◎ 李 澤，余銀芳，馬紹龍，閆景輝，鐘地長，胡俊杰

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江西 南昌 330004；2.江中藥業(yè)股份有限公司中藥矯味（掩味）和感官評價關(guān)鍵技術(shù)重點實驗室，江西 南昌 330004）

近年來，全世界對以健康的人體腸道微生物區(qū)系為目標(biāo)的益生菌和合生元產(chǎn)品的開發(fā)產(chǎn)生了極大的興趣[1-2]。益生菌（Probiotics）是一類對宿主有益的活性微生物，是定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡，發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱[3]。攝取益生菌被認為是平衡人體腸道微生物區(qū)系的有效策略，可以改善腸道健康，降低各種疾病的風(fēng)險，如代謝綜合征、皮膚炎癥等[4-5]。而保證“一定數(shù)量”和“活的狀態(tài)”的益生菌是益生菌制劑發(fā)揮功效的前提。為了提高益生菌的存活率，人們探索了各種措施，如篩選高耐受性菌株、包埋、添加多糖和寡糖等[6-8]。

咀嚼片由于攜帶、食用等方便，具有較好的市場前景，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[9]。本試驗以發(fā)酵乳桿菌菌粉為主要原料，添加適量輔料，通過單因素試驗和正交試驗，優(yōu)選益生菌咀嚼片主要輔料，并采用成對偏愛檢驗法，與市售同類型產(chǎn)品口感對比測評。本試驗旨在通過益生菌咀嚼片研制，為益生菌類制劑研究提供一定的理論和實踐經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）（中國科學(xué)院微生物研究所）；麥芽糖醇（浙江華康藥業(yè)股份有限公司）；山梨糖醇（浙江華康藥業(yè)股份有限公司）；赤蘚糖醇（保齡寶生物股份有限公司）；低聚果糖（量子高科生物股份有限公司）；低聚木糖（易常青生物科技有限公司）；低聚半乳糖（量子高科生物股份有限公司）；檸檬酸（山東英軒實業(yè)）；蘋果酸（萬利來香化有限公司）；酒石酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；脫脂乳粉（呼倫貝爾塞尚雀巢有限公司）；MRS培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；氯化鈉（湖北西隴化工有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA822-CW型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；AquaLab TDL水分活度儀（美國DECAGON公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海-恒科學(xué)儀器有限公司）；BBS-V800型超凈工作臺（濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）；UV-1800紫外分光光度計（SHIMADZU CORPORATION）；單沖壓片機（國藥龍立科技有限公司）；MA160-1CN型水分測定儀（賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；ZQZY-85BN型振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）；智能硬度儀（天津市貝斯特科技公司）；LDZF-50L-III型立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；SAFE-1500LC型生物安全柜（力新儀器上海有限公司）；XW-80A型微型旋渦混合儀（上海滬西儀器廠有限公司）；Eppendorf移液槍（南京貝登醫(yī)療股份有限公司）；HN-08型拍打式無菌均質(zhì)器（上海漢諾儀器有限公司）；梅特勒FiveEasy Plus pH計（梅特勒托利多儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 制備工藝流程

益生菌咀嚼片制備工藝流程如圖1所示。

圖1 益生菌咀嚼片工藝流程圖

1.3.2 指標(biāo)測定方法

（1）水分含量測定。水分含量按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》（GB 5009.3—2016）第一法（直接干燥法）測定。

（2）益生菌活菌數(shù)測定[10]?；罹鷶?shù)按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》（GB 4789.35—2016）測定。益生菌活菌存活率=壓片后益生菌活菌數(shù)/壓片前益生菌活菌數(shù)×100%。

（3）水活度測定[11]。水活度采用AquaLab TDL水分活度儀測定，平行測定3份，取平均值。

（4）吸濕率測定[12]。參照《中國藥典》（2020年版）四部“9103藥物引濕性試驗指導(dǎo)原則”試驗，平行測定3份，取平均值。吸濕率=物料增加質(zhì)量/物料質(zhì)量×100%。

1.3.3 主要輔料篩選

益生菌咀嚼片主要由發(fā)酵乳桿菌菌粉、填充輔料（糖醇類、益生元、酸味劑等）、黏合劑和潤滑劑組成。

（1）糖醇類輔料種類及用量篩選。糖醇類輔料在配方中占比較高，經(jīng)預(yù)試和文獻查閱，糖醇類輔料不會抑制益生菌活菌數(shù)的生長，但糖醇類輔料水分、水活度及吸濕率對產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性和活菌存活率影響較大。經(jīng)預(yù)試，選擇麥芽糖醇、赤蘚糖醇、山梨糖醇、木糖醇和異麥芽酮糖醇5種糖醇類輔料進行單因素篩選試驗。取5種輔料適量，測定其干燥前、干燥后水分、水活度，同時按1.3.2吸濕率測定方法測定吸濕率，平行測定3次。

（2）益生元種類及用量篩選。相對于益生菌，益生元則是近年來出現(xiàn)的食品概念[13]。益生元可以定義為不可消化的食物成分，可以選擇性地刺激結(jié)腸中一種或多種細菌的生長和（或）活性，從而對宿主產(chǎn)生有益的影響。低聚糖與益生菌復(fù)合使用，能夠更好地發(fā)揮效果。有文獻報道，益生菌生長過程中，其光密度值的變化在一定程度上可作為益生菌的生長狀況的代表量，而益生菌生長過程中會產(chǎn)酸，pH值的變化也可一定程度上反映益生菌的生長狀況，pH值下降得越快，益生菌產(chǎn)酸越多，益生菌生長越好。選擇益生元低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚異麥芽糖和菊粉，按試驗方法進行試驗，測定其OD600值和pH值，篩選較優(yōu)益生元。配制含葡萄糖的MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，將MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖分別用等質(zhì)量濃度的益生元代替，將發(fā)酵乳桿菌菌粉按1%的接種量接入活化培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，測其OD600和pH值，每4 h檢測一次。

（3）酸味劑用量篩選。經(jīng)預(yù)試，檸檬酸酸味溫和，未有不良后味，因此選擇檸檬酸為配方中的酸味劑。

在保證配方口感前提下，分別往配方中添加0%、0.5%、1.0%和1.5%，測其活菌數(shù)，考察配方中不同比例檸檬酸對益生菌咀嚼片活菌數(shù)的影響。1.3.4 正交試驗設(shè)計

（1）評分指標(biāo)測定方法。評分標(biāo)準(zhǔn)的選擇以益生菌的活菌存活率和片劑的成型性為指標(biāo)進行綜合評分，評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 正交試驗設(shè)計評分標(biāo)準(zhǔn)表

（2）正交試驗因素水平表的設(shè)計。對輔料麥芽糖醇、低聚半乳糖和檸檬酸，采用L9(34)正交試驗設(shè)計，以益生菌活菌存活率、成型性為考察指標(biāo)進行綜合評分，確定配方最佳比例。因素水平設(shè)計見表2。

表2 L9(34)正交試驗因素水平表

1.3.5 益生菌咀嚼片口感測評

益生菌咀嚼片口感測評采用口嘗法與市售火爆同類型產(chǎn)品B進行對比測評。

2 結(jié)果與分析

2.1 填充輔料篩選研究

2.1.1 糖醇類輔料篩選結(jié)果

如表3所示，試驗結(jié)果表明，干燥后糖醇水分大小對比結(jié)果為異麥芽酮糖醇＞木糖醇＞山梨糖醇＞赤蘚糖醇＞麥芽糖醇；干燥后糖醇水活度大小對比結(jié)果為木糖醇＞赤蘚糖醇＞山梨糖醇＞異麥芽糖醇＞麥芽糖醇；吸濕率對比結(jié)果為異麥芽酮糖醇＞木糖醇＞山梨糖醇＞麥芽糖醇＞木糖醇。綜合分析，選擇麥芽糖醇為糖醇類輔料填充劑，設(shè)計其配方占比梯度為55%、60%、65%。

表3 5種糖醇類輔料水分、水活度、吸濕率測定結(jié)果表（n=3）

2.1.2 益生元篩選結(jié)果

由圖2、表4結(jié)果可知，益生元充當(dāng)培養(yǎng)基碳源后，益生元對發(fā)酵乳桿菌菌粉的體外增值作用由大到小為低聚半乳糖＞低聚果糖＞低聚異麥芽糖＞菊粉＞低聚木糖。值得注意的是，低聚木糖充當(dāng)碳源的組別，益生菌幾乎未生長，可能是低聚木糖對發(fā)酵乳桿菌的增值效果較差。根據(jù)試驗結(jié)果，選擇低聚半乳糖為配方中益生元，設(shè)計其配方占比梯度為10%、15%、20%。

表4 益生元充當(dāng)碳源時的OD600變化表

圖2 益生元充當(dāng)碳源時的pH值變化圖

2.1.3 酸味劑用量篩選結(jié)果

由圖3可知，隨著檸檬酸比例的增加，活菌數(shù)不斷減少，由此可見檸檬酸的用量對益生菌活菌數(shù)的影響很大。根據(jù)試驗結(jié)果，選擇檸檬酸配方比例為0.5%、1.0%、1.5%。

圖3 不同比例檸檬酸對益生菌咀嚼片活菌數(shù)的影響圖

2.1.4 正交試驗結(jié)果分析

正交試驗結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。根據(jù)方差分析可知，檸檬酸添加量（B）對益生菌產(chǎn)品影響顯著，各個因素對片劑活菌數(shù)的影響順序如下：檸檬酸＞低聚果糖＞麥芽糖醇，結(jié)合直觀分析得出最優(yōu)配方為A3B1C3，即麥芽糖醇65%，檸檬酸0.5%，低聚半乳糖20%。

表5 正交試驗設(shè)計及試驗結(jié)果表

表6 方差分析表

2.2 口感對比評價

本試驗采用成對偏愛檢驗法，與市售火爆同類型產(chǎn)品B進行口感對比測評，即評價員比較2個樣品，品嘗后指出更喜歡哪個樣品。本次檢驗中，有自制樣品A（編號623）和市售火爆同類型產(chǎn)品B（編號846），共有30名評價員參與評價。本次成對偏愛檢驗采取必選檢驗單，不允許無偏愛。評價的結(jié)果是20名偏愛A，10名評價員偏愛B。根據(jù)評價結(jié)果，查閱《食品感官評價》一書中的偏愛檢驗附表可看出，在顯著性水平為5%時，樣品差異顯著的最小判斷數(shù)為21[14]。實際的數(shù)值為20＜21，因此評價小組對A樣品的偏愛沒有超過對樣品B的偏愛，即2個樣品的偏愛程度沒有顯著性差異。

3 結(jié)論

本文菌種選擇了發(fā)酵乳桿菌菌粉，通過活菌存活率、片子成型性及口感篩選出麥芽糖醇、低聚半乳糖、檸檬酸等作為益生菌咀嚼片的主要輔料，通過正交試驗得出益生菌咀嚼片主要輔料最佳配方為低聚半乳糖20%，麥芽糖醇65%，檸檬酸0.5%，優(yōu)化后的益生菌咀嚼片活菌存活率高、成型性好、口感好。輔料中添加了益生元低聚半乳糖，有選擇性地提高了益生菌使用時間，讓產(chǎn)品具有生物特效；其中檸檬酸的添加量直接影響了益生菌制劑的活菌數(shù)，之后的篩選過程可有選擇性地降低檸檬酸的添加量或者使用檸檬酸鈉等酸度調(diào)節(jié)劑來中和。

益生菌制劑也稱益生素、促生素、生菌素、益菌素及微生態(tài)制劑等[15]。現(xiàn)在益生素作為一類重要的“功能食品”生產(chǎn)行業(yè)，是食品工業(yè)發(fā)展最快的行業(yè)之一，在全球食品行業(yè)中占據(jù)著越來越重要的地位，因此研究和開發(fā)益生菌制劑對振興我國的食品工業(yè)具有重要的意義[16]。而輔料是制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)，是制劑生產(chǎn)的必備材料，因此輔料性質(zhì)的研究至關(guān)重要，本文研究了部分輔料對益生菌制劑活菌數(shù)的影響，為后期益生菌制劑的開發(fā)提供技術(shù)支持。