shí)有發(fā)生[2]，是影響患者生活質(zhì)量的重要因素之一。

復(fù)方傷痛膠囊，由當(dāng)歸、桃仁、紅花、醋延胡索、大黃、柴胡、天花粉、甘草組成，具有活血祛瘀，行氣止痛的功效，用于急性胸壁扭挫傷之瘀滯證，也可用于骨折血瘀氣滯癥[3-6]。由于中藥是多組分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用構(gòu)成的復(fù)雜體系，傳統(tǒng)的藥物研究模式很難闡明其作用機(jī)制，是當(dāng)前中醫(yī)藥走向國(guó)際世界的關(guān)鍵技術(shù)壁壘。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可利用多種數(shù)據(jù)庫(kù)收集、整合研究材料，通過先進(jìn)的數(shù)據(jù)處理方式，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)水平的中藥分子及靶點(diǎn)、通路機(jī)制，是解決當(dāng)前中藥研究難題的重要關(guān)鍵技術(shù)[7]。

有文獻(xiàn)[8]表明，復(fù)方傷痛膠囊具有調(diào)節(jié)骨組織修復(fù)及再生作用，能改善病變組織血液循環(huán)，防治瘀血阻塞加重病情，同時(shí)也能促進(jìn)肉芽細(xì)胞、骨小梁、骨組織的增長(zhǎng)，從而加快骨折的愈合，但從系統(tǒng)、全面、整體的角度對(duì)藥物的主要藥效物質(zhì)成分及具體作用機(jī)制進(jìn)行研究的報(bào)道較少，存在一定的不足。本研究前期采用質(zhì)譜技術(shù)鑒定出復(fù)方傷痛膠囊中36個(gè)化學(xué)成分，并基于這些成分開展初步的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究[9]。但限于當(dāng)前分析技術(shù)的局限性，并未將藥物中所有的化學(xué)成分進(jìn)行識(shí)別，識(shí)別到的物質(zhì)主要是含量相對(duì)較高的物質(zhì)，然而許多痕量物質(zhì)也是中藥發(fā)揮治療作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，此前研究可能存在一定的片面性。本研究擬基于龐大的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，更加系統(tǒng)全面地查找藥物成分，以期能夠多角度、多層次深入挖掘藥物治療復(fù)雜疾病的關(guān)鍵物質(zhì)及潛在作用機(jī)制。

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，較為系統(tǒng)地篩選出復(fù)方傷痛膠囊治療骨折活性成分及作用靶點(diǎn)，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”“活性成分-重要靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)探究藥物、活性成分、靶點(diǎn)、通路的內(nèi)在關(guān)聯(lián)機(jī)制，明確復(fù)方傷痛膠囊治療骨折的主要藥效成分、重要靶點(diǎn)和關(guān)鍵通路，為復(fù)方傷痛膠囊的臨床應(yīng)用、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升以及進(jìn)一步的藥理作用驗(yàn)證研究提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件

Uniprot(https://www.uniprot.org/);TCMSP(http://tcmspw.com/index.php);DrugBank(https://www.drugbank.ca/);OMIM (http://www.omim.org);Genecards(https://www.genecards.org);Omicshare 云平臺(tái)(https://www.omicshare.com/);String(https://string-db.org/);DAVID(https://david.ncifcrf.gov/);Cytoscape 3.7.2軟件。

1.2 復(fù)方傷痛膠囊活性成分的篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索復(fù)方傷痛膠囊各藥物的化學(xué)成分，并以O(shè)B≥30%和DL≥0.18[10-11]為限定條件對(duì)成分進(jìn)行初步篩選；并通過查找相關(guān)文獻(xiàn)補(bǔ)充TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)未收錄的成分，得到藥物的主要活性成分及作用靶點(diǎn)。

1.3 復(fù)方傷痛膠囊活性成分作用靶點(diǎn)獲取

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)得到以上活性成分對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白，將靶標(biāo)蛋白通過UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索查詢其對(duì)應(yīng)的基因名稱。

1.4 復(fù)方傷痛膠囊治療骨折的潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)輸入“fracture”，檢索獲得骨折的作用靶點(diǎn)。使用OmicShare云平臺(tái)中的維恩圖軟件，將藥物預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)與疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得復(fù)方傷痛膠囊治療骨折的潛在作用靶點(diǎn)。

1.5 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將中藥材、活性成分及1.4項(xiàng)下所得的骨折潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)，采用network analyzer插件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.6 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將1.4項(xiàng)下潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，勾選 multiple proteins，物種選擇Homo sapines，構(gòu)建蛋白相互作用(PPI)關(guān)系圖。

1.7 Go富集分析和KEGG通路分析

為了進(jìn)一步了解復(fù)方傷痛膠囊治療骨折的潛在靶點(diǎn)基因功能及作用，將所得靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置P<0.05，物種為Homo Sapiens，并將靶基因名稱校準(zhǔn)為官方通用名稱(Official Gene Symbol)，進(jìn)行GO和KEGG分析，最后按照其富集的靶點(diǎn)數(shù)目依次進(jìn)行排序，選取排名靠前的10個(gè)條目繪制條形圖。GO富集分析選取(Biological Processes,BP)、(Molecular Function,MF)、(Cellular Component,CC)分別進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方傷痛膠囊的活性成分

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定OB≥30%、DL≥0.18，篩選出符合條件的化合物，檢索到大黃有效成分16個(gè)，當(dāng)歸2個(gè)，柴胡17個(gè)，天花粉2個(gè)，桃仁23個(gè)，紅花22個(gè)，醋延胡索49個(gè)，甘草92個(gè)，去除共有成分，共計(jì)209個(gè)。

2.2 復(fù)方傷痛膠囊活性成分作用靶點(diǎn)

通過UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索到大黃潛在作用靶點(diǎn)65個(gè)，當(dāng)歸潛在作用靶點(diǎn)49個(gè)，柴胡潛在作用靶點(diǎn)128個(gè)，天花粉潛在作用靶點(diǎn)3個(gè)，桃仁潛在作用靶點(diǎn)49個(gè)，紅花潛在作用靶點(diǎn)165個(gè)，延胡索潛在作用靶點(diǎn)131個(gè)，甘草潛在作用靶點(diǎn)170個(gè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，共計(jì)238個(gè)。

2.3 復(fù)方傷痛膠囊治療骨折的潛在靶點(diǎn)

通過OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)、Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)輸入“fracture”，檢索、篩查并整合后共得到骨折作用靶點(diǎn)5 381個(gè)。使用OmicShare云平臺(tái)中的維恩圖軟件，將復(fù)方傷痛膠囊預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)與骨折的靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得復(fù)方傷痛膠囊治療骨折的潛在作用靶點(diǎn)159個(gè)(見下圖1)。

圖1 復(fù)方傷痛膠囊治療骨折潛在靶點(diǎn)維恩圖

2.4 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型及分析

采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型(見下圖2)。該網(wǎng)絡(luò)共有351個(gè)節(jié)點(diǎn)(包括173個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，178個(gè)活性化合物節(jié)點(diǎn))，共有2 265條邊(每條邊代表活性化合物與靶點(diǎn)基因之間的相互作用關(guān)系)。由圖可見復(fù)方傷痛膠囊中各藥物之間存在各種相互作用關(guān)系，同一成分對(duì)應(yīng)不同的靶點(diǎn)，不同成分也可對(duì)應(yīng)同一靶點(diǎn)，形成復(fù)雜的作用網(wǎng)絡(luò)，也充分體現(xiàn)了復(fù)方傷痛膠囊治療骨折的多成分、多靶點(diǎn)治療機(jī)制。

圖2 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型

2.5 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)

將復(fù)方傷痛膠囊治療骨折的159個(gè)作用靶點(diǎn)導(dǎo)入string數(shù)據(jù)庫(kù)，保存其TSV格式文件。除去兩個(gè)逸出靶點(diǎn)，將文件中的node1，node2，combined score信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行Network Analyze分析。如圖3所示，網(wǎng)絡(luò)中共包含157個(gè)節(jié)點(diǎn)(節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn))，2 706條邊(邊代表靶點(diǎn)之間的相互作用)，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)平均度值是34.5(度值表示連接到1個(gè)節(jié)點(diǎn)的線條數(shù)，線條越多表示關(guān)聯(lián)度越大，故可以評(píng)估網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的重要性)。圖中節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深，則表明度值越大，大于平均度值的靶點(diǎn)有61個(gè)(居于圖3中間圓形的節(jié)點(diǎn))，分別為AKT1、ALB、IL6、MAPK3、TP53、TNF、VEGFA、JUN、MAPK1、CASP3、EGFR、MMP9等。

圖3 復(fù)方傷痛膠囊治療骨折的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.6 Go功能富集和KEGG通路分析

將以上靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，共得到GO富集條目266個(gè)，其中生物過程(BP)195個(gè)，分子功能(MF)42個(gè)，細(xì)胞組分(CC)29個(gè)；其中，BP方面與骨折相關(guān)的生物過程有22條，選取BP與骨折相關(guān)的十個(gè)條目、MF與CC排名前十位的條目，分別繪制條形圖，見圖4。BP主要富集在ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、對(duì)平滑肌收縮的調(diào)節(jié)等；MF主要富集在蛋白質(zhì)同源二聚化活性、同蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)異源二聚體活性、血紅素結(jié)合、MAP激酶活性等；CC方面，在胞質(zhì)、細(xì)胞外空間、細(xì)胞核。KEGG通路分析結(jié)果，共得到信號(hào)通路119條，其中，與骨折密切相關(guān)的通路有22條，如圖5所示。

圖4 GO分析生物過程、分子功能、細(xì)胞組分情況

圖5 KEGG 通路富集分析

2.7 “活性成分-重要靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò)模型及分析

基于以上結(jié)果信息，整理出藥物的活性成分、重要靶點(diǎn)和關(guān)鍵通路，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“活性成分-重要靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò)模型，如圖6所示，并進(jìn)行Network Analyze分析。該網(wǎng)絡(luò)共有274個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 509條邊，平均度值是11.01。圖中節(jié)點(diǎn)越大表明度值越大，大于平均度值的活性成分有21個(gè)，分別是木犀草素、山奈酚、槲皮素、甘草查爾酮A、β-谷甾醇、芒柄花黃素、黃芩素、柚皮素等；靶點(diǎn)有27個(gè)，分別是PTGS2、HSP90AA1、PTGS1、F10、NOS2、PPARG等；信號(hào)通路有11條，分別是PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化等。

圖6 “活性成分-重要靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”網(wǎng)絡(luò)

3 討論

中藥被廣泛應(yīng)用于治療骨折、骨質(zhì)疏松等骨科相關(guān)疾病，已有許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)證明中藥可刺激骨再生和抑制骨再吸收，最終促進(jìn)骨折愈合。骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，伴有局部血腫和局部炎癥的形成，愈合過程涉及成骨細(xì)胞的增殖、分化和基質(zhì)礦化。因此，控制炎癥、促進(jìn)血液循環(huán)和刺激骨再生的藥物能改善骨折愈合[12]。

基于中藥多成分、多靶點(diǎn)的特殊性，為更加全面研究復(fù)方傷痛膠囊治療骨折的作用機(jī)制，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，系統(tǒng)構(gòu)建復(fù)方傷痛膠囊的“中藥材-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)及“關(guān)鍵成分-重要靶標(biāo)-映射通路”網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行深入挖掘分析。最終經(jīng)篩選得到藥物的關(guān)鍵成分有木犀草素、山奈酚、槲皮素、甘草查爾酮A、β-谷甾醇、芒柄花黃素、黃芩素、柚皮素、異鼠李素等21個(gè)；關(guān)鍵靶點(diǎn)有PTGS2、HSP90AA1、PTGS1、F10、NOS2、PPARG、MAPK14、ADRB2、CDK2、GSK3B等27個(gè)；映射的靶標(biāo)通路為PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、MAPK信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路，共11條；涉及的生物過程主要有ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、對(duì)平滑肌收縮的調(diào)節(jié)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路、對(duì)缺氧的反應(yīng)、對(duì)受傷的反應(yīng)、血管生成、MAPK級(jí)聯(lián)的正調(diào)控、血管生成的正調(diào)控、成肌細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控等。

本研究篩選的許多關(guān)鍵成分、靶點(diǎn)、通路與骨折的發(fā)生及愈合密切相關(guān)，體現(xiàn)本研究的科學(xué)性與合理性。其中木犀草素具有抗骨關(guān)節(jié)炎、骨肉瘤、骨損傷的作用[13-14]；山奈酚可通過調(diào)節(jié)Ca2+代謝平衡，促進(jìn)骨膠原生成，減少骨小梁丟失，從而起到健骨的作用[15]；槲皮素可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和骨向分化，是其促進(jìn)骨折愈合的關(guān)鍵細(xì)胞機(jī)制[16]；β-谷甾醇可刺激卵巢顆粒細(xì)胞分化，進(jìn)而增強(qiáng)成骨作用，其主要通過提高成骨細(xì)胞OPG與PDF比值，從而調(diào)節(jié)骨代謝平衡[17]；黃芩素、柚皮素具有抑制破骨細(xì)胞的形成以及抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能[18-19]；以上成分均能從不同層面去促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收，促進(jìn)骨折愈合。

在骨折愈合修復(fù)過程中，骨痂及血管的生成具有至關(guān)重要的作用。本研究富集的關(guān)鍵靶點(diǎn)VEGF，主要參與纖維骨痂的轉(zhuǎn)化、軟骨骨痂、骨性骨痂及其成熟骨痂的各個(gè)時(shí)期，并在血管的形成、軟骨的吸收與骨痂的改建的過程中起到關(guān)鍵作用，促進(jìn)骨折的快速愈合[20]；同時(shí)，VEGF還能介導(dǎo)活化其下游的PI3K-Akt信號(hào)通路，活化的Akt在磷酸化后激活eNOS(內(nèi)皮型一氧化氮合酶)，繼而催化合成NO，而NO能夠刺激血管舒張、血管重塑及血管的生成，有利于骨折的愈合[21]。同時(shí)，在骨折愈合過程中由于存在低氧環(huán)境，從而激活HIF信號(hào)通路，而VEGF作為HIF-1a最直接的靶基因之一可通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)控血管生成和骨形成[22]。此外，胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞形成骨表型，MAPK通路可刺激成骨基因和功能的表達(dá)；持續(xù)激活ERK2，促成骨細(xì)胞分化；磷酸化Smad-1，激活P38，促Alp表達(dá)及成骨細(xì)胞活化[23]。研究表明，鈣信號(hào)通路會(huì)與ERK交互作用來發(fā)揮對(duì)成骨細(xì)胞的抗凋亡或促凋亡作用，防止骨量丟失，有利于骨折的修復(fù)愈合[24]。Fox O家族中的Fox O3a與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，Akt1可使Fox O3a磷酸化，p-Fox O3a可抑制Bim的表達(dá)，減少caspase-3，從而抵御氧化應(yīng)激，最終起到抗成骨細(xì)胞凋亡的作用[25]。骨折愈合一方面需要清除破壞，另一方面需要再生修復(fù)，其本質(zhì)就是骨折斷端發(fā)生骨吸收、骨形成與骨重建塑型的過程。其中，成骨細(xì)胞介導(dǎo)骨形成，破骨細(xì)胞介導(dǎo)骨吸收，兩者相互配合，在骨折愈合時(shí)，增強(qiáng)骨組織增殖形成，促使骨痂破壞清除，從而完成骨組織的再生修復(fù)[26]。本研究篩選的關(guān)鍵通路有保護(hù)成骨細(xì)胞存活及刺激破骨細(xì)胞活化的作用，是骨折愈后修復(fù)的關(guān)鍵作用環(huán)節(jié)。

復(fù)方傷痛膠囊的分子靶點(diǎn)治療網(wǎng)絡(luò)機(jī)制復(fù)雜，本研究通過構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)及“關(guān)鍵成分-重要靶標(biāo)-映射通路”網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)數(shù)據(jù)系統(tǒng)分析后，篩選出核心活性成分及作用靶標(biāo)，并進(jìn)行生物學(xué)信息分析，預(yù)測(cè)復(fù)方傷痛膠囊治療骨折的復(fù)雜機(jī)制，為進(jìn)一步的后續(xù)藥理研究奠定了扎實(shí)的前期基礎(chǔ)，也為更高效探究中藥治療復(fù)雜疾病的作用機(jī)制提供了科學(xué)的思路和方向。