姚平波 劉雨露 朱子貴 趙 紅 張建新（長沙民政職業(yè)技術學院，長沙 410004）

肺癌是最常見的致死癌癥種類之一，全球每年大約新增140萬肺癌新病例［1-2］。兩種主要的肺癌亞型是小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），二者比例分別為15%～20%和80%～85%［3］。盡管隨著醫(yī)學研究的發(fā)展，NSCLC 的發(fā)生率在不斷減少，但其引起的病死率仍然很高，這可能與早期的快速轉移有關［4-6］。因此，尋找新的靶標和預后的生物標志物具有深遠的意義。microRNA（miRNA）是小的非編碼RNA 分子，通過互補堿基配對調節(jié)轉錄后蛋白質的表達［7］。miRNA通過多種信號通路參與腫瘤的形成、侵襲、遷移和轉移，揭示了其作為癌癥治療靶點的作用［8-9］。隨著基因測序技術的發(fā)展，miRNA 在肺癌組織和癌旁組織中的表達已經(jīng)被檢測［10］。研究發(fā)現(xiàn)miR-95-5p 參軟骨形成、敗血癥等多種疾病，但miR-95-5p 在肺癌中功能的相關研究較少［11-12］。這項研究的目的是研究miR-95-5p 在NSCLC 中的表達水平及其作為肺癌治療靶標的潛力。本研究對患者的原發(fā)性肺癌組織及細胞系進行了分析。以及揭示了miR-95-5p 對抑制癌細胞增殖和侵襲的治療作用，并進一步確定了其靶基因SATB1和下游途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 正常肺細胞系HBE 和NSCLC 細胞系SPC-A1、H460、H1650和A549購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液購自上?；鄯f生物科技有限公司；miR-NC、miR-95-5p mimic、pc-NC、pc-SATB1 質粒及各種引物的設計與合成由今唯智生物公司完成；Lipofectamine2000轉染試劑購自上海恪敏生物科技有限公司；BCA 試劑盒、cDNA 逆轉錄試劑盒購自廣州市智取生物科技有限公司；SYBRGreen PCR 試劑盒購自上海天篩科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、SATB1 兔來源的單克隆抗體購自上海艾博抗生物科技有限公司。Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司；CytoFLEX 流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.1.2 組織來源 南華大學附屬南華醫(yī)院進行手術時收集68 例NSCLC 患者腫瘤組織及腫瘤相鄰的正常組織，所有患者均簽署了有關臨床數(shù)據(jù)的書面知情同意書。該研究根據(jù)《赫爾辛基宣言》的道德準則進行，并獲得南華大學附屬南華醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 細胞及培養(yǎng) 正常肺細胞系HBE 和NSCLC細胞系SPC-A1、H460、H1650 和A549 所有細胞培養(yǎng)在37℃、5%CO2條件下，體積分數(shù)為10%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中。

1.2.2 RT-qPCR 檢 測miR-95-5p 與SATB1 mRNA的表達 將收集的組織樣品剪碎并研磨，用QIAzol裂解試劑提取總RNA，并用cDNA 逆轉錄試劑盒合成cDNA。將各細胞分別接種在6孔板中，當細胞達到近85%融合時，用QIAzol裂解試劑提取了總RNA，再通過cDNA 逆轉錄試劑盒合成cDNA，并按照SYBR-Green PCR 試劑盒說明書操作進行RT-qPCR測定。反應條件為：52℃2 min、95℃10 min、96℃15 s 和60℃1 min 的40 個循環(huán)，用U6 標準化，使用2-ΔΔCt方法計算。miR-95-5p 的正向引物序列：5'-GTGCCTGTTGCGTCTC-3'，反向引物序列：5'-GAAAGCCTAGCCGTATTCG-3'；SATB1 的正向引物序列：5'-GATGGGGTCAGATGGAGAGA-3'，反向引物序列：5'-GAGACACCCTGGCATTGTTT-3'；U6 的正向引物序列：5'-GACCGAGTGTAGCAAGG-3'，反向引物序列：5'-GTTCTTCCGAGAACATATAC-3'。

1.2.3 細胞轉染 將培養(yǎng)至對數(shù)期的各細胞接種于6孔板，每孔約1×106個細胞，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。當達到85% 融合，根據(jù)Lipofectamine 2000 說明書將100 nmol/L 的miR-NC、miR-95-5p mimic、pc-NC、pc-SATB1 質粒分別或聯(lián)合轉染至H1650或A549細胞。

1.2.4 CCK-8 試劑盒檢測細胞增殖 將處理后的H1650 和A549 細胞接種至96 孔板（1×105個/孔）中，然后分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h和72 h。使用細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）試劑盒（Dojindo）來檢測細胞增殖能力，然后將CCK-8和培養(yǎng)基以1∶10的比例混合以制備混合溶液。丟棄先前使用的培養(yǎng)基，并在遠離光的37℃下添加110 μl 的混合培養(yǎng)基再孵育1 h。最終，通過ELISA 檢查450 nm 處的OD 值，并且在每組中設置6個重復孔。

1.2.5 Transwell 實驗檢測細胞侵襲 將Transwell小室置于24 孔板上方。先用胰蛋白酶消化，然后將轉染的H1650 和A549 細胞懸浮在無血清培養(yǎng)基中，用細胞計數(shù)板計數(shù)。將細胞用無血清培養(yǎng)基稀釋，將其密度調整為1×105個/ml，并向該室中添加上述細胞懸液。然后在培養(yǎng)箱中向無菌24 孔板中的細胞添加含10%FBS 的培養(yǎng)基。48 h 后，棄去培養(yǎng)基，然后用PBS 洗滌，取出Transwell 小室并用4%多聚甲醛固定30 min。加入0.5%的結晶紫染色10～15 min 后，用PBS 沖洗染色劑。最后，使用顯微鏡進行細胞的觀察和計數(shù)。

1.2.6 雙熒光素酶報告檢測miR-95-5p 和SATB1靶向關系 將SATB1 轉錄物的3'UTR 的序列克隆到含有熒光素酶報告基因作為WT 3'UTR 基團的載體pGL3 中。使用定點誘變試劑盒將3'UTR 上的miRNA 的關鍵結合區(qū)突變?yōu)闊o效的結合序列，以形成控制質粒MUT 3'UTR 組。每組均轉染miR-95-5p模擬物和海腎熒光素酶質粒。轉染24 h 后，將細胞培養(yǎng)液完全吸出。根據(jù)試劑盒的要求，加入適量的裂解液以完全裂解細胞。離心后，收獲100μl 裂解物的上清液用于測定。用螢火蟲熒光素酶測定的RLU 值除以海腎熒光素酶測定的RLU 值（以螢火蟲熒光素酶為內(nèi)參）。根據(jù)獲得的比率，比較不同樣品靶報道基因的激活程度。

1.2.7 Western blot 檢測SATB1 蛋白相對表達水平 通過在12 000 g和4℃下離心20 min，提取總蛋白，并通過BCA 蛋白測定試劑盒（Beyotime）評估其濃度。然后，在10%SDS-PAGE 中分離出相同量的總蛋白，并轉移到硝酸纖維素膜上，然后用5%脫脂奶粉在含0.5%Tween-20 的TBS 中密封1 h。之后，加入一抗（SATB1 1∶1 000、GAPDH 1∶1 000、β-catenin 1∶5 000、β-actin 1∶1 000）以在4℃下孵育過夜，然后漂洗蛋白質并與二抗在室溫下孵育2 h，加顯影液，于Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)中曝光，使用軟件ImagePro plus6.0分析蛋白條帶，蛋白的相對表達水平為目標蛋白積分吸光度值與內(nèi)參蛋白GAPDH 積分吸光度值比值。

1.3 統(tǒng)計學分析 所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)通過SPSS19.0分析，圖形采用GraphPad Prism 6.0 構建。實驗數(shù)據(jù)以表示，數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk 檢驗發(fā)現(xiàn)均呈正態(tài)分布，多組比較進行One-Way ANOVA 分析，兩組比較使用SNK檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-95-5p 在NSCLC 中的表達情況 為了評估m(xù)iR-95-5p 在NSCLC 中的表達水平，檢測了癌組織和癌旁正常組織、肺癌細胞和正常細胞中miR-95-5p 表達水平。與癌旁正常組織比較，miR-95-5p在肺癌組織中表達下調（圖1A，P＜0.01）；與正常肺癌細胞HBE 相比，NSCLC 細胞SPC-A1、H460、H1650 和A549 中miR-95-5p 表達下調（圖1B，P＜0.01）。上述結果顯示，A549 和H1650 細胞中miR-95-5p 表達較低，故選擇A549 和H1650 細胞進行后續(xù)試驗。為了驗證miR-95-5p 表達對NSCLC A549和H1650 細胞生物學行為的影響，本課題組對細胞進行了分組轉染。與miR-NC 組相比，miR-95-5p mimic 組NSCLC A549 和H1650 細胞miR-95-5p 表達上調（圖1C，P＜0.01），表明轉染成功，可進行后續(xù)試驗。

圖1 RT-qPCR檢測miR-95-5p mRNA 的表達水平Fig.1 miR-95-5p mRNA expression level detected by RT-qPCR

2.2 miR-95-5p 抑制A549 和H1650 細胞增殖和侵襲 為了評估m(xù)iR-95-5p 過表達對NSCLC A549 和H1650 細胞增殖和侵襲的影響，運用CCK-8 試劑盒檢測了各組細胞的增殖能力，運用Transwell 實驗檢測了各組細胞的侵襲能力。與miR-NC 組相比，miR-95-5p mimic 組NSCLC A549 和H1650 細胞增殖能力受到明顯抑制（圖2A，P＜0.01）。與miR-NC 組相比，miR-95-5p mimic 組NSCLC A549 和H1650 細胞侵襲能力也受到明顯抑制（圖2B，P＜0.01）。以上結果表明，miR-95-5p 抑制NSCLC A549 和H1650 細胞增殖和侵襲。

圖2 miR-95-5p 對A549 和H1650 細胞增殖和侵襲能力的影響Fig.2 Effects of miR-95-5p on proliferation and invasion of A549 and H1650 cells

2.3 miR-95-5p 與SATB1 存在靶向關系 為了評估m(xù)iR-95-5p 對H1650 和A549 細胞增殖和侵襲抑制相關機制，研究了miR-95-5p 與SATB1 在非小細胞肺癌中的相關性。TargetScan 數(shù)據(jù)庫的預測結果顯示，miR-95-5p 與SATB1 3'UTR 區(qū)存在結合位點（圖3A）。為了進一步確認二者關系，通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證二者靶向關系。結果顯示在含有野生型SATB1 質粒細胞中，miR-95-5p 高表達顯著抑制熒光素酶活性（P＜0.01，圖3B），但在含有突變型SATB1 質粒細胞中，miR-95-5p 高表達對熒光素酶活性并無影響。Western blot 評估SATB1 表達結果如圖3C 所示，與miR-NC 組細胞相比，miR-95-5p組細胞中SATB1表達水平顯著下降；RT-qPCR評估SATB1 表達結果如圖3D 所示，與miR-NC 組細胞相比，miR-95-5p 組細胞中SATB1 明顯下降（P＜0.01）。以上結果表明miR-95-5p 與SATB1 存在良好的靶向關系。

圖3 miR-95-5p與SATB1靶向關系Fig.3 Targeting relationship of miR-95-5p and SATB1

2.4 SATB1對A549和H1650細胞增殖和侵襲的影響 由于SATB1 是miR-95-5p 的靶基因，因此檢查了SATB1 在肺癌患者組織中的表達。結果表明，癌組織中的SATB1 表達明顯高于正常組織（P＜0.01，圖4A）。用SATB1 過表達質粒轉染A549 和H1650細胞后，SATB1 表達顯著升高（P＜0.01，圖4B）。CCK-8 和Transwell 分析的結果表明，SATB1 表達的上調顯著促進了肺癌A549 和H1650 細胞的增殖和侵襲能力（P＜0.01，圖4C、D）。

圖4 SATB1可促進A549和H1650細胞增殖和侵襲Fig.4 SATB1 can promote proliferation and invasion of A549 and H1650 cells

2.5 miR-95-5p 通過抑制SATB1 表達發(fā)揮增殖和侵襲抑制作用 如圖5A 所示，SATB1 在A549 和H1650 細胞中過表達后，β-catenin 表達水平顯著升高。如圖5B 所示，升高的miR-95-5p 抑制了βcatenin 表達，但升高的SATB1 使其部分恢復。為了探討miR-95-5p 是否通過降低SATB1 發(fā)揮作用，開展了實驗。實驗結果證實，miR-95-5p 表達增加后，A549 和H1650 細胞的增殖能力和侵襲能力顯著降低。然而，miR-95-5p和SATB1的表達均升高后，細胞的增殖能力和侵襲能力有所升高（圖5C、D）。這表明miR-95-5p 可降低SATB1 的表達并通過其靶基因SATB1 抑制Wnt/β-catenin 信號通路的激活進而抑制A549和H1650細胞的增殖和侵襲能力。

圖5 miR-95-5p 通過抑制SATB1 表達發(fā)揮增殖和侵襲抑制作用Fig.5 miR-95-5p exerts proliferation and invasion inhibitory effects by inhibiting expression of SATB1

3 討論

目前NSCLC 治療最有前途的方法是手術切除和化療，盡管近年來醫(yī)療水平有很大的進步，但NSCLC 治療的耐藥性仍是治療的障礙之一［13］。因此，急需深入了解NSCLC致病機制并尋找NSCLC發(fā)病和發(fā)展的重要分子生物學標志。

miRNA 是用于癌癥的先進分子診斷和靶向分子治療的出色工具［14］。最初認識到miRNA 在腫瘤發(fā)生中的作用是研究人員發(fā)現(xiàn)miRNA 基因在白血病患者中被特異性刪除［15］。多項研究表明miRNA與腫瘤的侵襲性和轉移潛力有關，被認為是包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥的診斷和預后標志物［16-17］。例如，miR-449、miR-141 等在NSCLC 中發(fā)揮抑癌作用，miR-155、miR-19b 等在NSCLC 中發(fā)揮致癌作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)miR-95-5p參與敗血癥、軟骨形成等疾病，但其在腫瘤中的報道相對較少。在本研究中，NSCLC組織和細胞SPC-A1、H460、H1650 和A549 中miR-95-5p 表達下調，推 測miR-95-5p 在NSCLC 中發(fā)揮抑癌作用。癌細胞的快速增殖能力和較強的侵襲能力是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要推動因素［18］。因此控制腫瘤細胞的增殖和侵襲情況對癌癥的治療至關重要。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-95-5p 過表達明顯抑制A549 和H1650 細胞增殖和侵襲，可見miR-95-5p在NSCLC中起抑癌作用。

為了進一步揭示miR-95-5p 的潛在作用機制，進行了生物信息學分析。使用TargetScan 數(shù)據(jù)庫預測miR-95-5p 的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-95-5p 與SATB1 3'UTR 區(qū)存在結合位點，并通過雙熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)在含有野生型SATB1質粒細胞中，miR-95-5p高表達顯著抑制熒光素酶活性，但在含有突變型SATB1質粒細胞中，miR-95-5p高表達對熒光素酶活性并無影響，結果表明SATB1 是miR-95-5p 潛在的靶標基因。SATB1 是一種核基質相關蛋白，通過染色質重塑機制起作用來調節(jié)多個基因的表達［19］。SATB1 與Wnt-β-catenin 途徑相互作用，并且還與許多類型的癌癥相關［20-21］。已知Wnt/β-catenin 信號傳導通過調節(jié)多功能β-catenin 蛋白的能力來調節(jié)眾多細胞過程，包括增殖、侵襲和分化，而β-catenin 蛋白質是Wnt/β-catenin途徑中的重要信號分子［22-23］。

在本研究中，評估了SATB1 在肺癌中的表達，結果表明SATB1 在肺癌組織中高表達，并且與miR-95-5p表達呈反向。在A549和H1650細胞中，SATB1可能上調β-catenin 的表達，從而激活Wnt/β-catenin信號通路。同時，miR-191-5p 可以降低β-catenin 表達，而SATB1 的上調可以挽救這種效應。功能實驗表明，上調SATB1 可以部分改善miR-95-5p 對細胞增殖和侵襲的抑制作用。綜上所述，推測miR-95-5p可能會抑制SATB1表達，然后部分抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，從而抑制A549和H1650細胞增殖和侵襲能力。

綜上所述，miR-95-5p 過表達靶向SATB1 抑制Wnt/β-catenin 信號通路的激活進而抑制NSCLC 細胞H1650 和A549 的增殖及侵襲，因此miR-95-5p 和SATB1 有望成為NSCLC 的治療靶點。本實驗僅為體外細胞實驗，有待進一步研究動物體內(nèi)實驗及相關的分子信號通路。