王炳臣，匡少平*，鄭陽，史大磊，趙海濤，于貞貞，趙常兵，程飛

(1. 青島科技大學環(huán)境與安全工程學院，山東 青島 266042；2. 中國石油化工股份有限公司勝利油田分公司海洋采油廠，山東 東營 257237；3. 東營市海洋發(fā)展研究院，山東 東營 257091；4. 東營市投資促進局，山東 東營 257000；5. 濰坊市市政公用事業(yè)服務中心，山東 濰坊 261071)

黃河三角洲是中國北方最大的新生濕地，在污染物沉積、水分和溫度調(diào)節(jié)方面具有重要作用[1]。河流泥沙在渤海潮間帶沉積形成低潮灘鹽土濕地，持續(xù)堆積促進低潮灘升高脫鹽，形成的中、高潮灘逐漸被鹽地堿蓬、檉柳和蘆葦?shù)戎脖桓采w[2]，由低到高的潮灘植被變化在時間上存在生物演替過程。其中，蘆葦植被定植土壤是濕地碳匯的主力，在維持土壤水分、減少水土流失、豐富動植物類型和平衡周邊溫度變化方面具有重要作用[3]。沉積輸入的重金屬也在植被演替過程中，由離子態(tài)變?yōu)榻j合態(tài)最終以沉淀態(tài)固定在底層，不再進入生態(tài)環(huán)境，實現(xiàn)了自然凈化。然而，植被演替和濕地功能實現(xiàn)的起點來源于最初耐鹽植被的定植，即鹽地堿蓬在低潮灘持續(xù)生長。

低潮灘新生濕地常年受到海水侵蝕[4]，陽光照射又為侵蝕海水蒸騰提供動力，加劇了鹽漬化進程阻礙植被生長，破壞了土壤生態(tài)功能,促進了微生物種間競爭。鹽地堿蓬作為典型濱海耐鹽植被，株高約20～80 cm，可以借助體內(nèi)水分進行耐鹽生長[5]。其根系固定低潮灘表層土壤[6]，有助于降水、潮汐與河流沖刷下的土壤脫鹽。植株定植形成的陰影避免了陽光的直接照射，緩解了蒸騰效果。但低潮灘鹽地堿蓬植被結構單一，土壤鹽漬化程度高且抗逆性差，容易受到人為活動破壞，不易恢復。

低潮灘本身具有海水供排和交通運輸便利的優(yōu)勢[7]，是海產(chǎn)品養(yǎng)殖的重要區(qū)域。東營市永豐河口曾是極具觀賞和生態(tài)價值的濱?！凹t地毯”——鹽地堿蓬植被區(qū)[8]，后開發(fā)為水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)提供了豐富海產(chǎn)品。近年來，隨著自然生態(tài)需求和養(yǎng)殖技術的發(fā)展，區(qū)域內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖的社會經(jīng)濟價值逐漸降低，但碳匯、生物多樣性和景觀資源等生態(tài)價值逐漸增高[7]，因此鹽地堿蓬定植成為了該區(qū)域生態(tài)修復的主要方式。環(huán)渤海濕地研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，鹽地堿蓬可以顯著提高土壤微生物多樣性，在持續(xù)的脫鹽和元素積累過程中，改善群落生境，提高代謝功能[9]，耐鹽性較低的微生物逐漸會成為優(yōu)勢菌群。林學政等[10]發(fā)現(xiàn)鹽地堿蓬定植后，黃河三角洲濱海濕地中枯草桿菌(Bacillussubtilis)成為了優(yōu)勢菌屬。Cong等[11]發(fā)現(xiàn)在植被定植的不同階段，土壤總磷脂、脂肪酸含量均有所增加，影響了微生物的總量和組成。其中，植被死亡促進了土壤中有機物分解者增加，豐富了土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)、細菌和古菌群落[12]，增加的菌群又促進了鹽地堿蓬定植擴散，從而形成了正向循環(huán)改善濱海濕地生態(tài)功能。

基于此，永豐河口及其周邊已納入東營渤海污染攻堅戰(zhàn)生態(tài)修復項目區(qū)，進行維護和養(yǎng)殖池清除，由承擔單位在此基礎上繼續(xù)進行鹽地堿蓬修復工作。青島科技大學負責修復后生源要素N、細菌和古菌群落結構變化情況研究。根據(jù)樣點分布和根植情況，永豐河口修復區(qū)可以分為：岸邊生長區(qū) (Shoreside Vegetation Zone, SG)、岸邊高鹽土未生長區(qū) (High Saline Soil Zone Without Vegetation, HSW)、鹽土生長區(qū) (High Saline Soil Vegetation Zone, HSG)、河邊未根植區(qū) (Riverside Zone Without Vegetation, RW)、河邊未生長過渡區(qū) (Riverside Transition Zone Without Vegetation, RTW) 和河邊生長區(qū) (Riverside Vegetation Zone, RG)。其中，RG是修復的核心區(qū)域，其他區(qū)域植被可能來源于自發(fā)生長，也可能是修復后堿蓬種子脫落自發(fā)定植的結果[13]。相比RG，岸邊有防潮堤為小型動物提供了生存空間[14]，且人類活動和岸內(nèi)植被也為動物提供了食物，因此岸邊相關的SG和HSW受到更多人類活動和動物影響。

前期團隊已經(jīng)開展了復植分析和探究工作，但在土壤微生物和理化性質(zhì)方面研究較少，所以本研究針對不同修復情況下表層土壤微生物和理化性質(zhì)分析，探索植被春季萌發(fā)時表層土壤微生物的群落結構變化，分析其中的主要微生物及其功能，為加快植被修復和提高復植成功率提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 原位土壤樣品采集

根據(jù)實際修復情況，在2021年4月選擇如圖1所示的I-VI共6個典型樣點 (SG、HSW、HSG、RW、RTW和RG) 采集原位表層土壤樣品。每個樣點使用無菌樹脂采樣器采集200 g土壤樣品于無菌自封袋內(nèi)混勻，并去除根莖、石塊等大型顆粒，收集于6個1.5 mL和3個50 mL無菌離心管內(nèi)放置在-20 ℃保溫箱內(nèi)，分別凍存于-80 ℃和-20 ℃冰箱內(nèi)用于微生物和理化性質(zhì)檢測。

圖1 采樣位點圖

1.2 土壤樣品檢測

pH和鹽度檢測：稱取10.0 g原位樣品于50 mL離心管內(nèi)，按1∶3.5(m/v)添加超純水振蕩30 min，結束后離心,分別使用pH和鹽度計進行檢測。

高通量檢測：原位土壤樣品中DNA利用FastDNATMSPIN Kit for soil試劑盒進行提取，并參照標準說明書流程操作，DNA樣品送至公司進行測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析和作圖

主要使用R語言、CANOCO 4.5、SPSS 19.0和SigmaPlot 10.0等軟件進行數(shù)據(jù)的分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)分析

表1 樣點特征與表層土壤理化性質(zhì)

2.2 土壤細菌和古菌多樣性

如圖2所示，植被根植后表層土壤微生物群落間差異較大，RG主要以Muribaculaceae(9.37%)、Inhella(8.61%) 和Halanaerobium(8.25%) 為主，特別是Halanaerobium在其他植被覆蓋的土壤樣品中含量較少。SG主要以Muribaculaceae(14.81%) 和Helicobacter(8.00%) 為主，而HSG主要以Marinobacter(20.19%) 和Halomonas(7.14%) 為主。未有植被生長的表層土壤微生物群落差異較小，主要以Marinobacter(5.75%～17.91%)、Halomonas(9.01%～10.92%) 和Muribaculaceae(5.91%～10.26%) 為主，其中Marinobacter和Muribaculaceae分別在RW與HSW兩個樣品中占比較少。如圖3所示，根植后表層土壤主要以Salinigranum(10.00%～34.17%) 和Halorubrum(12.08%～29.33%) 為主；未有植被生長的土壤主要以Halorubrum(12.54%～21.54%) 為主。其中，RW和RTW樣品中的Halogranum(12.74%～26.86%) 和Halolamina(14.30%～20.25%) 相對豐度較高，但在HSW中含量較少；RTW中Salinigranum相對豐度較高為11.25%。以上結果說明，鹽地堿蓬根植和覆蓋情況是影響表層土壤細菌群落的重要因素，而耐鹽則是濱海表層土壤中古菌的主要特征。

圖3 古菌組成熱圖

2.3 土壤微生物群落分析

如圖4所示，植被根植的表層土壤中微生物香農(nóng)指數(shù) (Shannon) 明顯小于未有植被的土壤 (P=0.05)，說明植被根植后土壤中細菌多樣性和豐度有所下降。在古菌方面，兩種不同根植情況的土壤表層微生物群落間Shannon (P=0.83) 和Observed species指數(shù) (p=0.83) 差異不明顯，說明低潮灘中鹽分相比植被在古菌組成上更具影響力。

圖4 細菌 (A) 和古菌 (B) 盒圖

通過PCoA分析(圖5)，樣品間細菌群落差異在第一和第二主坐標軸的總解釋量為56.6%，其中樣品來源導致的差異主要體現(xiàn)在第二主坐標軸，解釋量為22.6%。樣品中古菌差異總解釋量為56.7%，其中樣品來源差異體現(xiàn)在第一主坐標軸，解釋量為29.5%。韋恩圖分析發(fā)現(xiàn)(圖6)，不同樣點間相同細菌較少僅108個OTUs，其中SG和HSG的細菌群落更為接近，未有植被生長的土壤中河流兩岸RW和RTW共有796個OTUs高于其他樣品間共有數(shù)量。古菌方面 (圖7)，不同樣點共有OTU數(shù)為227,高于細菌，其中RW和RTW的共有OTU數(shù)最高為1 121，而植被生長的樣點中HSG和SG共有數(shù)次之為1 157。以上結果說明，樣點環(huán)境是除植被外影響微生物群落的原因之一；相比細菌，古菌更加保守且根植情況相同時相鄰樣點間差異更小。

圖5 細菌 (A) 和古菌 (B) PCoA分析

圖6 總體、植被生長和非生長土壤中細菌Venn分析

圖7 總體、植被生長和非生長土壤中古菌Venn分析

圖8 細菌 (A) 和古菌 (B) 群落結構與環(huán)境因子間的典型相關分析 (CCA)

3 討論

春季萌發(fā)時植被覆蓋情況不同的表層土壤微生物存在差異，其中植被根植造成的細菌差異約為22.6%，而在古菌間則為29.5% (圖5)[36]，但細菌受到的植被影響更加顯著 (p=0.05)。在植被覆蓋區(qū)域包括RG、SG和HSG等3種類型，其中以HSG的土壤鹽分含量最高，SG受到的人為活動影響最多且鹽分也較高，RG在進行堿蓬修復種植后未受到過多人為活動影響，因此SG和HSG中共有的細菌OTU最多 (圖6)[13]。在未有植被覆蓋的樣點中情況類似，但鹽分是主導其中細菌差異的主要原因[37]，除三者共有OTU外RW和RTW兩個低鹽土壤中共有的細菌OTU數(shù)越占10% (圖7)，大于兩者和HSW的高鹽環(huán)境所共有OTUs。古菌情況和細菌相似，其中植被的SG和HSG、非植被RW和RTW間共有OTU更多，同植被下三者間的共有OTU占比在10%左右。由此說明，細菌類型和功能更具多樣性而古菌更加保守[38-39]，植被根植后能夠有效改變土壤功能承擔者細菌的組成，鹽分是影響非植被覆蓋土壤細菌組成的重要因素[37]。

基于高通量結果對比了不同植被區(qū)微生物群落功能預測結果 (圖9)，未有植被覆蓋的土壤中大腸桿菌素 (PWY0-1338,P<0.001) 和多粘菌素抗性 (ENTBACSYN-PWY,P<0.05) 合成，煙酸 (PWY-722,P<0.001) 與糖降解 (PWY-6713,P<0.001) 以及分支酸 (ALL-CHORISMATE-PWY,P<0.001) 和L-蘇氨酸代謝 (THREOCAT-PWY,P<0.001) 的相關功能出現(xiàn)上調(diào)。相比之下，植被覆蓋的表層土壤中，硫氧化 (PWY-5304,P<0.05)、1,2-丙二醇降解 (PWY-7013,P<0.05) 和抗病毒的噻唑合成 (PWY-6891,P<0.01) 方面出現(xiàn)上調(diào)，說明植被根植為表層土壤微生物提供了充足的有機質(zhì)，促進了物質(zhì)循環(huán)和能量流動改善了微生物生態(tài)[36,40]；未有植被覆蓋的情況下各微生物間仍存在競爭關系，其降解和代謝活動更加頻繁但并未表現(xiàn)在元素循環(huán)等功能方面。

圖9 植被覆蓋和未覆蓋的表層土壤中微生物功能預測差異圖

4 結論

鹽地堿蓬修復后為土壤微生物功能多樣化修復提供了保障，營養(yǎng)鹽、人類和動物活動在一定程度上影響著土壤微生物群落結構，細菌相比古菌群落具有更豐富的功能和多樣性。未有植被覆蓋的情況下表層微生物以競爭為主，因而在污染物降解和抗菌素開發(fā)方面具有較好的潛力。本研究僅為春季土壤，整個生長季中微生物和植被變化也值得進一步探索，微生物的生態(tài)功能、物質(zhì)循環(huán)和能量代謝也值得深入挖掘，為下一步篩選優(yōu)勢抗逆性促生菌種提供更全面的數(shù)據(jù)支持。