張鳳偉，桑珍珍，王淑娟，賈春梅，王 偉

（滄州市中心醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)部，滄州 061000）

膿毒癥是感染、燒傷、創(chuàng)傷、休克等急危重患者的嚴(yán)重并發(fā)癥，患者機(jī)體難以控制的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體多個(gè)器官出現(xiàn)急性功能損傷，發(fā)展為膿毒性休克和多器官功能衰竭[1]。膿毒癥患者病情發(fā)展十分迅速，盡管目前有良好的監(jiān)護(hù)措施及診療技術(shù)，但其發(fā)病率和病死率仍較高。肝臟血運(yùn)豐富，并且具有免疫、代謝、解毒等重要功能，是膿毒癥最常受累的器官之一，膿毒癥病理過程涉及炎癥、氧化應(yīng)激的過度激活，釋放大量炎癥因子，導(dǎo)致肝損傷[2]。肝損傷可出現(xiàn)在膿毒癥的各個(gè)時(shí)期，是多器官功能衰竭和死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，盡早發(fā)現(xiàn)和干預(yù)可以改善膿毒癥肝損傷患者的預(yù)后[3]。茶多酚（tea polyphenols，TP）是綠茶葉中酚類化合物及其衍生物的總稱，主要包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、咖啡堿、表兒茶素及兒茶素等，是綠茶的主要活性物質(zhì)。國內(nèi)外大量研究顯示，TP在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、抗腫瘤等方面發(fā)揮了重要作用[4-5]，亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其可參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展和調(diào)控的過程[6]。但TP 是否對(duì)膿毒癥肝損傷具有保護(hù)作用目前相關(guān)報(bào)道仍較少。因此，本研究通過探討TP 對(duì)膿毒癥大鼠肝損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，以期為膿毒癥臨床治療尋求新的方向，減少膿毒癥引起的肝功能衰竭，改善患者的預(yù)后，并且為明確TP改善肝損傷的藥理作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大鼠盲腸結(jié)扎穿刺法（cecum ligation and puncture，CLP）模型的建立及分組 40 只7 周齡健康雄性成年SD大鼠購自東方生物服務(wù)公司（南京）。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)滄州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指南》（IACUC-190525-12）。所有大鼠維持12 h的光/暗循環(huán)，并隨意喂食食物和水。實(shí)驗(yàn)前，讓大鼠適應(yīng)環(huán)境1周。將SD大鼠隨機(jī)分為4組：Sham組（術(shù)后每天300 mg/kg生理鹽水灌胃）、Sham+TP 組（CLP 術(shù)后每天300 mg/kg TP 灌胃）、CLP 組（CLP 術(shù)后每天300 mg/kg 生理鹽水灌胃）、CLP+TP 組（CLP 術(shù)后每天300 mg/kg TP 灌胃），每組10 只。采用CLP 建立膿毒癥模型[7]：異氟醚麻醉下，正中切口1.5 cm 暴露盲腸，隨后在距盲腸尖端1 cm處用5-0絲線結(jié)扎，用18號(hào)針頭穿刺盲腸，擠壓出少量糞便，然后用無菌4-0 絲線縫合切口。Sham組和Sham+TP組行剖腹手術(shù)，但不結(jié)扎、不穿孔。術(shù)后皮下注射1 mL 生理鹽水進(jìn)行液體復(fù)蘇。7 d后麻醉處死大鼠，并取出肝臟組織、全血。

1.2 大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)檢查 大鼠肝臟組織用4%多聚甲醛固定24 h后進(jìn)行切片，進(jìn)行蘇木精－伊紅（HE）染色（麥克林，上海）：對(duì)切片用無水乙醇－二甲苯溶液脫蠟，洗滌后浸入蘇木精溶液中染色5～8 min 取出洗滌，浸入伊紅溶液染色3 min 取出洗滌，依次放入無水乙醇—二甲苯中5 min，使用中性樹膠封片。400 倍光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本東京）下觀察并采集圖像，重復(fù)3次。

1.3 大鼠血清肝功能檢測 取全血3 000 r/min 離心15 min，收集上層血清待測。采用微量法活性檢測試劑盒（索萊寶，北京）檢測大鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspertate aminotransferase，AST）及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）等肝臟功能的指標(biāo)。根據(jù)試劑盒說明書操作，重復(fù)3次。

1.4 大鼠肝臟細(xì)胞凋亡測定 使用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）試劑盒（Roche，德國）評(píng)估大鼠肝臟細(xì)胞凋亡情況。剪取少量肝臟組織，加入胰蛋白酶-EDTA 消化液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中20 min，收集上清液過濾，800 r/min離心5 min，收集底層肝臟細(xì)胞，PBS 洗滌5 組肝臟細(xì)胞后，利用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min 后再次進(jìn)行洗滌，隨后用含0.1%Triton X-100 的PBS 重懸細(xì)胞，冰孵2 min 后再次洗滌2 次。加入50 μL TUNEL 檢測液，37 ℃避光孵育60 min，PBS 洗滌2 次，250 μL PBS懸浮細(xì)胞，涂片后在熒光顯微鏡下觀察并進(jìn)行定量分析，重復(fù)3次。

1.5 大鼠肝臟組織白細(xì)胞介素-6（IL-6）的表達(dá)

肝臟組織在10%福爾馬林溶液中置于4 ℃冰箱固定72 h。然后，對(duì)樣品進(jìn)行常規(guī)處理和石蠟包埋。然后將組織切成4 μm 厚度使用IL-6 兔抗大鼠一抗（Abcam，美國，稀釋濃度1∶50）、山羊抗兔二抗（索萊寶，北京，稀釋濃度1∶200）進(jìn)行免疫組化染色（Immuno histochemistry，IHC），根據(jù)SP 試劑盒（中山金橋，北京）說明書操作，顯微鏡觀察染色情況，重復(fù)3次。

1.6 大鼠肝組織IL-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（建成，南京）測定4 組大鼠肝組織IL-6 和TNF-α，重復(fù)3 次，參照試劑盒說明書操作。

1.7 大鼠肝臟組織氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測 檢測肝臟勻漿的上清液氧化應(yīng)激標(biāo)記物水平。根據(jù)生物診斷試劑盒（Dokki，埃及）說明書，對(duì)過氧化氫酶（catalase，CAT）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）進(jìn)行檢測，重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TP對(duì)膿毒癥大鼠肝損傷具有保護(hù)治療作用

Sham 組大鼠肝形態(tài)正常，與Sham 組比較，Sham+TP 組肝形態(tài)無明顯改變，說明TP 對(duì)大鼠肝臟無明顯毒副作用；CLP 組大鼠肝臟出現(xiàn)大空泡，說明肝臟受到損傷；而CLP+TP 組大鼠肝臟大空泡較CLP 組明顯減少，說明TP 可改善膿毒癥大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，見圖1。與Sham 組相比，Sham+TP組AST及ALT的水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CLP 組與Sham 組相比，AST 及ALT 的水平增高（P＜0.001）；CLP+TP 組與CLP 組相比，AST及ALT的水平降低（P＜0.01），見表1。

表1 TP處理對(duì)膿毒癥大鼠血液中AST、ALT含量的影響U/L， ±s

表1 TP處理對(duì)膿毒癥大鼠血液中AST、ALT含量的影響U/L， ±s

與Sham組相比，###P＜0.001；與CLP組相比，**P＜0.01。

圖1 各組大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)（HE，×400）

2.2 TP可減少膿毒癥大鼠肝臟細(xì)胞凋亡 與Sham組相比，Sham+TP組TUNEL陽性細(xì)胞比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Sham組相比，CLP組TUNEL陽性細(xì)胞比例增加（P＜0.001）；與CLP組相比，CLP+TP 組TUNEL 陽性細(xì)胞比例降低（P＜0.01），見圖2、表2。

表2 TP處理對(duì)膿毒癥大鼠肝臟細(xì)胞中TUNEL染色陽性細(xì)胞比例的影響%， ±s

表2 TP處理對(duì)膿毒癥大鼠肝臟細(xì)胞中TUNEL染色陽性細(xì)胞比例的影響%， ±s

與Sham組相比，###P＜0.001；與CLP組相比，**P＜0.01。

圖2 TP對(duì)膿毒癥大鼠肝臟細(xì)胞凋亡的影響（×400）

2.3 TP對(duì)膿毒癥大鼠肝臟組織中炎癥反應(yīng)的影響

IL-6陽性反應(yīng)呈棕色。Sham+TP組及Sham組大鼠肝臟組織中均無明顯的IL-6陽性表達(dá)；在CLP組中，可見大量IL-6陽性表達(dá)，而CLP+TP組IL-6陽性表達(dá)減少，見圖3。與Sham 組相比，Sham+TP 組IL-6及TNF-α水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Sham組相比，CLP組IL-6及TNF-α水平增高（P＜0.001）；與CLP 組相比，CLP+TP 組IL-6 及TNF-α水平降低（P＜0.01），見表3。

表3 TP處理對(duì)膿毒癥大鼠肝臟中IL-6、TNF-α含量的影響pg/mL， ±s

表3 TP處理對(duì)膿毒癥大鼠肝臟中IL-6、TNF-α含量的影響pg/mL， ±s

與Sham組相比，##P＜0.01，###P＜0.001；與CLP組相比，**P＜0.01，***P＜0.001。

圖3 免疫組化染色觀察TP對(duì)輕膿毒癥大鼠肝臟組織中IL-6水平的影響（×400）

2.4 TP對(duì)膿毒癥大鼠肝臟組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 與Sham 組相比，Sham+TP 組CAT 及SOD 水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Sham組相比，CLP 組CAT 及SOD 水平降低（P＜0.01）；與CLP組相比，CLP+TP組CAT及SOD水平增高（P＜0.05），見表4。

表4 TP處理對(duì)膿毒癥大鼠肝臟組織中的CAT、SOD含量的影響U/mg，n=10

3 討論

近年來，膿毒癥發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)仍呈現(xiàn)明顯增高的趨勢，且死亡率居高不下[8]。肝臟是膿毒癥最常受累的靶器官之一，與預(yù)后密切相關(guān)。膿毒癥后的肝功能障礙是多器官功能障礙和膿毒癥誘發(fā)的死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，給臨床診療帶來了較大的困擾[9-10]。膿毒癥發(fā)生時(shí)肝臟微循環(huán)血流量減少，肝竇灌注降低，肝功能降低，本研究應(yīng)用CLP誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠肝損傷模型，發(fā)現(xiàn)CLP組大鼠肝臟出現(xiàn)大空泡，且CLP組與Sham組相比，AST及ALT的水平增高，說明膿毒癥時(shí)大鼠的肝臟受損，并且在這一病理過程中，大鼠肝臟組織中炎癥及氧化應(yīng)激存在過度激活。

TP是茶葉中非常重要的成分，作為一種天然的酚類化合物參與過氧化過程中螯合脂質(zhì)過氧化自由基，降低多酚自由基含量，阻斷自由基氧化鏈反應(yīng)，從而有效清除自由基，現(xiàn)已被國內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用于過氧化引起的多種疾病治療中，如梗阻性黃疸肝損傷、急性肝損傷、酒精性肝損傷和肝癌，發(fā)揮肝保護(hù)作用[11-12]。為驗(yàn)證TP對(duì)膿毒癥大鼠肝損傷是否具有保護(hù)作用，本研究通過給予CLP大鼠模型TP治療，發(fā)現(xiàn)CLP+TP 組大鼠肝臟大空泡較CLP 組減少，CLP+TP 組AST 及ALT 的水平低于CLP 組，說明TP 對(duì)膿毒癥大鼠肝損傷具有保護(hù)治療作用。肝細(xì)胞凋亡或者壞死是造成肝臟損傷和肝臟疾病最基本的中心環(huán)節(jié)，在膿毒癥肝損傷的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[13]。本研究采用TUNEL 染色對(duì)各組大鼠肝臟細(xì)胞凋亡進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，Sham 組的大鼠采用TP 或者生理鹽水灌胃后CLP 組TUNEL陽性細(xì)胞比例高于Sham 組，而膿毒癥模型大鼠經(jīng)TP 治療后，TUNEL 陽性細(xì)胞比例降低，提示TP 可減少膿毒癥大鼠肝臟細(xì)胞凋亡。

炎癥細(xì)胞過度激活并釋放大量炎癥因子是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。有研究顯示，膿毒癥能引起的肝損傷涉及炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的過度激活，此時(shí)體內(nèi)可產(chǎn)生大量的氧自由基，而自由基的形成及其引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是肝損傷的主要機(jī)制之一，并且已有文獻(xiàn)報(bào)道炎癥因子如TNFα 直接參與肝壞死的發(fā)生，在膿毒癥肝損傷中發(fā)揮重要的作用[14-15]。而TP已被證實(shí)在多種生理及病理過程中可發(fā)揮抗炎及抗氧化的作用，不僅可減少細(xì)胞內(nèi)因氧化和自由基引起的DNA 損傷，保護(hù)組織，還可與過氧化氫自由基反應(yīng)，終止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[16-17]。本研究大鼠肝臟組織切片IHC 染色發(fā)現(xiàn)，Sham 組的大鼠肝臟組織中均無明顯IL-6 表達(dá)。Sham+TP 組、Sham 組的大鼠肝臟IL-6 及TNF-α 水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且CAT 及SOD 水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明手術(shù)過程及灌胃處理對(duì)大鼠的炎癥因子、氧化應(yīng)激因子的表達(dá)無顯著影響，而膿毒癥模型大鼠的IL-6及TNF-α水平均增高，CAT及SOD水平降低，且經(jīng)TP治療的大鼠模型的肝臟組織IL-6及TNF-α水平降低，CAT及SOD水平增高，提示TP在膿毒癥引起的肝損傷這一病理過程中可發(fā)揮其抗炎及抗氧化的作用。

綜上所述，TP可通過抑制膿毒癥引起的肝臟炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而發(fā)揮其對(duì)肝臟的保護(hù)作用，并且具有一定的安全性，可為膿毒癥的臨床治療及輔助用藥提供新的思路，但對(duì)于TP改善膿毒癥引起肝損傷的具體作用機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。