鄔靜 林針懿 張葉 劉樂 郭璁 葉蓓蕾 黎維詩 凌鵬

1. 海南大學熱帶特色林木花卉遺傳與種質創(chuàng)新教育部重點實驗室，海南?？? 570228;2. 海南博大蘭花科技有限公司，海南海口? 570311

摘? 要：對204株菲律賓火焰蘭（ ）組織培養(yǎng)衍生群體的26個主要表型性狀和遺傳多樣性水平進行調查與分析，并利用ISSR分子標記對該群體的遺傳多樣性進行驗證。結果表明：7個外觀株型性狀的遺傳多樣性指數(shù)為1.85，19個花部數(shù)量性狀的遺傳多樣性指數(shù)為1.87。通過主成分分析，提取了7個主成分，累積貢獻率達67.887%，其中導致菲律賓火焰蘭群體中個體存在差異的主要性狀有所有花枝是否同面、花瓣厚度等。對基于表型性狀的數(shù)據(jù)進行聚類分析，204株菲律賓火焰蘭組織培養(yǎng)群體被分為5大類群：第Ⅰ類群有78株，主要特點表現(xiàn)為葉片數(shù)多;第Ⅱ類群包含11株，主要特點為花序有較多的分叉數(shù)和花朵數(shù);第Ⅲ類群包含31株，主要特征表現(xiàn)為花序的第一分枝的長度和葉長小于其他類群;第Ⅳ類群包含70株，主要特征是蕊柱的長度和寬度均小于其他類群;第Ⅴ類群有14株，主要特征為花梗直徑和中萼寬度均大于其他類群。通過ISSR分子標記對該群體的遺傳多樣性進行驗證，結果顯示，2對ISSR分子標記引物在24株群體樣本中共擴增出了17條多態(tài)性條帶，平均每對引物擴增出8.5條多態(tài)性條帶。該研究結果為火焰蘭的品種改良提供了重要的遺傳資源信息。

關鍵詞：菲律賓火焰蘭;表型性狀;組織培養(yǎng)衍生群體;ISSR;遺傳多樣性

中圖分類號：S602 ?????文獻標識碼：A

Phenotypic Identification and Genetic Diversity Analysis of Tissue Culture Derived Population of

WU Jing， LIN Zhenyi， ZHANG Ye， LIU Le， GUO Cong， YE Beilei， LI Weishi， LING Peng

1. Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest Trees and Ornamental Plants， Ministry of Education， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Hainan Boda Orchid Technology Co.， Ltd.， Haikou， Hainan 570311， China

26 phenotypic traits of 204 plants of population derived from tissue culture were studied to understand the genetic diversity levels of the tissue culture population. Molecular makers such as ISSR markers were used in the study. The results showed that the genetic diversity index of 7 morphological traits was 1.85， and 19 quantitative traits of flower part diversity index was 1.87. The principal component analysis showed that there were 7 principal components of a cumulative contribution rate 67.887%. The main traits leading to the differences among the individuals were whether all flower branches were on the same surface or on the different faces， the thickness of petal， the length of lateral branch， the length of column bearing stamens and pistils， the width of middle calyx， thenumber of lateral branch， and the number of leaf. Cluster analysis on the data of phenotypic traits revealed that the 204 plants were divided into different four groups. Group I consisted of 78 plants， which had much more leaves. Group II contained 11 plants， which had more branches and flowers. Group III had 31 plants， which had shorter first inflorescence branch and shorter leaf length. Group IV contained 70 plants， which had much shorter and narrower style. Group V contained 14 plantswhich had larger pedicel diameter and wider calyx. ISSR markers were used to confirm the result from cluster analysis， and the results showed that 17 polymorphic bands were amplified by 2 pairs of ISSR primers on 24 plants， on average there were 8.5 polymorphic bands amplified by each pair of primers. The research results would provide a new way to seek genetic variation and an important genetic resource in variety improvements.

; phenotypic trait; tissue culture derivation; ISSR; genetic diversity

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.008

火焰蘭（ Lour.）又稱腎藥蘭、火星花、紅珊瑚蘭，屬蘭科火焰蘭屬，主要分布于我國海南、廣西等地?；鹧嫣m的花色鮮亮艷麗且花形奇特，喜高溫高濕氣候，目前被廣泛用于切花、布景、綠籬和制作盆栽等，具有很高的園藝園林應用價值。近年來，火焰蘭類的切花產(chǎn)品在國內(nèi)各地的蘭展中屢屢出現(xiàn)，國內(nèi)市場潛力巨大。蘭花的重要表型性狀對其市場經(jīng)濟價值的提升和開發(fā)具有極其重要的作用。因此，開展火焰蘭重要表型性狀的評估與機制研究非常有必要且具有重要的意義。

我國有3個火焰蘭原生種，分別為云南火焰蘭（）、火焰蘭（）和中華火焰蘭（），自然分布于海南、云南和廣州等地。國內(nèi)對火焰蘭的研究基礎非常薄弱，其中華南植物園已收集了火焰蘭屬種質資源90多份，并且建立了火焰蘭種質資源圃。近年來，有關火焰蘭的報道主要涉及遠緣雜交育種、種質資源評價、群體分布現(xiàn)狀、離體快速繁殖、高通量轉錄組測序分析等，目前國內(nèi)也已開展利用本土的3種火焰蘭原生種種質資源的雜交育種研究。

目前，國內(nèi)火焰蘭可用作種質資源研究的材料仍較少，且植株自身對環(huán)境要求比較高，存在區(qū)域限制，火焰蘭種質資源樣本尤為稀缺。因此，本課題組通過對菲律賓火焰蘭的組織培養(yǎng)衍生群體進行連續(xù)觀察，結果發(fā)現(xiàn)其中個體之間在許多性狀上存在明顯的多樣性，為了更好地描述和評價該原生群體中存在的性狀多樣性，同時探索利用這些性狀多樣性在火焰蘭種質創(chuàng)新和新品種培育中的應用，本課題組決定以該火焰蘭群體開展性狀多樣性調查研究，為今后開展火焰蘭屬乃至蘭科植物的遺傳多樣性分析、種質資源評價、遺傳圖譜的構建及遺傳育種等提供理論依據(jù)。

? 材料與方法

? 材料

供試的材料是利用原種菲律賓火焰蘭差異較大的不同個體經(jīng)組織培養(yǎng)無性繁殖后獲得的混合群體，共204株，均取自于海南博大蘭花科技有限公司東山基地種質資源圃（110°14′33.1″E，19°47′29.7″N）。供試群體的表型數(shù)據(jù)測量、整理結束后，對數(shù)據(jù)進行性狀統(tǒng)計，后作正態(tài)分布圖，從曲線兩端分別取9株，中心均數(shù)處取6株，共從供試材料中篩選出24株表型性狀具有代表性的火焰蘭單株進行ISSR-PCR親緣關系分析。

?方法

1.2.1? 表型數(shù)據(jù)測量方法 ?從2020年9月至2021年5月連續(xù)觀測2個花期，分別調查了中萼長與寬（MSL、MSW，mm）、側萼長與寬（SL、SW，mm）、花瓣長與寬（PetL、PetW，mm）、唇瓣長與寬（LipL、LipW，mm）、蕊柱長與寬（GL、GW，mm）、花瓣厚度（PT，mm）、花朵數(shù)（NF）、分叉數(shù)（BN）、第一分枝至基部長度（BB，cm）、側枝數(shù)（NLB）、側枝長度（LBL，cm）、花枝長度（LFB，cm）、花梗直徑（FPD，mm）、脫苞數(shù)（NEB）、所有花枝是否同面（SS）、葉片數(shù)（NB）、葉片厚度（BT，mm）、葉長（LeL，mm）、葉寬（LeW，mm）、株高（PH，cm）、株幅（PlW，cm）等26個表型性狀。使用游標卡尺（AIRAJ 0～150?mm，精度0.01）、卷尺等測量工具測取數(shù)據(jù)并記錄，所有性狀數(shù)據(jù)均為2個連續(xù)花期調查的平均值。

1.2.2? DNA提取? 取新鮮、幼嫩的火焰蘭葉片，采用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（無錫百泰克生物技術有限公司）進行提取，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其濃度和純度，稀釋至10?g/μL，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3? 引物篩選及ISSR-PCR分析? 供試引物為加拿大哥倫比亞大學公布的第9套ISSR通用引物，ISSR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR的反應體系為：DNA模板1 μL，2×Es Master Mix（Dye） 10?μL，引物1?μL，加ddHO 8?μL。反應程序為：94℃預變性5 min;94℃變性45?s，38/49℃退火45?s，72℃循環(huán)2?min，循環(huán)40次;72℃延伸7?min，最后4℃保存。

1.2.4? 瓊脂糖凝膠電泳檢測? 取PCR產(chǎn)物10?μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，100?V電壓下35?min電泳，待電泳結束后在凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD GelDoc XR+全自動凝膠成像系統(tǒng)，型號Universal HoodⅡ）上進行拍照保存。

? 數(shù)據(jù)處理

表型性狀的數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010進行處理，計算最小值、最大值、極差、平均值、標準差、變異系數(shù)和多樣性指數(shù)。多樣性指數(shù)采用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H′）方法計算，將所有表型性狀數(shù)據(jù)的平均值和標準差劃分為10個等級，每0.5σ為一級，σ為標準差。通過SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行主成分分析、相關性分析，用RStudio軟件進行聚類分析。

為進一步分析群體的遺傳多樣性，對不同分子量的PCR產(chǎn)物進行統(tǒng)計分析，根據(jù)每個引物在各樣品中擴增出來的基因位點進行統(tǒng)計，擴增出條帶的標記為1，未擴增出條帶的標記為0，將所有表型性狀數(shù)據(jù)輸入Excel中，創(chuàng)建數(shù)據(jù)矩陣，然后通過NTSYSpc 2.10e軟件進行聚類分析。

? 結果與分析

? 外觀株型形態(tài)特征比較

由表1可知，火焰蘭受測群體的外觀株型呈現(xiàn)出差異形態(tài)，主要表現(xiàn)為所有花枝是否同面、葉片數(shù)、葉片厚度、葉長、葉寬、株高、株幅的平均值分別為1.81、35.75、1.60?mm、97.98?mm、39.66?mm、112.54?cm、45.10?cm;在群體內(nèi)性狀多樣性指數(shù)范圍為0.80～2.07，其中葉長性狀多樣性指數(shù)最高，所有花枝是否同面性狀的多樣性指數(shù)最低。對變異系數(shù)的分析結果表明，除葉長外，其余各性狀的變異系數(shù)均大于10%。其中所有花枝是否同面的變異系數(shù)最大，達20.44%，其次為葉片厚度（16.88%）、株幅（16.16%），而葉長（8.71%）和葉寬（10.56%）的最小。

?花部數(shù)量性狀特征比較

火焰蘭受測群體的中萼長與寬、側萼長與寬、花瓣長與寬、唇瓣長與寬、蕊柱長與寬、花瓣厚度、花朵數(shù)、分叉數(shù)、第一分枝至基部長度、側枝數(shù)、側枝長度、花枝長度、花梗直徑、脫苞數(shù)等19個花部數(shù)量性狀多樣性分析結果如表1所示，其整體變異系數(shù)范圍較大，除了中萼長、側萼長與寬、花瓣長與寬、唇瓣長、蕊柱長外，其余性狀變異系數(shù)均大于10%。其中，側萼長的變異系數(shù)最?。?.25%），其次為中萼長（6.35%），脫苞數(shù)的變異系數(shù)最大（181.02%），其次為花瓣厚度（35.29%），平均變異系數(shù)為23.52%。遺傳多樣性指數(shù)最大的為側枝長度（2.07），其次為中萼長、側萼長、第一分枝至基部長度，均為2.05，遺傳多樣性指數(shù)最小的為側枝數(shù)（0.62）。這表明火焰蘭群體主要觀賞性狀多樣性豐富且水平較高，具有較為豐富的變異，具有一定的品種改良空間和潛力。

? 性狀相關性分析

對火焰蘭受測群體的26個表型性狀進行相關性分析，結果表明，大部分表型性狀之間存在顯著或者極顯著相關性（表2）。如所有花枝是否同面與分叉數(shù)、株高呈極顯著正相關（<0.01）;花枝長度與花梗直徑、株幅、株高、第一分枝至基部長度、花朵數(shù)、側枝長度、中萼長、側萼長、花瓣寬呈極顯著正相關（<0.01）;花枝長度與花瓣長、葉長、葉片數(shù)呈顯著正相關（<0.05），與花瓣厚度、葉片厚度、側枝數(shù)呈極顯著負相關（<0.01），同時與蕊柱寬呈顯著負相關（< 0.05）;花梗直徑與葉片厚度呈顯著正相關（< 0.05），與側枝數(shù)呈極顯著負相關（<0.01），其次除了分叉數(shù)、第一分枝至基部長度、花朵數(shù)、花瓣厚度、唇瓣長、蕊柱長、葉片數(shù)之外，均呈極顯著正相關（<0.01）。

?主成分分析

對火焰蘭受測群體的26個表型性狀進行主成分分析（表3），結果表明，前7個主成分所對應的特征值均大于1，累計貢獻率達67.887%，表明前7個主成分基本可反映原始因子代表的大部分信息。其中，第1主成分的特征值為6.392，其方差貢獻率最大（24.586%），占主導地位，其中所有花枝是否同面、花枝長度的特征值（絕對值）較大，起決定作用，葉長具有最小的特征向量值（0.015）;第2主成分的方差貢獻率為12.558%，其中中萼寬度、側萼長度的特征向量值較大，株幅具有最小的特征向量值（0.004）;第3主成分的方差貢獻率為8.891%，蕊柱長度、寬度的特征值最大，株高的特征值為0;第4主成分的方差貢獻率為6.679%，主要反映花瓣厚度、蕊柱寬;第5主成分的方差貢獻率為5.928%，特征值最大的是側枝長度、唇瓣長度;第6主成分的方差貢獻率為4.726%，主要反映側萼寬度、葉片數(shù);第7主成分的方差貢獻率為4.518%，主要反映側枝數(shù)、脫苞數(shù)。綜上所述，前7個主成分篩選出了7個代表性的指標：所有花枝是否同面、花瓣厚度、側枝長度、中萼寬度、蕊柱長度、葉片數(shù)、側枝數(shù)，這些性狀是造成火焰蘭受測群體表型性狀出現(xiàn)差異的主要影響因素，可作為后續(xù)火焰蘭群體評價和親本選育的重要形態(tài)指標。

?聚類分析

利用RStudio軟件（ward方法）將204株火焰蘭群體進行聚類分析（圖1），結果表明，204株材料被分為5大類群，并計算出各個類群中各個性狀的平均值（表4）。結果顯示，第Ⅰ類群包括78株，主要特征是株型高、葉片數(shù)多于其他類群;第Ⅱ類群包含11株，主要特征是株幅大、分叉數(shù)、花朵數(shù)、側枝數(shù)均多于其他類群;第Ⅲ類群包含31株，主要特征為花梗直徑、第一分枝至基部的長度、側萼長度、葉長葉寬均小于其他類群;第Ⅳ類群包含70株，主要特征是花瓣厚度、唇瓣長度、蕊柱長度、寬度均小于其他類群;第Ⅴ類群包含14株，主要特征為花梗直徑、中萼寬度、側萼長度、花瓣長度、花瓣寬度、唇瓣寬度、蕊柱長度、蕊柱直徑、葉長度、葉寬度均大于其他類群。

?遺傳多樣性分析

從設計的20條引物中共篩選出2條擴增帶最清晰、多態(tài)性最高、重復性最好的ISSR引物（UBC836與UBC807），對24份群體樣本火焰蘭個體進行PCR擴增（圖2）。從2條引物的擴增結果可看出，擴增總條帶為17條，其中多態(tài)性條帶為17條，多態(tài)性比率為100%，平均每條引物擴增產(chǎn)生8.5條擴增產(chǎn)物。其中UBC836擴增位點數(shù)較多為9個，UBC807相對較少，擴增位點8個。結果表明，供試的24株火焰蘭個體反映出群體的遺傳變異較豐富，用ISSR分子標記方法檢測該火焰蘭群體的遺傳多樣性是可行的。

? 基于標記的聚類分析

利用NTSYSpc 2.10e軟件，基于ISSR分子標記對該批受測群體進行聚類分析，由圖3可見，24個植株間的遺傳距離在0.53～1.00之間，表明供試群體具有豐富的遺傳多樣性，在遺傳相似性系數(shù)為0.70處，將該群體劃分為5個類群。第Ⅰ類群包括6株，可進一步分為3個亞類，與其他類群之間的遺傳距離最遠，主要表現(xiàn)為花枝長度、花梗直徑、株高、葉長均小于其他類群，花朵數(shù)也少;第Ⅱ類群和第Ⅴ類群均只包括1株，第Ⅱ類群的單株主要表現(xiàn)為分叉數(shù)多，中萼較長;第Ⅴ類群單株主要表現(xiàn)為花梗直徑、株幅、中萼寬度、側萼長度、寬度、唇瓣寬度、葉寬均大于其他類群的植株，第Ⅱ類群和第Ⅴ類群單株更像是變異單株;第Ⅲ類群的資源數(shù)量最多，包括13株，彼此之間遺傳距離較遠，主要表現(xiàn)為側枝長度較長、葉片數(shù)較多;第Ⅳ類群包括3株，各性狀均處于中間水平。

? 討論

多樣性指數(shù)是評價種質資源多樣性的一項重要指標，廣泛應用于表型多樣性評價，變異系數(shù)可描述性狀的離散程度，大于?10%則表明差異較大。隨著技術的發(fā)展，分子標記技術已經(jīng)被廣泛應用于遺傳多樣性的鑒定，但仍需要與表型性狀結合，為分子研究提供可靠的數(shù)據(jù)。

本研究結果顯示，火焰蘭受測群體的植株形態(tài)與花部數(shù)量性狀特征均有較大的差異。通過對外觀株型的形態(tài)特征進行比較，結果顯示，所有花枝是否同面變異系數(shù)最大（20.44%），葉長變異系數(shù)最小（8.71%），平均變異系數(shù)為11.22%，多樣性指數(shù)范圍為0.80～2.07;花部數(shù)量性狀的形態(tài)特征中側萼長的變異系數(shù)最?。?.25%），脫苞數(shù)的變異系數(shù)最大（181.02%），遺傳多樣性指數(shù)最大的為側枝長度（2.07），遺傳多樣性指數(shù)最小的性狀為側枝數(shù)（0.62），這與姚靖的結果一致：火焰蘭與花相關的性狀是火焰蘭主要的觀賞性狀。相關性分析結果表明，各個性狀之間的相關關系比較復雜，且各個性狀之間基本都存在相關性，這與陳和明等、張葉等、姚靖的研究結果類似。對26個表型性狀進行主成分分析，結果顯示前7個主成分包含了絕大部分的信息，累計貢獻率達67.887%，根據(jù)貢獻率大小選出的主要性狀有所有花枝是否同面、花瓣厚度、側枝長度、中萼寬度、蕊柱長度、葉片數(shù)、側枝數(shù)，這7個代表性的指標是火焰蘭受測群體表型出現(xiàn)差異的主要原因，且這些表型性狀可作為今后火焰蘭變異篩選的主要形態(tài)指標，這與姚靖的結果類似。以上結果均表明，204份火焰蘭樣本中存在豐富的多樣性，可為火焰蘭品種的選育提供豐富的親本材料。

目前，分子標記已經(jīng)成為遺傳多樣性分析和親緣關系分析的主要途徑。本研究利用具有多態(tài)性的ISSR引物對該群體進行聚類分析，進一步運用NTSYSpc 2.10e軟件將該批受測群體分為5大類群。2種聚類分析結果均初步明確了各個類群的特征，結果基本一致。其中第Ⅱ類群可用于培育分叉數(shù)較多的性狀;第Ⅳ類群各項性狀表現(xiàn)均較差，可以剔除;第Ⅴ類群可用于選育花梗直徑、中萼寬、側萼長、唇瓣寬、葉寬等性狀均表現(xiàn)優(yōu)異的植株。多態(tài)性的聚類分析結果與基于表型特征的分類結果基本吻合，說明分子標記可用于火焰蘭群體的遺傳多樣性分析，與姚靖的結論相同。同時，通過對表型性狀的主成分分析、相關性分析、聚類分析及ISSR分子標記分析均驗證了該組織培養(yǎng)衍生群體中存在性狀多樣性，當然其原因也不能排除組織培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的體細胞變異和受環(huán)境影響產(chǎn)生表型變異等現(xiàn)象，具體原因還需進一步研究。

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