葛毅 劉爽 何超 李忻昊 徐清源 張雪

作者單位：佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154000

OSCC 是臨床上常見的腫瘤，除酒精和煙草的使用外，近年來HPV感染也被確定為危險(xiǎn)因素之一，口交性行為和接吻可能是導(dǎo)致口腔HPV感染的原因[1]。在我國不同地區(qū)HPV 陽性O(shè)SCC 占OSCC總數(shù)的比例也不盡相同，數(shù)據(jù)顯示，華南、華東和東北地區(qū)分別為20.8%（43/207）、11.7%（22/188）和5.51%（81/1470）[2～4]。對(duì)于HPV 陽性O(shè)SCC 的治療，早期HPV 陽性O(shè)SCC 患者進(jìn)行單一的手術(shù)或放療，局部晚期患者需要二者同時(shí)進(jìn)行，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者使用多西他賽聯(lián)合順鉑氟尿嘧啶誘導(dǎo)化療是標(biāo)準(zhǔn)治療方式[5]。目前正在進(jìn)行有關(guān)西妥昔單抗的臨床試驗(yàn)，評(píng)估并強(qiáng)化治療策略，以降低基于順鉑放化療相關(guān)的嚴(yán)重副作用[6]。因此對(duì)于中晚期HPV 陽性O(shè)SCC 患者治療效果不理想，迫切需要探究HPV感染導(dǎo)致OSCC 的發(fā)展機(jī)制。高危HPV 病毒過度表達(dá)E6、E7 癌蛋白與癌癥相關(guān)信號(hào)通路的激活有關(guān)，如E6/E7 導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)答抗凋亡的特性與p53蛋白（Tumor protein 53，p53）和視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因（Retinoblastoma,RB）的降解有關(guān)，也與雷帕霉素靶標(biāo)（Mechanistic target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路有關(guān)[7]。E6 可滅活PDZ 蛋白（Post synaptic density protein-drosophila disk large tumor suppressor-zonula occludens-1 proteins，PDZ），同時(shí)激活磷酸肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Protein kinase B，Akt）、Wnt 和Notch 通路；E7 能激活PI3K/Akt 通路[8]。以上癌癥相關(guān)信號(hào)通路的激活，導(dǎo)致正常細(xì)胞發(fā)生癌變，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

對(duì)于OSCC 而言，HPV 可通過影響多個(gè)基因促進(jìn)腫瘤發(fā)生。與HPV 陰性O(shè)SCC 相比，HPV 陽性O(shè)SCC 中c-MYC 基因表達(dá)量升高，錯(cuò)配修復(fù)蛋白（MutL homologue-1，MLH1）表達(dá)量降低[9]，二者可能參與了腫瘤信號(hào)通路。與HPV 陰性O(shè)SCC 細(xì)胞相比，HPV 陽性O(shè)SCC 細(xì)胞的過氧化物氧化蛋白2（Peroxiredoxin typical 2-Cys，PRDX2）表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)HPV 陽性O(shè)SCC 細(xì)胞的生長[10]。本研究從HPV 陽性O(shè)SCC 與HPV 陰性O(shè)SCC 的差異基因著手，篩選出HPV 介導(dǎo)OSCC 的關(guān)鍵基因，為探究HPV 介導(dǎo)OSCC 發(fā)展的分子機(jī)制及臨床治療方法提供新思路。

1 材料與方法

1.1 獲取數(shù)據(jù)集并進(jìn)行差異分析通過NCBI 的GEO 數(shù)據(jù)庫[Home-GEO DataSets-NCBI（nih.gov）]得到本次分析需要的HPV 陽性O(shè)SCC 侵襲性上皮組織mRNA 芯片（GSE56142）的原始數(shù)據(jù)，芯片樣本來源于2 個(gè)HPV 陰性原發(fā)性侵襲性O(shè)SCC 上皮組織樣本、2 個(gè)HPV 陰性正常上皮組織樣本、10 個(gè)HPV 陽性原發(fā)性侵襲性O(shè)SCC 上皮組織樣本和10個(gè)HPV 陽性正常上皮組織樣本。在芯片樣本中，選取2 個(gè)HPV 陰性原發(fā)性侵襲性O(shè)SCC 上皮組織樣本作為對(duì)照組，10 個(gè)HPV 陽性原發(fā)性侵襲性O(shè)SCC上皮組織樣本作為實(shí)驗(yàn)組。數(shù)據(jù)集GSE56142 由英國劍橋大學(xué)提供，數(shù)據(jù)集的差異分析使用GEO2R在線分析工具[GEO2R-GEO-NCBI（nih.gov）]。以P＜0.05 且|logFC|＞1.5 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。將此數(shù)據(jù)進(jìn)行下載后，利用R 語言進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換并繪制熱圖和火山圖。

1.2 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)與信號(hào)通路的構(gòu)建使用STRING[STRING:functional protein association networks（string-db.org）]數(shù)據(jù)庫對(duì)蛋白質(zhì)之間互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，使用Cytoscape（版本3.8.2）軟件繪制基因互作網(wǎng)絡(luò)。

1.3 基因的功能富集分析使用R 語言（版本4.0.1）進(jìn)行GO(Gene ontology)和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析，利用Graph Pad Prism 8 軟件繪制柱形圖。

1.4 基因在染色體的定位使用NCBI 的基因組數(shù)據(jù)瀏覽器（Genome data viewer，GDV）進(jìn)行基因在染色體上位置關(guān)系的查找，并利用Mapchart 軟件(版本2.32)繪制差異基因的位置。

1.5 生存曲線的繪制使用基于基因表達(dá)水平值的交互式分析平臺(tái)（Gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）分析關(guān)鍵基因在高表達(dá)與低表達(dá)時(shí)對(duì)癌癥患者生存時(shí)間的影響，并繪制生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 HPV 陽性O(shè)SCC 與HPV 陰性O(shè)SCC 差異基因的篩選使用GEO2R 在線分析工具對(duì)GSE56142數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異基因分析，得到80 個(gè)差異顯著的基因，利用R 語言繪制熱圖（見圖1），將全部的差異基因繪制火山圖（見圖2）。熱圖中GSM1356635 和GSM1356629 為HPV 陰性O(shè)SCC 對(duì)照組，其他變量為HPV 陽性O(shè)SCC 實(shí)驗(yàn)組，熱圖表明HPV 陽性和HPV 陰性O(shè)SCC 的基因表達(dá)量存在差異?；鹕綀D表明，與HPV 陰性O(shè)SCC 相比，HPV 陽性O(shè)SCC 下調(diào)的基因有69 個(gè)，上調(diào)的基因有11 個(gè)。

圖1 HPV 陽性與陰性O(shè)SCC 差異基因的熱圖

圖2 HPV 陽性與陰性O(shè)SCC 差異基因的火山圖

2.2 關(guān)鍵基因互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建使用STRING 數(shù)據(jù)庫對(duì)80 個(gè)差異顯著的基因構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，并將此數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件。其中，有50 個(gè)基因可形成大范圍基因相互作用的關(guān)系（見圖3），可能是HPV 影響OSCC 發(fā)生的關(guān)鍵基因。

圖3 HPV 介導(dǎo)OSCC 形成的基因互作網(wǎng)絡(luò)中的50 個(gè)基因

2.3 50 個(gè)關(guān)鍵基因的功能富集分析使用R 語言對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，利用Graph Pad Prism 8 軟件進(jìn)行整理繪制柱形圖。GO 富集結(jié)果顯示：關(guān)鍵基因聚集在生物學(xué)過程中的中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、中性粒細(xì)胞激活、對(duì)傷害反應(yīng)的調(diào)節(jié)等；細(xì)胞組分中的肌節(jié)、肌原纖維和收縮纖維等；分子功能中的肌動(dòng)蛋白結(jié)合、肽鏈內(nèi)切酶活性和生長因子受體結(jié)合等信號(hào)通路（見圖4）。KEGG 富集到的信號(hào)通路為蛋白聚糖參與癌癥進(jìn)展、唾液的分泌和流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化等（見圖5）。其中，蛋白聚糖參與癌癥進(jìn)展和唾液分泌的信號(hào)通路所參與的基因數(shù)量最多。蛋白聚糖參與癌癥的信號(hào)通路富集金屬蛋白酶組織抑制劑3（Tissue inhibitor of metalloproteinase 3，TIMP3）、HBEGF、凝血酶敏感蛋白-1（Thrombospondin-1，THBS1）、CAV1、FLNC。唾液分泌的信號(hào)通路富集CALML5、視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因1（Retinoblastoma 1，PRB1)、視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因2（Retinoblastoma 2，PRB2)、富酪蛋白（Statherin，STATH）和惡性腦腫瘤1（Deleted in malignant brain tumours 1，DMBT1）。

圖4 50 個(gè)關(guān)鍵基因GO 富集分析圖

圖5 50 個(gè)關(guān)鍵基因KEGG 信號(hào)通路富集圖

2.4 HPV 介導(dǎo)的OSCC 中50 個(gè)關(guān)鍵基因的染色體定位通過GDV 查詢，關(guān)鍵基因大多聚集在7 號(hào)染色體上，而13、17、18 號(hào)和XY 染色體上沒有關(guān)鍵基因的分布（見圖6、7）。在7 號(hào)染色體上聚集到的關(guān)鍵基因分別為AGR2（Anterior gradient 2）、周期蛋白依賴性激酶（Cyclin-dependent kinase 6，CDK6）、SAMD 家族蛋白9（Sterile α motif domain containing 9，SAMD9）、電壓門控鈣離子通道（Voltage-gated Ca2+channels，CAV1）、細(xì)絲蛋白C（Filamin C，F(xiàn)LNC）和催乳素誘導(dǎo)蛋白（Prolactin-inducible protein，PIP），這些基因與癌癥的發(fā)生有關(guān)。

圖6 不同染色體上含50 個(gè)關(guān)鍵基因的數(shù)量

圖7 50 個(gè)關(guān)鍵基因的染色體定位

2.5 50 個(gè)關(guān)鍵基因的不同表達(dá)量對(duì)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌總生存的影響使用GEPIA 在線工具對(duì)關(guān)鍵基因繪制生存曲線，搜索并匯總有關(guān)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（Head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）的數(shù)據(jù)。其中，以log rankP＜0.05 進(jìn)行篩選并進(jìn)行排序，log rankP＜0.05 表明該基因在高表達(dá)或低表達(dá)時(shí)與患者的生存率有關(guān)，共篩選出14個(gè)基因（見表1）。將前兩個(gè)基因繪制生存曲線（見圖8）。圖中表明高表達(dá)鈣調(diào)素蛋白5（Calmodulinlike protein 5，CALML5）患者生存時(shí)間優(yōu)于低表達(dá)CALML5 患者，低表達(dá)肝素結(jié)合表皮生長因子（Heparin-binding EGF-like growth factor，HBEGF）患者生存時(shí)間優(yōu)于高表達(dá)HBEGF 患者。

表1 關(guān)鍵基因在不同表達(dá)量下對(duì)患者生存的影響

2.6 上調(diào)和下調(diào)的前3 個(gè)基因與影響生存時(shí)間的基因交集為找出50 個(gè)互作網(wǎng)絡(luò)中可能對(duì)HPV 陽性O(shè)SCC 的發(fā)展具有較大作用的基因，從50 個(gè)互作網(wǎng)絡(luò)基因中找出上調(diào)的前3 個(gè)基因與下調(diào)的前3 個(gè)基因（見表2），分別將上調(diào)和下調(diào)的前3 個(gè)基因與影響患者生存時(shí)間的14 個(gè)基因取得交集，得到CALML5和脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（Lipocalin-1，LCN1）兩個(gè)基因。

表2 關(guān)鍵基因中上調(diào)和下調(diào)的前3 個(gè)基因

HPV 在影響OSCC 惡性進(jìn)展過程中，相比于其他基因，CALML5 和LCN1 兩個(gè)基因的影響較大。利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫找到CALML5（見圖8A）和LCN1 不同表達(dá)量下HNSCC 患者生存曲線（見圖9）。生存曲線顯示LCN1 在高表達(dá)時(shí)患者生存時(shí)間優(yōu)于低表達(dá)時(shí)，表明LCN1 可能抑制HPV 陽性O(shè)SCC 的惡性進(jìn)展。最后，利用Cytoscape 軟件找出與CALML5、LCN1 相互作用的相關(guān)基因（見圖10）。

圖8 關(guān)鍵基因不同表達(dá)量下HNSCC 患者總生存曲線

圖9 LCN1 的生存曲線

圖10 與CALML5、LCN1 相互作用的基因

3 討論

口腔癌是世界上第11 位最常見的惡性腫瘤[17]，HPV感染是OSCC 比例上升的原因之一：在上世紀(jì)80年代的美國，只有16%的OSCC 為HPV 陽性，而在本世紀(jì)初，大約73%的OSCC 為HPV 陽性[18]。HPV 促進(jìn)癌癥的發(fā)生主要是通過E6、E7 對(duì)病毒基因組的保護(hù)并促進(jìn)宿主細(xì)胞進(jìn)入S 期[19]。目前，HPV 陽性O(shè)SCC 患者主要通過p16 高表達(dá)確診[20]，本研究通過GEO2R 在線分析工具得到了HPV 陽性O(shè)SCC 與HPV 陰性O(shè)SCC 的差異基因，利用STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建關(guān)鍵基因互作網(wǎng)絡(luò)，分析了關(guān)鍵基因的染色體定位，利用GEPIA 在線分析工具繪制了關(guān)鍵基因分別在高、低表達(dá)量下對(duì)HPV 陽性O(shè)SCC 患者生存時(shí)間的影響。

KEGG 分析結(jié)果顯示：蛋白聚糖參與癌癥進(jìn)展和唾液分泌的信號(hào)通路所參與的基因數(shù)量最多。在蛋白聚糖參與癌癥的信號(hào)通路中，TIMP3 與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，抑制OSCC 細(xì)胞生長、血管生成、遷移和侵襲。TIMP3 通過增加上皮標(biāo)記物的表達(dá)和減少間充質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)來調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，對(duì)OSCC 的發(fā)生具有抑制作用[21]。在晚期HNSCC患者中，若HBEGF 和環(huán)氧化酶2（Cyclooxygenase-2，COX-2）的表達(dá)量增高，則復(fù)發(fā)率較高，并參與順鉑耐藥。順鉑耐藥的抗性是通過增加HBEGF 和COX-2 的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）或檳榔提取物激活A(yù)KT 信號(hào)通路，由AKT 信號(hào)通路上調(diào)COX-2 的表達(dá)，再由COX-2 上調(diào)HBEGF 的表達(dá)，且呈現(xiàn)前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）的依賴性。在HNSCC 患者的組織樣本中，COX-2 與HBEGF 的表達(dá)呈顯著正相關(guān)[22]。來自O(shè)SCC 外泌體中的THBS1 參與了M1 巨噬細(xì)胞的極化，促進(jìn)OSCC 的惡性進(jìn)展[23]。CAV1 和FLNC 基因在7 號(hào)染色體上同樣參與癌癥的進(jìn)展。

在唾液分泌的信號(hào)通路中，5 個(gè)基因都參與了腫瘤的進(jìn)展。研究表明，CALML5 在HPV 陽性口咽癌中出現(xiàn)了甲基化，表明CALML5 可能是篩查HPV陽性口咽癌的替代方法[24]。HPV16 E7 癌蛋白在體內(nèi)外通過PRB 泛素化而降解，導(dǎo)致PRB 結(jié)合到E2F（Early 2 factor）轉(zhuǎn)錄因子的量減少，又由于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6（Cyclin-dependent kinases 4/6，CDK4/6）使PRB 與E2F 解離，E2F 轉(zhuǎn)錄因子釋放量增多，使E2F 轉(zhuǎn)錄出的Cyclin E、Cyclin A 增多，迫使細(xì)胞提前進(jìn)入S 期，從而導(dǎo)致細(xì)胞癌變[25，26]。PRB1抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，激活干擾素應(yīng)答基因，增強(qiáng)對(duì)免疫治療的敏感性，HPV E7 癌蛋白破壞PRB1 從而逃避免疫監(jiān)視[27]。在人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞中PRB2和p130 主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，而纖溶酶原激活物抑制劑-2（Plasminogen activator inhibitor type-2，PAI-2）則主要聚集在細(xì)胞核中。慢性孕酮的暴露可誘導(dǎo)PRB2/p130 在核亞細(xì)胞定位重排，PRB2/p130 與PAI-2 位于細(xì)胞核共同的免疫定位，導(dǎo)致細(xì)胞在G2/M 期聚集，顯著減少壞死，有利于凋亡的激活[28]。在口腔癌癌變前期以及口腔癌患者的唾液中，STATH 蛋白的表達(dá)水平降低[29]。DMBT1 基因被認(rèn)為是腦癌、食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌和肺癌的潛在抑癌基因，也是OSCC 的抑癌基因，DMBT1 在大約半數(shù)的OSCC 組織中表達(dá)下調(diào)或缺失[30]。

關(guān)鍵基因大多聚集在 7 號(hào)染色體，其中AGR2在起源于舌根的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)[25]。過表達(dá)CDK6與OSCC 的發(fā)生發(fā)展和非發(fā)育不良上皮細(xì)胞的癌變密切相關(guān)[26]。在人角質(zhì)形成細(xì)胞中，SAMD9 與低危HPV E6 相互作用，可能抑制低危HPV 病毒的復(fù)制[27]。在原發(fā)性O(shè)SCC 組織中，相比于低表達(dá)CAV1 患者，高表達(dá)CAV1 患者的預(yù)后較差。CAV1可激活OSCC 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，尤其是在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況下表達(dá)，預(yù)示OSCC 的預(yù)后較差[28]。多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glimoblastoma，GBM）中FLNC的表達(dá)量增加，與細(xì)胞侵襲性呈正相關(guān)，與遷移無關(guān)，并與患者預(yù)后不良相關(guān)[29]。PIP 通過AKT/絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路抑制OSCC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[30]。

分析關(guān)鍵基因的不同表達(dá)量對(duì)HNSCC 患者生存時(shí)間的影響，共獲得CALML5、HBEGF 和MYL2等14 個(gè)對(duì)患者生存時(shí)間影響較大的基因?？傮w而言，可查詢到多數(shù)基因?qū)τ诎┌Y的發(fā)生有顯著影響。在這14 個(gè)基因中，部分基因可以促進(jìn)多種癌癥的發(fā)生，如HBEGF 表達(dá)量升高增加胃癌細(xì)胞侵襲和遷移性[31]，且HBEGF 在卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)量顯著升高，HBEGF 也可激活EGFR 和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases，ERK）的信號(hào)通路。目前臨床上已經(jīng)采用針對(duì)HBEGF 治療癌癥的方法：白喉毒素突變體蛋白（Cross-reacting material 197，CRM197）與HBEGF 結(jié)合，抑制HBEGF 與EGF 的結(jié)合，阻斷有絲分裂活性，紫杉醇促進(jìn)HBEGF 外域脫落，因此臨床上聯(lián)合CRM197 和紫杉醇進(jìn)行治療[32]。有的基因影響免疫系統(tǒng)活性：NT5E 由CD73（Cluster of differentiation 73）編碼，在健康器官和組織中執(zhí)行許多穩(wěn)態(tài)功能，作為抑制性免疫檢查點(diǎn)分子，NT5E 產(chǎn)生的游離腺苷抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[33，34]。當(dāng)然，有一些基因還未在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，如通過生物信息學(xué)表明LCN1 可能是一個(gè)潛在的預(yù)測乳腺癌的生物標(biāo)志物，但未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[35]。在未來的研究中，可以嘗試分析這些基因在癌癥發(fā)展中的機(jī)制。

本研究使用GEO 數(shù)據(jù)庫中的HPV 陽性與陰性O(shè)SCC 芯片，篩選出HPV 介導(dǎo)OSCC 的關(guān)鍵基因，并對(duì)其進(jìn)行功能富集分析和生存曲線的繪制，得到了CALML5、HBEGF 和MYL2 等潛在的治療靶點(diǎn)。但本研究并未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，因此，需要我們將來對(duì)癌癥產(chǎn)生的分子機(jī)制、潛在的治療靶點(diǎn)通過體內(nèi)/體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，通過更進(jìn)一步的研究，闡明HPV介導(dǎo)OSCC 的發(fā)展機(jī)制，為臨床治療提供新思路。