紀(jì)志豪，張曦，余云生

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006)

目前，急性心肌梗死仍然是中國乃至全世界最主要的死亡原因[1- 2]。心肌梗死通常為在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)上因急性、持續(xù)性缺血缺氧造成氧供需失衡所致的心肌細(xì)胞死亡[3]。如果心肌梗死后幾分鐘內(nèi)迅速恢復(fù)冠脈血流，缺氧對(duì)心肌細(xì)胞所造成的影響是完全可逆的，但動(dòng)物模型證實(shí)，缺血長(zhǎng)達(dá)20 min即可對(duì)心肌造成不可逆損傷[4- 5]。不同于蠑螈和斑馬魚等低等脊椎動(dòng)物有著強(qiáng)大的再生能力來修復(fù)受損心肌，哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞高度分化，無法進(jìn)行細(xì)胞分裂，成年后心臟無再生能力。損傷后的心肌會(huì)被細(xì)胞外基質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和一些增生的細(xì)胞代替，形成瘢痕組織，損害心肌收縮力[6]。然而已有研究證實(shí)成年人類心肌細(xì)胞仍具有增殖能力，每年以較低的速率進(jìn)行更新，并隨著年齡增加而降低[7]。最近一例案例報(bào)道表明，一名剛出生的新生兒發(fā)生嚴(yán)重的心肌梗死后在1個(gè)半月時(shí)間內(nèi)心功能完全恢復(fù)正常，并且在1年的隨訪中與同年齡的健康嬰兒無差異[8]。此外，測(cè)序技術(shù)成本的降低導(dǎo)致越來越多的非編碼RNA(non- coding RNA，ncRNA)被發(fā)現(xiàn)，其中較多的ncRNA具有心臟特異性，與心臟再生修復(fù)聯(lián)系密切。通過調(diào)節(jié)這些ncRNA在體外和體內(nèi)模型中的表達(dá)，證明其足以促進(jìn)心肌細(xì)胞自主增殖反應(yīng)的發(fā)生。本文作者簡(jiǎn)單概括ncRNA在心肌細(xì)胞增殖中的作用，探討未來臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的可行性。

1 ncRNA調(diào)控

ncRNA是指不被翻譯成氨基酸序列的RNA，主要包括微小RNA(mirco RNA, miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non- coding RNA, lncRNA)和環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)。到目前為止，許多研究表明ncRNA在心臟發(fā)育和心肌細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用[9- 10]。1993年從線蟲中首次發(fā)現(xiàn)miRNA并命名為L(zhǎng)in- 4，miRNA開始進(jìn)入生命科學(xué)領(lǐng)域的研究[11]。越來越多的研究證實(shí)miRNA在促進(jìn)內(nèi)源性心肌細(xì)胞增殖和心臟再生中發(fā)揮重要作用。相反，lncRNA因發(fā)現(xiàn)較晚，目前對(duì)其在心肌梗死等方面的研究不如miRNA，雖然絕大部分lncRNA的生物學(xué)功能尚不清楚，但已成為心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

1.1 miRNA

miRNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的ncRNA，主要通過抑制蛋白質(zhì)翻譯或誘導(dǎo)靶mRNA失穩(wěn)來控制轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)而發(fā)揮生物學(xué)作用。近十年來，大量的體外和體內(nèi)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了miRNA在心臟的發(fā)育和心血管疾病中的作用，并證實(shí)其通過作用不同的靶點(diǎn)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，從而調(diào)控著心肌纖維化、凋亡和細(xì)胞增殖等[12]。Eulalio等[13]進(jìn)行的高通量篩選發(fā)現(xiàn)204種miRNA可以促進(jìn)新生心肌細(xì)胞增殖，并通過實(shí)驗(yàn)證明hsa- miR- 590和hsa- miR- 199a可以靶向抑制同源域蛋白同源盒(HOPX)促進(jìn)新生小鼠和大鼠的心肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，使心肌細(xì)胞數(shù)量顯著增加，還能減少梗死面積，誘導(dǎo)心臟再生。Cd151可以誘導(dǎo)p38表達(dá)，是心肌細(xì)胞增殖的抑制因子，同時(shí)也是miR- 199a的直接作用靶點(diǎn)。miR- 199a抑制Cd151表達(dá)，從而下調(diào)p38促進(jìn)小鼠心肌細(xì)胞增殖[14]。隨后，又有研究利用腺病毒載體將miR- 199a導(dǎo)入梗死的豬心臟，刺激心肌細(xì)胞增殖，改善心肌收縮力[15]。miR- 15家族中的miR- 195是心臟發(fā)育中細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，miR- 195通過抑制一些參與G2/M期轉(zhuǎn)變和有絲分裂過程的細(xì)胞周期基因(如Chek1)來阻止心肌細(xì)胞的增殖[16]。研究[17]表明,小鼠出生到成年時(shí)期抑制miR- 15家族的表達(dá)可增加心肌細(xì)胞增殖，并改善心肌梗死后左心室收縮功能。miR- 30和miR- 141是通過抑制Cyclin A的表達(dá)阻止細(xì)胞周期進(jìn)程[18]。miR- 29a可以抑制Cyclin D2的表達(dá)，通過抑制miR- 29a誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞增殖，加速G1/S和G2/M的轉(zhuǎn)換[19]。而miR- 133a可以抑制血清反應(yīng)因子和Cyclin D的表達(dá)，miR- 133a的表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠心肌細(xì)胞異常增殖[20]。miR- 302/367家族對(duì)于哺乳動(dòng)物心臟生長(zhǎng)發(fā)育極為重要，在小鼠胚胎期高度表達(dá)，成年期幾乎不表達(dá)。miR- 302/367缺失的小鼠心室壁發(fā)育不良，心肌細(xì)胞增殖減少。過表達(dá)miR- 302/367導(dǎo)致小鼠心肌梗死后瘢痕減少，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖并且修復(fù)心功能。河馬信號(hào)通路(the Hippo pathway，HIPPO)由一系列保守的激酶構(gòu)成，通過激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡來控制器官體積。最近幾年研究表明HIPPO信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞增殖，控制心臟大小，并且和心臟再生密切相關(guān)[21- 22]。miR- 302/367通過靶向抑制HIPPO信號(hào)通路中的Mst1、Lats2和Mob1B來抑制YAP磷酸化，與轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)相關(guān)結(jié)構(gòu)域(TEAD)結(jié)合促進(jìn)小鼠心肌細(xì)胞增殖[23]。越來越多的研究支持miRNA具有作為再生靶點(diǎn)的能力，同時(shí)因其分子量小、目標(biāo)基因明確引起廣泛關(guān)注[24]。然而，miRNA因?yàn)閺?fù)雜的多效應(yīng)可能導(dǎo)致生物脫靶效應(yīng)[25]。只有更加深入了解分子靶點(diǎn)，才能研發(fā)出高效、安全的miRNA產(chǎn)品。

1.2 lncRNA

lncRNA是一類長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，最初被認(rèn)為是沒有生物學(xué)功能的RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物[26]。近年來，越來越多研究揭示了lncRNA參與了許多生物學(xué)過程，例如調(diào)節(jié)疾病表觀基因、組蛋白修飾、染色體沉默和免疫反應(yīng)等[27- 30]。在心臟發(fā)育過程中，一些lncRNA發(fā)揮著調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞分化、增殖、凋亡和心肌肥大等生物學(xué)功能[9,31]。lncRNA同樣通過正性或負(fù)性調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞周期來調(diào)控發(fā)育和增殖。內(nèi)源性心臟再生相關(guān)調(diào)節(jié)因子(ECRAR)在胎兒心臟中表達(dá)較高，出生后逐漸降低。過表達(dá)ECRAR可以促進(jìn)成年大鼠心肌梗死后心肌增殖，使毛細(xì)血管密度增加，減少梗死面積，抑制纖維化。研究發(fā)現(xiàn)ECRAR受轉(zhuǎn)錄因子E2F1調(diào)控，可被其轉(zhuǎn)錄上調(diào)。而且，ECRAR可以直接與細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)結(jié)合，促進(jìn)其磷酸化并易位到細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)Cyclin D1、Cyclin E和E2F1的激活，形成一個(gè)正反饋通路，并加速G1/S轉(zhuǎn)變，激活細(xì)胞周期再進(jìn)入[32]。心肌細(xì)胞再生相關(guān)lncRNA(CRRL)在胚胎時(shí)期表達(dá)最低，在成年期表達(dá)最高。被敲除CRRL基因的大鼠在心肌梗死后心肌細(xì)胞增殖率升高，梗死區(qū)面積減少，心功能較前改善。過表達(dá)CRRL則抑制心肌細(xì)胞增殖。CRRL通過海綿效應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR- 199a，上調(diào)靶基因HOPX，抑制心肌再生[33]。成人體內(nèi)的心肌細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)因子(CPR)是一種表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于胚胎期的lncRNA，CPR作為心肌再生的負(fù)調(diào)控因子，可降低心肌增殖能力。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，CPR的沉默會(huì)增加小鼠心肌細(xì)胞增殖水平，加速細(xì)胞增殖并增強(qiáng)左室收縮能力，修復(fù)心功能。研究[9]證實(shí)，CPR通過與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNMT3A)相互作用，誘導(dǎo)微小染色體維系蛋白3(MCM3)甲基化，降低MCM3表達(dá)。MCM3是CPR的作用靶點(diǎn)，正性調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的增殖和再生。反義lncRNA(antisense lncRNA，AS lncRNA)是指蛋白編碼基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄，并與該基因的mRNA重疊的RNA[34]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(Sirt1) AS lncRNA在體外心肌細(xì)胞過表達(dá)時(shí)，可以促進(jìn)去分化和增殖。成年小鼠體內(nèi)過表達(dá)Sirt1 AS lncRNA，激活心肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)行分裂。誘導(dǎo)心肌梗死后，Sirt1 AS lncRNA可以提高存活率，減少心肌梗死瘢痕面積并改善心功能。Sirt1雙向調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞活動(dòng)，過高表達(dá)會(huì)增加氧化應(yīng)激損傷心肌；而過低表達(dá)可以對(duì)抗氧化，減少凋亡，促進(jìn)增殖。Sirt1 AS lncRNA通過結(jié)合Sirt1 mRNA增強(qiáng)穩(wěn)定性，并調(diào)控Sirt1低表達(dá)水平，正向調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖[35]。上述研究表明lncRNA在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖中具有重要作用。作為近幾年新興的研究目標(biāo)，隨著復(fù)雜的作用機(jī)制逐漸被發(fā)現(xiàn)，我們對(duì)lncRNA有了更深層的認(rèn)識(shí)，也證明了其作為心肌細(xì)胞增殖和心臟再生修復(fù)的治療靶點(diǎn)的巨大潛力。

1.3 circRNA

circRNA與其他ncRNA結(jié)構(gòu)不同，是一種特殊的ncRNA分子。circRNA的3′端和5′端閉合起來形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易受RNA外切酶影響，因此在生物體內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定且不易降解[36]。circRNA通過調(diào)控RNA結(jié)合蛋白或者充當(dāng)“miRNA海綿”抑制靶基因來發(fā)揮生物學(xué)作用[37- 38]。隨著對(duì)circRNA的深入研究，發(fā)現(xiàn)許多circRNA參與心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，例如心肌肥大、衰老與凋亡[39]。然而，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的circRNA目前只發(fā)現(xiàn)1種。Huang等[40]通過RNA測(cè)序和超級(jí)增強(qiáng)子數(shù)據(jù)在成人、大鼠和小鼠心臟中發(fā)現(xiàn)1個(gè)高度保守的circRNA:circNfix，在成年心臟中高度表達(dá)。敲除circNfix基因，體外心肌細(xì)胞呈去分化表現(xiàn)，并進(jìn)行細(xì)胞分裂。此外，可提高H2O2處理后心肌細(xì)胞的存活率。沉默成年小鼠體內(nèi)circNfix表達(dá)，可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞去分化、增殖和再分化。進(jìn)一步敲除心肌梗死小鼠的circNfix后，觀察到梗死邊界區(qū)增殖細(xì)胞比例增加，心肌細(xì)胞凋亡減少，新生血管密度增加；過表達(dá)circNfix的小鼠梗死區(qū)面積增大，損害心臟再生過程。Meis1是細(xì)胞周期阻滯關(guān)鍵調(diào)控因子，可以結(jié)合并激活circNfix的超級(jí)增強(qiáng)子來調(diào)控circNfix表達(dá)。沉默Meis1可以降低circNfix表達(dá)，促進(jìn)體內(nèi)心肌細(xì)胞增殖。同時(shí)，降低circNfix表達(dá)也可以逆轉(zhuǎn)Meis1對(duì)心肌細(xì)胞增殖的抑制作用。Y- 盒結(jié)合蛋白- 1(YBX1)是參與心臟再生的轉(zhuǎn)錄因子，通過增加細(xì)胞周期蛋白A和細(xì)胞周期蛋白B1促進(jìn)細(xì)胞增殖。circRNA結(jié)合YBX1，使其滯留在細(xì)胞質(zhì)，通過泛素化- 蛋白酶體途徑降解YBX1。同時(shí)，circNfix作為miRNA- 214的分子海綿，促進(jìn)糖原合酶激酶- 3β對(duì)β- catenin的降解作用，抑制β- catenin活性，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖和血管形成[40]。如前所述，circRNA在心肌細(xì)胞增殖領(lǐng)域的研究剛剛起步，因其特殊的結(jié)構(gòu)和較強(qiáng)的穩(wěn)定性，已經(jīng)成為科學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)。

2 ncRNA治療的局限性

隨著對(duì)心臟再生起源的研究，普遍認(rèn)為新產(chǎn)生的心肌細(xì)胞來源于原有心肌細(xì)胞的增殖。調(diào)控內(nèi)源性心肌細(xì)胞增殖的多種機(jī)制逐漸被發(fā)現(xiàn)，大量的心肌細(xì)胞增殖研究取得良好的成果。但因?yàn)榇嬖谏形唇鉀Q的潛在危險(xiǎn)，還未應(yīng)用到臨床研究中。miR- 302/367持續(xù)過表達(dá)刺激小鼠心肌，雖然心肌細(xì)胞數(shù)量明顯增多，但導(dǎo)致心臟腫大、心功能受損[41]。miR- 199a導(dǎo)入豬心臟后，心臟形態(tài)和功能逐漸恢復(fù)并趨于正常，但大部分豬在注射7～8周后突發(fā)室顫而猝死[15]。因此，通過刺激內(nèi)源性心肌細(xì)胞增殖而修復(fù)心功能是可行的選擇，但要嚴(yán)格控制干預(yù)時(shí)間和程度，充分考慮藥物的靶向性、病毒載體是否具有致癌性以及持續(xù)的去分化作用對(duì)心臟的損傷。

3 結(jié) 語

目前臨床上對(duì)于心肌梗死的治療主要有藥物干預(yù)、支架介入和冠脈搭橋等，晚期心臟衰竭可以選擇左心輔助裝置和心臟移植等治療。無論是支架介入、搭橋還是左心輔助裝置，都是恢復(fù)冠脈血流和改善心功能，無法修復(fù)或者補(bǔ)充壞死的心肌細(xì)胞。心臟移植因其供體稀缺、術(shù)后免疫排斥等問題難以廣泛應(yīng)用。大部分ncRNA具有高度保守性，在心臟中高度表達(dá)，并且是參與調(diào)控心臟生長(zhǎng)發(fā)育以及再生網(wǎng)絡(luò)的主要編輯者，因此，ncRNA在治療心肌梗死和心臟再生中至關(guān)重要。與其他ncRNA相比，miRNA的研究處于領(lǐng)先位置。lncRNA和circRNA作為新的再生目標(biāo)，在心臟中大量表達(dá)，具有極大的潛力和可行性，成為心臟再生領(lǐng)域中非常有吸引力的研究方向。隨著測(cè)序技術(shù)和基因工程的進(jìn)一步發(fā)展，越來越多的lncRNA和circRNA分子機(jī)制被挖掘，很大程度上與miRNA分子作用存在相互交叉調(diào)節(jié)的可能，例如Meis1可以同時(shí)作為miRNA[42](miR- 548c- 3p、miR- 509- 3p和miR- 23b- 3p)和circNfix的目標(biāo)靶點(diǎn)，miR- 29、miR- 133和ECRAR同樣可以作用于Cyclin D發(fā)揮不同的心肌細(xì)胞增殖效應(yīng)。充分了解ncRNA分子間內(nèi)在作用機(jī)制，運(yùn)用更加精確有效的策略來調(diào)控心肌細(xì)胞增殖，有望在不久的未來將ncRNA應(yīng)用到臨床治療中。