陳貴發(fā) 張翠宏

作者單位：惠州市第三人民醫(yī)院老年病科和全科醫(yī)學(xué)科，廣東 惠州 516001

腦梗死是一種臨床常見的致殘性腦血管疾病，患者通常起病較急、嚴(yán)重程度高、治療難度大[1，2]。有研究顯示，高齡、高血壓、高血脂、肥胖等均為腦梗死的危險(xiǎn)因素，顱內(nèi)外動(dòng)脈粥樣硬化為腦梗死主要危險(xiǎn)因素[3，4]。作為腦梗死的主要病理基礎(chǔ)，動(dòng)脈粥樣硬化的標(biāo)志及進(jìn)展表現(xiàn)分別為斑塊形成、血管狹窄[5]。動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死（ACI）患者多表現(xiàn)為偏癱、語言障礙等，嚴(yán)重威脅患者身體健康甚至生命安全，因此對(duì)ACI 發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究，探尋新的診療靶點(diǎn)對(duì)ACI 早期診斷、臨床治療及預(yù)后改善具有重要意義[6，7]。本研究檢測(cè)老年ACI 患者載脂蛋白E（APOE）、抵抗素（Resistin）、微小RNA-24（miR-24）表達(dá)水平，旨在探討三者在老年ACI 患者中的表達(dá)及與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2020年8月～2021年8月于我院進(jìn)行治療的老年ACI 患者80 例為ACI 組，選取同期于我院進(jìn)行診治的無癥狀性頸動(dòng)脈狹窄（ACS）患者80 例為ACS 組，另選取同期于我院進(jìn)行健康體檢的志愿者80 例為對(duì)照組，3 組年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史、高血壓、冠心病史比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組比較，ACS 組、ACI組TC、TG 水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ACI 組患者TC、TG 水平高于ACS 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 研究對(duì)象一般資料比較

納入標(biāo)準(zhǔn)：ACI 組患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)對(duì)ACI 的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，并經(jīng)我院影像學(xué)檢查確診；ACS組患者經(jīng)我院頸動(dòng)脈影像學(xué)檢查確診為ACS；對(duì)照組研究對(duì)象無腦血管病史；所有研究對(duì)象病歷資料齊全，年齡＞60 歲。本研究所有患者均知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①病歷資料不全者；②具有腦血管手術(shù)史者；③外傷導(dǎo)致的腦梗死者；④免疫性疾病者；⑤接受過相關(guān)治療者；⑥頭頸部惡性腫瘤者。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 于就診當(dāng)日取3 組研究對(duì)象清晨空腹靜脈血5ml，離心處理15min（3 000r/min）后，-30℃保存待檢。

1.2.2 免疫透射比濁法檢測(cè)APOE 水平 制備3 個(gè)潔凈試管并依次標(biāo)記為對(duì)照A 管、對(duì)照B 管、檢測(cè)管，3 管中均加入350μl 緩沖液，并于對(duì)照A 管中加入蒸餾水20μl，對(duì)照B 管中加入標(biāo)準(zhǔn)液20μl，檢測(cè)管中加入稀釋后的血清20μl，3 管搖晃均勻后使用37℃保溫箱孵育15min，比色后340、700nm 波長(zhǎng)處測(cè)定免疫復(fù)合物濁度，根據(jù)吸光度計(jì)算APOE水平。

1.2.3 酶標(biāo)分析儀檢測(cè)Resistin 水平 酶標(biāo)板中添加1∶10 稀釋的血清標(biāo)本或100μl 標(biāo)準(zhǔn)液，之后將酶標(biāo)板置于37℃保溫箱中孵育，30min 后取出洗板，各孔添加50μl 蒸餾水及一抗并搖晃均勻，再次使用37℃保溫箱孵育0.5h 后洗板，然后添加100μl酶標(biāo)抗體后靜置10min，洗板后添加100μl 底物液，并置于避光環(huán)境中靜置20min，添加100μl 終止液混勻，測(cè)定待測(cè)酶標(biāo)板450nm 處吸光值，檢測(cè)Resistin 水平。

1.2.4 RT-PCR 法檢測(cè)miR-24 表達(dá) Trizol 法提取總RNA 后檢測(cè)RNA 純度及濃度，逆轉(zhuǎn)錄處理（42℃環(huán)境下孵育0.5h，80℃ 5s，置于冰上冷卻）后進(jìn)行擴(kuò)增處理，2-△△Ct方法計(jì)算miR-24 表達(dá)，內(nèi)參U6。miR-24 引物序列為上游引物：5'-ATGAACTTTCTG CTGTCTTGG-3'，下游引物：5'-TCACCGCCTCGGCT TGTCACA-3'。

1.2.5 斑塊、血管狹窄程度評(píng)價(jià) 對(duì)患者進(jìn)行頸動(dòng)脈彩超檢查，評(píng)價(jià)患者有無斑塊及斑塊性質(zhì)。血管狹窄程度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：重度狹窄：70%≤血管狹窄率＜100%；中度狹窄：50%≤血管狹窄率＜70%；輕度狹窄：血管狹窄率＜50%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 26.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s描述，多組對(duì)比行F檢驗(yàn)，組間對(duì)比行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)性研究采用Pearson 相關(guān)性分析。預(yù)測(cè)價(jià)值分析采用受試者工作特征（ROC）曲線，獲取曲線下面積、置信區(qū)間、靈敏度、特異度。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組APOE、Resistin、miR-24 水平對(duì)比與對(duì)照組比較，ACS 組、ACI 組APOE、Resistin、miR-24表達(dá)水平較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ACI組患者APOE、Resistin、miR-24 表達(dá)水平高于ACS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 3 組APOE、Resistin、miR-24 表達(dá)水平對(duì)比（±s）

表2 3 組APOE、Resistin、miR-24 表達(dá)水平對(duì)比（±s）

組別例數(shù)APOE（mg/dl） Resistin（μg/ml） miR-24對(duì)照組803.65±0.5715.69±2.371.15±0.13 ACS 組804.57±0.6623.77±2.681.37±0.17 ACI 組806.32±0.8133.19±3.121.92±0.25 F 28.37544.25628.369 P 0.0010.0010.001

2.3 APOE、Resistin、miR-24 表達(dá)水平與ACI 患者臨床特征關(guān)系研究與無斑塊患者比較，有斑塊患者APOE、Resistin、miR-24 表達(dá)水平較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與穩(wěn)定性斑塊、輕中度血管狹窄、預(yù)后良好患者比較，不穩(wěn)定性斑塊、重度血管狹窄、預(yù)后不良患者APOE、Resistin、miR-24 表達(dá)水平較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 APOE、Resistin、miR-24 表達(dá)水平與ACI 患者臨床特征關(guān)系（±s）

表3 APOE、Resistin、miR-24 表達(dá)水平與ACI 患者臨床特征關(guān)系（±s）

臨床特征例數(shù)APOE（mg/dl）Resistin（μg/ml）miR-24斑塊無295.59±0.72 28.63±2.921.74±0.21有517.12±0.93 37.52±3.352.15±0.33 t 7.64511.9406.024 P 0.0010.0010.001斑塊穩(wěn)定性穩(wěn)定236.79±0.87 35.27±3.121.96±0.28不穩(wěn)定287.53±0.98 39.66±3.572.34±0.37 t 2.8214.6224.060 P 0.0070.0010.001血管狹窄程度輕、中度565.53±0.69 28.03±2.851.69±0.19重度247.08±0.91 38.59±3.422.28±0.35 t 8.34314.2909.745 P 0.0010.0010.001預(yù)后情況良好495.28±0.71 27.83±2.791.53±0.17不良317.45±0.95 39.02±3.512.30±0.35 t 11.66015.800123.170 P 0.0010.0010.001

2.4 ACI 患者APOE、Resistin、miR-24 表達(dá)水平相關(guān)性分析ACI 患者APOE 和Resistin、APOE 和miR-24、Resistin 和miR-24 均呈正相關(guān)（r=0.465、0.641、0.467，P=0.001、0.001、0.001）。見圖1。

圖1 ACI 患者APOE、Resistin、miR-24 表達(dá)水平相關(guān)性

2.5 APOE、Resistin、miR-24 對(duì)ACI 患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值分析與APOE、Resistin、miR-24 單項(xiàng)檢測(cè)相比，聯(lián)合檢測(cè)對(duì)ACI患者預(yù)后預(yù)測(cè)的靈敏度較高，特異性較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4、圖2。

圖2 APOE、Resistin、miR-24 對(duì)ACI 患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值ROC 曲線圖

表4 APOE、Resistin、miR-24 對(duì)ACI 患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

ACI 是一種由動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成、腦組織血管閉塞等導(dǎo)致的腦組織供血不足、局部缺血性壞死性疾病[9，10]。老年人群為ACI 的主要發(fā)病群體，近年來隨著我國(guó)人口老齡化不斷發(fā)展，每年新增ACI病例數(shù)不斷上升，引起廣大專家學(xué)者的關(guān)注[11，12]。ACI 患者主要表現(xiàn)為感覺障礙、眩暈、失語、四肢麻木等，目前臨床尚無特效的治療手段，患者病情易反復(fù)，預(yù)后較差，因此越來越多的專家學(xué)者開始通過分子生物學(xué)等方向?qū)CI 發(fā)病機(jī)制、診療靶點(diǎn)進(jìn)行研究[13，14]。

血脂水平異常為ACI 的主要危險(xiǎn)因素，有研究表示，低密度脂蛋白（LDL）水平異常上升為動(dòng)脈粥樣硬化的重要因素，APOE 為L(zhǎng)DL 受體的配體，其水平變化與血脂水平變化具有一定相關(guān)性[15，16]。APOE 大多由機(jī)體腦組織、肝組織合成產(chǎn)生，廣泛存在LDL 中，與腦梗死的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系。有研究顯示，APOE 的基因多態(tài)性與腦梗死后神經(jīng)功能具有密切聯(lián)系，抑制APOE 水平對(duì)腦梗死患者神經(jīng)功能的恢復(fù)具有促進(jìn)作用[17]。本研究顯示，老年ACI 患者APOE 水平較高，并且不穩(wěn)定性斑塊、重度血管狹窄、預(yù)后較差患者APOE 水平相對(duì)較高，說明老年ACI 患者APOE 水平異常升高，且APOE 水平變化與患者斑塊性質(zhì)、血管狹窄程度及患者預(yù)后情況有關(guān)，由此本研究推測(cè)檢測(cè)APOE 水平對(duì)老年ACI 患者的病情診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)具有重要意義。

Resistin 是一種多肽激素，主要由機(jī)體脂肪組織分泌產(chǎn)生，能夠誘發(fā)胰島素抵抗，有研究顯示，Resistin 水平變化與動(dòng)脈粥樣硬化具有密切聯(lián)系，在腦梗死發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[18]。有學(xué)者在研究中表示，Resistin 水平變化與腦梗死患者頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性具有密切聯(lián)系，檢測(cè)Resistin 水平有助于預(yù)測(cè)腦梗死患者預(yù)后[19]。本研究顯示，相比ACS 患者，老年ACI 患者Resistin 水平較高，且不穩(wěn)定性斑塊、重度血管狹窄、預(yù)后較差患者Resistin 水平相對(duì)較高，說明Resistin 在ACI中呈異常高表達(dá)，并且Resistin 表達(dá)水平與ACI 患者斑塊性質(zhì)、血管狹窄程度有關(guān)，檢測(cè)Resistin 水平對(duì)ACI 患者病情診斷、預(yù)后評(píng)價(jià)具有重要意義。

微小RNA（miRNA）作為內(nèi)源性RNA 分子，與機(jī)體免疫系統(tǒng)、細(xì)胞生物學(xué)行為、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[20，21]。miR-24 為miRNA 家族的重要成員，其表達(dá)變化與血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)行為具有密切聯(lián)系，有研究表示，miR-24 可作為血管疾病診斷、治療的重要靶點(diǎn)[22]。本研究顯示，老年ACI 患者miR-24 表達(dá)較高，并且不穩(wěn)定性斑塊、重度血管狹窄、預(yù)后較差患者miR-24 表達(dá)相對(duì)較高，說明miR-24 在ACI 患者中呈異常高表達(dá)，其表達(dá)變化與ACI 患者斑塊性質(zhì)、血管狹窄程度及患者預(yù)后情況具有一定關(guān)系。

本研究還發(fā)現(xiàn)，APOE 與Resistin、miR-24，Resistin與miR-24在老年ACI 患者中的表達(dá)呈正相關(guān)，三者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)老年ACI 患者預(yù)后預(yù)測(cè)的靈敏度較高，特異性較低，由此本研究推測(cè)APOE、Resistin、miR-24 可能共同參與ACI 的發(fā)生發(fā)展，聯(lián)合檢測(cè)對(duì)ACI 患者預(yù)后具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，老年ACI 患者APOE、Resistin、miR-24 表達(dá)水平明顯異常，三者表達(dá)水平與患者臨床特征密切相關(guān)，且三者具有一定相關(guān)性，聯(lián)合檢測(cè)APOE、Resistin、miR-24 對(duì)老年ACI 患者預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。