楊 燕 劉德智 付 云 高尚蘭（新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第四臨床學(xué)院重癥醫(yī)學(xué)科二區(qū)，新鄉(xiāng) 453003）

膿毒血癥、膿毒血癥休克綜合征是當(dāng)今醫(yī)學(xué)的難點(diǎn)問題。每年約有3 000 萬新發(fā)病例，600 萬人病死，該病的治療選擇非常有限［1-2］。microRNA（miRNA）可以更好地診斷膿毒血癥，并有助于診斷、治療措施［3］。miR-579-3p 雖在膿毒血癥中出現(xiàn)異常，但其具體的功能及機(jī)制尚未十分清楚［4］。編碼人中性粒細(xì)胞肽1-3（human neutrophilic peptide 1-3，HNP1-3）的α 防御素1-3（alpha-defensin 1-3，DEFA1/DEFA3）基因在膿毒血癥中出現(xiàn)基因異常上調(diào)，并且與膿毒血癥患者的病情惡化和生存有關(guān)［5-6］。本研究旨在探討miR-579-3p、DEFA3 在膿毒血癥中的功能及相互作用關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 100只6周齡雌性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量（13±2）g，購自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所；過表達(dá)miR-579-3p 轉(zhuǎn)基因小鼠、敲減DEFA1/DEFA3 轉(zhuǎn)基因小鼠均購自賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司；血漿miRNA 提取試劑盒購自北京百奧萊博生物公司；血漿蛋白提取試劑盒購自上?？道噬锟萍加邢薰?；小鼠TNF-α檢測試劑盒、IL-8檢測試劑盒購自南京森貝伽生物公司；IL-6檢測試劑盒購自武漢賽培生物科技有限公司；半胱氨酸天冬氨酸酶1（Caspase-1）活性檢測試劑盒購自Biovision；末端標(biāo)記法（TUNEL）染色試劑盒購自北京博爾邁生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物公司。

1.2 方法

1.2.1 膿毒血癥小鼠模型的建立 參照趙喆等［7］在研究中使用的盲腸結(jié)扎法建立膿毒血癥小鼠模型。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)共分為5組，每組20只小鼠，分別為Blank組、Control組、Model組、miR-579-3p組、si-DEFA3組。各組的處理方法為：Blank組不做任何處理，正常飼養(yǎng)；Control組做同樣的操作，不結(jié)扎盲腸；miR-579-3p 組為將過表達(dá)miR-579-3p 的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行盲腸結(jié)扎操作，si-DEFA3 組為將敲減DEFA3的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行盲腸結(jié)扎操作。

1.2.3 ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測小鼠血清中TNF-α、IL-8 和IL-6 的水平 眼眶靜脈采血法采集小鼠的血液，2 000 g 離心15 min 收集血清。用小鼠TNF-α 檢測試劑盒、小鼠IL-8檢測試劑盒、小鼠IL-6檢測試劑盒分別檢測血清中TNF-α、IL-8和IL-6的含量。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測內(nèi)皮細(xì)胞焦亡 按照張鑫紅等［8］的方法分離和培養(yǎng)Blank組、Control組、Model組、miR-579-3p組、si-DEFA3組小鼠的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞。具體步驟為：在無菌條件下剪取肺組織接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿，不加培養(yǎng)基，待組織塊貼壁后加入DMEM 完全培養(yǎng)基。48 h 后肺血管內(nèi)皮細(xì)胞開始生長，72 h 后，取出組織塊，1 d 更換1 次培養(yǎng)液，至第8 天。以后開始正常培養(yǎng)2 d 更換1 次培養(yǎng)液。用Caspase-1 活性檢測試劑盒和TUNEL 染色試劑盒檢測Caspase-1陽性和PI陽性的細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測雙陽性的細(xì)胞。將雙重染色細(xì)胞的百分比作為焦亡細(xì)胞的百分比。

1.2.5 qRT-PCR 檢測小鼠血漿中miR-579-3p 的表達(dá) 將小鼠血漿用血漿miRNA 提取試劑盒提取miRNA，并將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-80℃保存?zhèn)溆?。用qRT-PCR 檢測cDNA 中miR-579-3p 的表達(dá)，結(jié)果以U6 為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)。所用引物為：miR-579-3p（5'-3'），正向引物CGTGCCGTTCATTTGGTATAAAC，反向引物CGTGCCGTTCATTTGGTATAAAC；U6（5'-3'），正向引物CTCGCTTCGGCAGCACA，反向引物AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.2.6 Western blot檢測小鼠血漿中DEFA3蛋白表達(dá) 將小鼠血漿用血漿蛋白提取試劑盒提取總蛋白，進(jìn)行BCA 定量后，沸水煮沸10 min 變性處理。取上清液用于蛋白電泳檢測，將凝膠上的蛋白用轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。將膜2%脫脂奶粉封閉后，一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜。取出膜，在室溫下二抗（1∶500）孵育2 h。最后用ECL電化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)膜進(jìn)行顯影曝光，再用Quantity One 4.62 軟件分析條帶的灰度。

1.2.7 生物信息學(xué)分析 通過生物信息在線預(yù)測網(wǎng)站Starbase（http：//starbase.sysu.edu.cn）預(yù)測miR-579-3p的潛在靶基因。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-579-3p 與DEFA3 的結(jié)合 首先構(gòu)建野生型（DEFA3 WT）和突變型（DEFA3 MUT）的DEFA 3'UTR 載體。操作時(shí)需要把純化的質(zhì)?？寺≈羛siCHECK2 載體，成功構(gòu)建熒光載體psiCHECK2-DEFA3 WT 和psiCHECK2-DEFA3 MUT。選用培養(yǎng)48 h 的293T 細(xì)胞，用2倍量的脂質(zhì)體法將熒光載體質(zhì)粒與miR-NC、miR-579-3p、anti-miR-NC、anti-miR-579-3p 共轉(zhuǎn)染至該細(xì)胞。最后按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒操作手冊(cè)要求操作，結(jié)果分析中，熒光活性的變化以海腎熒光素酶活性與螢光蟲熒光素酶活性的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)專用軟件PEMS3.2 進(jìn)行所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，醫(yī)學(xué)繪圖軟件Graph-Pad Prism 7 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)圖片繪制。計(jì)量資料用表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析SNK-q檢驗(yàn)，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膿毒血癥小鼠模型的炎癥因子表達(dá) ELISA實(shí)驗(yàn)檢測小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-8 和IL-6的含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的焦亡。結(jié)果如表1所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-8、IL-6的含量均明顯上調(diào)，內(nèi)皮細(xì)胞焦亡率明顯升高（P＜0.05）。

表1 膿毒血癥小鼠模型中炎癥因子的表達(dá)（，n=20）Tab.1 Expressions of inflammatory factors in sepsis mouse model（，n=20）

表1 膿毒血癥小鼠模型中炎癥因子的表達(dá)（，n=20）Tab.1 Expressions of inflammatory factors in sepsis mouse model（，n=20）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05.

2.2 miR-579-3p、DEFA3 在膿毒血癥小鼠血漿中的表達(dá) 結(jié)果如圖1 和表2 所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血漿中miR-579-3p 的mRNA 表達(dá)顯著升高，DEFA3蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

圖1 DEFA3的蛋白表達(dá)Fig.1 Protein expression of DEFA3

表2 膿毒血癥小鼠血漿中miR-579-3p、DEFA3 的表達(dá)（，n=20）Tab.2 Expressions of miR-579-3p and DEFA3 in plasma of sepsis mice（，n=20）

表2 膿毒血癥小鼠血漿中miR-579-3p、DEFA3 的表達(dá)（，n=20）Tab.2 Expressions of miR-579-3p and DEFA3 in plasma of sepsis mice（，n=20）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05.

2.3 過表達(dá)miR-579-3p 的轉(zhuǎn)基因膿毒血癥小鼠血清炎癥因子表達(dá)和內(nèi)皮細(xì)胞焦亡 結(jié)果如表3 所示，與模型組相比，miR-579-3p 組小鼠血清中miR-579-3p mRNA 表達(dá)顯著升高，TNF-α、IL-8、IL-6 的含量均明顯降低，內(nèi)皮細(xì)胞焦亡率明顯降低（P＜0.05）。

表3 過表達(dá)miR-579-3p的轉(zhuǎn)基因膿毒血癥小鼠血清炎癥因子表達(dá)和內(nèi)皮細(xì)胞焦亡（，n=20）Tab.3 Overexpression of serum inflammatory factors and endothelial pyroptosis in transgenic sepsis mice with miR-579-3p（，n=20）

表3 過表達(dá)miR-579-3p的轉(zhuǎn)基因膿毒血癥小鼠血清炎癥因子表達(dá)和內(nèi)皮細(xì)胞焦亡（，n=20）Tab.3 Overexpression of serum inflammatory factors and endothelial pyroptosis in transgenic sepsis mice with miR-579-3p（，n=20）

Note：Compared with model group，1）P＜0.05.

2.4 敲減DEFA3的轉(zhuǎn)基因膿毒血癥小鼠血清炎癥因子表達(dá)和內(nèi)皮細(xì)胞焦亡 結(jié)果如圖2 和表4 所示，與模型組相比，si-DEFA3 組小鼠血漿中DEFA3蛋白表達(dá)顯著降低，血清中TNF-α、IL-8、IL-6的含量均明顯降低，內(nèi)皮細(xì)胞焦亡率明顯降低（P＜0.05）。

表4 敲減DEFA3的轉(zhuǎn)基因膿毒血癥小鼠血清炎癥因子表達(dá)和內(nèi)皮細(xì)胞焦亡（，n=20）Tab.4 Reduced serum inflammatory factors and endothelial pyroptosis in DEFA3 transgenic sepsis mice（，n=20）

表4 敲減DEFA3的轉(zhuǎn)基因膿毒血癥小鼠血清炎癥因子表達(dá)和內(nèi)皮細(xì)胞焦亡（，n=20）Tab.4 Reduced serum inflammatory factors and endothelial pyroptosis in DEFA3 transgenic sepsis mice（，n=20）

Note：Compared with model group，1）P＜0.05.

圖2 敲減DEFA3 的轉(zhuǎn)基因膿毒血癥小鼠的DEFA3 蛋白表達(dá)Fig.2 Protein expression of DEFA3 in DEFA3 transgenic sepsis mice

2.5 miR-579-3p 靶向DEFA3 通過在線預(yù)測網(wǎng)站Starbase（http：//starbase.sysu.edu.cn）預(yù)測到miR-579-3p與DEFA3之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)（圖3）。與miR-NC 組相比，miR-579-3p 組DEFA3 WT 的293T細(xì)胞熒光活性顯著降低，與anti-miR-NC 組相比，anti-miR-579-3p 組DEFA3 WT 的293T 細(xì)胞熒光活性顯著升高。見表5。

表5 miR-579-3p結(jié)合DEFA3（，n=20）Tab.5 miR-579-3p binding to DEFA3（，n=20）

表5 miR-579-3p結(jié)合DEFA3（，n=20）Tab.5 miR-579-3p binding to DEFA3（，n=20）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05；compared with antimiR-NC group，2）P＜0.05.

圖3 miR-579-3p直接調(diào)控DEFA3表達(dá)Fig.3 miR-579-3p directly regulates expression of DEFA3

3 討論

膿毒血癥的初始階段涉及促炎細(xì)胞因子的過度分泌，這會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的機(jī)體損傷［9］。microRNA 在膿毒血癥過程中可以調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，也可調(diào)節(jié)膿毒血癥中的血管屏障和內(nèi)皮功能［10］。EI 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒血癥小鼠中miR-579 的表達(dá)異常升高，并且在脂多糖誘導(dǎo)的耐受細(xì)胞中表達(dá)也發(fā)生明顯升高，miR-579 可靶向TNF-α，這說明該miRNA 在膿毒血癥中具有積極的治療作用。楊培雄等［12］發(fā)現(xiàn)，TNF-α 在膿毒血癥老年患者血清中表達(dá)異常升高，并且與患者病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。猜測miR-579-3p 在膿毒血癥中具有積極的治療作用。為了驗(yàn)證此猜測，本研究建立了膿毒血癥小鼠模型和過表達(dá)miR-579-3p 的轉(zhuǎn)基因膿毒血癥小鼠模型，檢測其中miR-579-3p 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-579-3p 在膿毒血癥模型小鼠血漿中表達(dá)異常升高，而在過表達(dá)miR-579-3p 轉(zhuǎn)基因膿毒血癥小鼠血漿中的表達(dá)水平更高，這說明miR-579-3p 在膿毒血癥小鼠中的表達(dá)異常升高；在膿毒血癥小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-8、IL-6的表達(dá)水平均升高，內(nèi)皮細(xì)胞的焦亡率也發(fā)生明顯升高，而在過表達(dá)miR-579-3p的轉(zhuǎn)基因膿毒血癥小鼠中TNF-α、IL-8、IL-6 的表達(dá)降低，內(nèi)皮細(xì)胞的焦亡率也顯著降低，這說明miR-579-3p 在膿毒血癥小鼠中具有積極治療作用。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-579-3p可靶向調(diào)控DEFA3。

膿毒血癥期間各種體液（血液、支氣管肺泡灌洗液和痰液）中HNP1-3 的水平大大增加，并且編碼HNP1-3 基因的DEFA1/DEFA3 存在大量變異，明顯影響膿毒血癥患者的臨床表型，且DEFA1/DEFA3基因升高的中國漢族患者更容易發(fā)生嚴(yán)重的膿毒血癥［13-14］。CHEN等［15］在研究中報(bào)道，具有較高表達(dá)DEFA1/DEFA3基因的小鼠比具有較低表達(dá)DEFA1/DEFA3 的小鼠或野生型小鼠具有更嚴(yán)重的敗血癥相關(guān)的器官損傷和高病死率。從機(jī)制上講，嗜中性粒細(xì)胞肽1 通過嘌呤受體（P2X7）介導(dǎo)的典型半胱氨酸天冬氨酸酶1活化以炎癥小體依賴性方式誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞焦亡。CHEN等［14］研究發(fā)現(xiàn)，DEFA1/DEFA3是參與嚴(yán)重膿毒血癥宿主免疫應(yīng)答的重要基因組分。DEFA1/DEFA3 表達(dá)升高與嚴(yán)重膿毒血癥風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。本研究檢測了膿毒血癥模型小鼠、敲減DEFA1/DEFA3 轉(zhuǎn)基因膿毒血癥小鼠血漿中DEFA3基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DEFA3在膿毒血癥小鼠中表達(dá)異常升高，而在敲減DEFA1/DEFA3 轉(zhuǎn)基因膿毒血癥小鼠中表達(dá)降低，并且敲減DEFA1/DEFA3 后，小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-8、IL-6的表達(dá)降低，內(nèi)皮細(xì)胞焦亡率顯著降低，這說明敲減DEFA1/DEFA3基因?qū)δ摱狙Y患者的治療具有重要指導(dǎo)價(jià)值。miR-579-3p 和DEFA3 在膿毒血癥小鼠模型中的表達(dá)均為異常上調(diào)，但是二者在膿毒血癥中發(fā)揮的作用卻不同。miR-579-3p 發(fā)揮抑制膿毒血癥患者的炎癥反應(yīng)，而DEFA3則發(fā)生相反的作用。

綜上所述，miR-579-3p 在膿毒血癥小鼠中具有抗炎、抗焦亡的作用，其機(jī)制與靶向DEFA3 基因相關(guān)，本研究為膿毒血癥的治療提供新方向。