周 婧，李卓蓉，吳江婷

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家林業(yè)和草原局森林培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091)

氮素是農(nóng)林植物生長發(fā)育必不可少的大量元素之一，也是農(nóng)林植物根系從土壤中吸收最多的礦質(zhì)元素，對(duì)其生長發(fā)育具有重要意義[1-2]。但在土壤中無機(jī)氮含量往往較低[3]，從而導(dǎo)致農(nóng)林植物生產(chǎn)力低下，限制了其經(jīng)濟(jì)效益的發(fā)揮。大量含硝態(tài)氮或銨態(tài)氮無機(jī)氮肥的施用，成為維持農(nóng)林土壤肥力的主要手段之一。但盲目、過量施肥往往造成土壤養(yǎng)分失衡、氮素流失等諸多環(huán)境問題[4]。因此，深入挖掘農(nóng)林植物響應(yīng)氮素的關(guān)鍵基因，解析其分子調(diào)控機(jī)制，提高農(nóng)林植物對(duì)氮素吸收同化能力，既可以實(shí)現(xiàn)農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)氮素高效利用的經(jīng)濟(jì)效益，也能實(shí)現(xiàn)減少土壤氮肥施加，保護(hù)生態(tài)環(huán)境的環(huán)保效益。

楊樹（PopulusL.）是我國主要的速生豐產(chǎn)用材林樹種之一[5]。由于楊樹生長迅速、對(duì)養(yǎng)分消耗大，對(duì)氮素有著很強(qiáng)的需求[3]。已有研究表明，不同氮形態(tài)處理，能夠?qū)е滦『跅睿≒.simonii×P.nigra）根系形態(tài)發(fā)生改變，從而影響其對(duì)氮素的吸收同化能力[6]。作者前期研究表明，硝態(tài)氮處理，能夠改變灰楊（Populus × canescens）根尖形態(tài)，并影響根尖不同區(qū)段對(duì)硝態(tài)氮的吸收速率[7]。上述研究均表明，楊樹根尖能夠通過響應(yīng)不同氮形態(tài)，改變其自身形態(tài)特征，從而影響根尖對(duì)不同氮形態(tài)的吸收同化能力[6-8]。

近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序成為研究基因差異表達(dá)的重要手段。利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)楊樹根尖響應(yīng)氮素的研究也取得了顯著成果，但是研究大多集中在氮素虧缺方面[9-10]。例如，通過轉(zhuǎn)錄組重測(cè)序以及生物信息學(xué)分析表明，低氮處理導(dǎo)致灰楊根系中特異表達(dá)的PtaNAC1（NAC-domain protein）上調(diào)表達(dá)，且增加了楊樹根系生物量，并顯著改變了PtaNAC1下游基因的表達(dá)，從而影響楊樹根系形態(tài)結(jié)構(gòu)[9]。Dash 等的研究也表明，低氮處理?xiàng)l件下，在灰楊根系中，PtaHWS（Hawaiian Skirt），PtaNAC1和PtaRAP 2.11（subfamilies of ERF/AP2 TF family）顯著差異表達(dá)，并影響楊樹根系形態(tài)建成[10]。上述研究均通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和生物信息學(xué)方法，對(duì)楊樹根系響應(yīng)低氮脅迫的過程進(jìn)行了研究。而不同氮形態(tài)處理?xiàng)l件下，楊樹根尖存在怎樣的差異表達(dá)模式尚不清楚，值得深入研究。

本研究以灰楊根尖為試材，利用Illumina 測(cè)序平臺(tái)，篩選不同氮形態(tài)處理?xiàng)l件下，楊樹根尖差異表達(dá)基因，并結(jié)合生物信息學(xué)分析，構(gòu)建楊樹根尖對(duì)不同氮形態(tài)響應(yīng)過程的互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，挖掘關(guān)鍵基因。最終，闡明楊樹根尖響應(yīng)硝態(tài)氮或銨態(tài)氮，從而影響根尖生長發(fā)育過程的分子調(diào)控機(jī)制。研究成果為后續(xù)開發(fā)高氮素吸收利用效率的楊樹新種質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

將生根的灰楊組培苗（4 周）轉(zhuǎn)移至水培，隔天換水澆灌改良的LA（Long Ashton）營養(yǎng)液（0.5 mmol·L-1NH4NO3、0.5 mmol·L-1KCl、0.9 mmol·L-1CaCl2、0.3 mmol·L-1MgSO4、0.6 mmol·L-1KH2PO4、42 μmol·L-1K2HPO4、10 μmol·L-1Fe-EDTA、2 μmol·L-1MnSO4、10 μmol·L-1H3BO3、7 μmol·L-1Na2MoO4、0.05 μmol·L-1CoSO4、0.2 μmol·L-1ZnSO4和 0.2 μmol·L-1CuSO4,pH 5.5）。2 周后，選取具有相似高度的48 株植株， 成2 組。分別添加0.5 mmol·L-1硝態(tài)氮（NO3-）和0.5 mmol·L-1銨態(tài)氮（NH4+）代替LA 營養(yǎng)液中的NH4NO3，進(jìn)行水培，培養(yǎng)時(shí)間為10 d[7]。對(duì)根系形態(tài)特征進(jìn)行分析。同時(shí)，收獲根尖0～4 cm樣品，迅速置于液氮中，放于-80℃冰箱備用。將8 株植物的樣本等量混合作為1 個(gè)重復(fù)，每種處理水平3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根尖形態(tài)特征分析 試驗(yàn)苗進(jìn)行不同氮形態(tài)處理10 d 后，對(duì)楊樹根系構(gòu)型進(jìn)行觀察測(cè)量，包括測(cè)量主根長度，以及測(cè)量可見側(cè)根距根尖的距離。每個(gè)處理水平測(cè)量8 株植株，且每種處理水平3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。進(jìn)一步，對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析，利用Statgraphics 軟件，先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05 作為統(tǒng)計(jì)意義上的顯著水平。

1.2.2 不同氮形態(tài)處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)錄組測(cè)序mRNAs 測(cè)序文庫構(gòu)建和測(cè)序按照Illumina 公司提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟執(zhí)行。將上述收獲的2 種不同氮形態(tài)處理?xiàng)l件下的根尖（0～4 cm）樣品，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，分別利用RNA 提取試劑盒提取總RNAs（TRK1001,聯(lián)川生物技術(shù)公司，杭州，中國）。將提取的總RNAs 經(jīng)過DNase I 消化后，富集含有polyA 尾的mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。合成第二鏈cDNA 后，用QIA quick PCR extraction 試劑盒進(jìn)行純化。經(jīng)過回收純化、PCR 富集后，獲得cDNA文庫。將構(gòu)建好的文庫，利用杭州聯(lián)川生物技術(shù)公司IlluminaHiSeqTM4 000 高通量測(cè)序技術(shù)，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析 將測(cè)得的RNAs 序列，使用聯(lián)川生物技術(shù)公司開發(fā)的軟件進(jìn)行分析。首先，將得到的原始序列進(jìn)行去雜質(zhì)處理，包括接頭序列的讀取片段、質(zhì)量值Q ≤ 5 的低質(zhì)量序列讀取片段和未知堿基數(shù)比例＞10%的序列讀取片段。經(jīng)過篩選得到的序列讀取片段使用SOAPaligner/soap2 將測(cè)序結(jié)果比對(duì)到灰楊基因組數(shù)據(jù)庫（http://aspendb.uga.edu/index.php/databases/spta-717-genome）[11]。采用FPKM（Fragments Per Kilobase of exon per Million mapped）對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量[12]?；贔PKM 值，使用Ballgown package計(jì)算mRNAs 的差異表達(dá)水平。利用mRNAs 在硝態(tài)氮處理?xiàng)l件下的FPKM 除以銨態(tài)氮處理?xiàng)l件下FPKM 來計(jì)算基因的差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）。差異表達(dá)mRNAs 篩選閾值為log2（FC）≥1 或≤ -1，且P＜ 0.05。

1.2.4 熒光定量PCR 引物設(shè)計(jì)及合成 以上述提取的不同氮形態(tài)處理?xiàng)顦涓鈽悠窞槟０?，使用Takara 公司PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，作為熒光定量PCR 反應(yīng)的模板。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中選取10 個(gè)差異表達(dá)的基因，根據(jù)灰楊數(shù)據(jù)庫，利用Primer Premier 3.0 軟件設(shè)計(jì)引物，并由上海生工生物工程有限公司合成相關(guān)引物。Actin為RTqPCR 的內(nèi)參基因。序列見表1。使用SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。每個(gè)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)。將qPCR 得到的Ct 值進(jìn)行歸一化，計(jì)算差異表達(dá)基因的相對(duì)表達(dá)量[7]。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primers used for RT-qPCR

1.2.5 差異基因的功能注釋與富集分析 通過Blast2GO 軟件，對(duì)所有差異基因進(jìn)行GO 功能注釋[13]。隨后進(jìn)行GO 顯著性富集分析，以上述得到目的GO 條目（term）為單位，通過P值Bonferroni校正（P＜ 0.05）來定義差異表達(dá)基因中顯著富集的GO term。同時(shí)，結(jié)合生物信息學(xué)KEGG 軟件，分析差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能[14]。同樣以correctedP＜ 0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選在差異表達(dá)基因中顯著富集的代謝途徑。利用MapMan 軟件、Popgenie 數(shù)據(jù)庫（https://popgenie.org/exnet）以及Cytoscape程序，構(gòu)建楊樹根尖響應(yīng)不同氮形態(tài)相關(guān)差異表達(dá)基因的互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系形態(tài)特征分析

在不同氮形態(tài)處理?xiàng)l件下，灰楊根系形態(tài)特征具有顯著差別（圖1）。硝態(tài)氮處理下的主根長度幾乎是銨態(tài)氮處理?xiàng)l件下的一倍，這說明不同氮形態(tài)處理影響楊樹根系生長發(fā)育過程。同時(shí)，在兩種處理水平下，能夠發(fā)揮吸收營養(yǎng)和水分作用的可見側(cè)根發(fā)生的位置相對(duì)一致。因此選取側(cè)根形成前的0～4 cm 根尖部分進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 不同氮形態(tài)處理后，灰楊根系表型Fig.1 Morphological parameters of P. × canescens roots with different nitrogen forms

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

基于上述形態(tài)特征分析的結(jié)果，以不同氮形態(tài)處理?xiàng)顦涓鉃椴牧?，進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果顯示，兩個(gè)處理水平的測(cè)序分別獲得57 001 409 和57 517 359 條有效序列（表2），占各自文庫的比例均超過了99.20%（表2）。兩個(gè)處理水平的測(cè)序數(shù)據(jù)，能夠比對(duì)到灰楊數(shù)據(jù)庫中的堿基數(shù)比例分別為81.59%和82.60%，說明測(cè)序所得序列與灰楊數(shù)據(jù)庫比對(duì)性較好，可以用于后續(xù)分析。

表2 轉(zhuǎn)錄組文庫測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Distribution of RNA-seq in different categories

2.3 不同氮形態(tài)處理?xiàng)l件下，楊樹根尖差異表達(dá)基因分析

在不同氮形態(tài)處理?xiàng)l件下，以銨態(tài)氮處理水平為對(duì)照，在硝態(tài)氮處理?xiàng)l件下，共篩選出2 207 個(gè)差異表達(dá)基因（p＜ 0.05）。相比較于銨態(tài)氮處理，硝態(tài)氮處理有1 414 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，793 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。有32 個(gè)基因顯著差異表達(dá)（p＜ 0.001），見圖2a。其中，Potri.013G102100基因差異變化最顯著，log2（FC）為-6.56，該基因注釋為II 型過氧化物酶（peroxiredoxin type 2）；Potri.004G138100基因上調(diào)倍數(shù)最顯著，log2（FC）為6.18，然而該基因尚未被注釋，功能未知。同時(shí)，篩選出71 個(gè)與植物生長發(fā)育相關(guān)的差異表達(dá)基因。其中，轉(zhuǎn)錄因子作為一大類調(diào)控基因，在楊樹根尖通過響應(yīng)不同氮形態(tài)而參與其生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。例如，NFYA（nuclear transcription factor Y subunit alpha）、GRF（growthregulating factor）和ARF（auxin response factor）類轉(zhuǎn)錄因子，它們均能夠通過調(diào)控硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)體NRT（nitrate transporters）基因的表達(dá)響應(yīng)不同氮形態(tài)，從而調(diào)節(jié)植物根系生長發(fā)育過程[16-17]。進(jìn)一步，挑選了10 個(gè)顯著差異表達(dá)基因，利用RTqPCR 進(jìn)一步證實(shí)了測(cè)序結(jié)果的可靠性（圖2b）。

圖2 不同氮形態(tài)處理?xiàng)l件下，楊樹根尖顯著差異表達(dá)的基因Fig.2 Significantly differentially expressed mRNAs in root tips of P. × canescens under different nitrogen form treatments

2.4 不同氮形態(tài)處理?xiàng)l件下，灰楊根尖差異表達(dá)基因的GO 功能劃分

為進(jìn)一步了解差異表達(dá)基因的功能，將差異表達(dá)基因映射GO 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)序列同源性，將不同氮形態(tài)處理?xiàng)l件下，2 207 個(gè)差異表達(dá)基因分為3 大類總共50 個(gè)功能組，包括生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）（圖3）。結(jié)果顯示，生物學(xué)過程主要集中在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、刺激反應(yīng)和代謝過程。在細(xì)胞組分類別中，差異基因被注釋到最多的亞類依次為細(xì)胞核、質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)部分。在分子功能中，注釋為ATP 結(jié)合和蛋白結(jié)合的差異基因最多，其次為轉(zhuǎn)錄因子活性和DNA 結(jié)合。以上注釋較多的過程所涉及到的差異基因，可能參與楊樹根尖對(duì)不同氮形態(tài)的響應(yīng)，從而影響根尖生長發(fā)育過程。進(jìn)一步挖掘這些基因的功能，研究其響應(yīng)不同氮形態(tài)的作用機(jī)制，將有助于為培育高氮素吸收利用效率的楊樹新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

圖3 不同氮形態(tài)處理?xiàng)l件下，灰楊根尖差異表達(dá)基因的GO 功能聚類注釋Fig.3 Gene Ontology classification annotation of differentially expressed genes in root tips of P. × canescens under different nitrogen form treatments

2.5 不同氮形態(tài)處理?xiàng)l件下，灰楊根尖差異表達(dá)基因的KEGG 分析

為進(jìn)一步了解上述差異表達(dá)基因的功能，對(duì)識(shí)別出的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 通路分析。共獲得1 192 個(gè)差異表達(dá)基因，涉及到20 條KEGG 通路（圖4）。其中，有9 條與代謝相關(guān)，并且大多與氮代謝和氨基酸代謝相關(guān)，有4 條與生物合成相關(guān)。KEGG 分析從功能的角度鎖定基因，直觀的顯示了楊樹根尖響應(yīng)不同氮形態(tài)差異基因的代謝過程，有助于更好地研究楊樹根尖響應(yīng)不同氮形態(tài)的分子機(jī)制。

圖4 KEGG 通路分析鑒定差異表達(dá)基因Fig.4 KEGG pathway analysis of significantly differentially expressed target genes

2.6 與氮代謝相關(guān)差異表達(dá)基因的MapMan分析

利用MapMan 軟件，篩選出36 個(gè)與氮代謝通路過程、各類氨基酸的生物合成以及代謝過程相關(guān)的差異表達(dá)基因（表3）。其中，有8 個(gè)基因參與到氮代謝過程，26 個(gè)基因參與到氨基酸代謝與合成過程，還有2 個(gè)基因參與到硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)過程。已有研究表明，硝態(tài)氮處理能夠改變NRTs 的表達(dá)水平，進(jìn)一步影響植物根尖生長發(fā)育過程[18-19]。

表3 氮代謝相關(guān)差異表達(dá)基因Table 3 Differentially expressed genes related to nitrogen metabolism

2.7 不同氮形態(tài)處理?xiàng)l件下，灰楊根尖差異表達(dá)基因的互作網(wǎng)絡(luò)分析

為了進(jìn)一步研究這些基因的功能，利用Popgenie數(shù)據(jù)庫以及Cytoscape 程序，構(gòu)建了灰楊根尖對(duì)不同氮形態(tài)響應(yīng)過程的互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在基因作用網(wǎng)絡(luò)中，檢測(cè)到一組相互作用的與氮代謝過程相關(guān)的基因簇，共包含13 個(gè)基因（圖5）。其中，硝酸還原酶（Potri.005G172400）基因作為硝態(tài)氮同化過程中的關(guān)鍵酶，占據(jù)了網(wǎng)絡(luò)的核心位置。已有研究表明，硝酸還原酶作為植物氮素同化的關(guān)鍵酶之一，能夠調(diào)控根系生長素水平，從而影響根尖生長發(fā)育過程[20-21]。進(jìn)一步，挑選了調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中7 個(gè)顯著差異表達(dá)基因，選取不同氮形態(tài)處理10 天的灰楊根尖材料進(jìn)行RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：這7 個(gè)基因在RT-qPCR 的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析的趨勢(shì)一致（圖6）。

圖5 不同氮形態(tài)處理?xiàng)l件下，灰楊根尖差異表達(dá)基因的互作網(wǎng)絡(luò)Fig.5 The interaction network of differentially expressed genes in root tips of P. × canescens under different nitrogen forms treatments

圖6 不同氮形態(tài)處理?xiàng)l件下，灰楊根尖差異基因表達(dá)分析Fig.6 Validation of significantly differentially expressed genes under different nitrogen forms treatments by sRNA-seq and RT-qPCR

3 討論

氮素是植物生長發(fā)育所必需的大量礦質(zhì)營養(yǎng)元素之一，是蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素等重要物質(zhì)的組成成分[22]。土壤中的氮素都需要在適宜的溫度、水分和通氣條件下，在土壤微生物和酶的作用下，將其水解或氧化為硝態(tài)氮或銨態(tài)氮，才能夠被植物根系直接吸收利用[23-24]。而土壤中的不同氮形態(tài)可能導(dǎo)致楊樹根尖氮代謝相關(guān)基因表達(dá)模式發(fā)生改變，從而影響植物根尖生長和發(fā)育過程[25]。本研究在不同氮形態(tài)處理10 d 后，對(duì)楊樹根尖進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，硝態(tài)氮處理下的主根長度幾乎是銨態(tài)氮處理?xiàng)l件下的一倍。類似的現(xiàn)象在小黑楊根系中（P.simonii×P.nigra）也有報(bào)道[6]。為了進(jìn)一步了解木本植物根尖對(duì)不同氮形態(tài)響應(yīng)的過程，本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，對(duì)不同氮形態(tài)處理?xiàng)l件下，楊樹根尖差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析。

在不同氮形態(tài)處理10 d 后，經(jīng)過高通量測(cè)序分析，獲得了2 207 個(gè)差異表達(dá)基因。其中，Potri.013G102100基因編碼一個(gè)II 型過氧化物酶（peroxiredoxin type 2），其下調(diào)倍數(shù)最為顯著，前人研究表明，II 型過氧化物酶是植物中分布最廣的一類非典型2-半胱氨酸過氧化物酶（2-Cysteine Peroxiredoxin），其在對(duì)抗氧化能力和共生固氮中發(fā)揮著重要作用[26]。另有研究表明，2-半胱氨酸過氧化物酶可以與氮同化過程中亞硝酸還原酶（nitrite reductase）和谷氨酸合成酶（glutamate synthase）相互作用，從而影響氮代謝過程[27]。Potri.004G138100基因上調(diào)倍數(shù)最顯著，但該基因功能未知，推測(cè)其可能參與楊樹根尖對(duì)不同氮形態(tài)的響應(yīng)，從而影響楊樹根尖生長發(fā)育過程。同時(shí)，在本實(shí)驗(yàn)中，部分差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子通過響應(yīng)不同氮形態(tài)，影響楊樹根尖生長發(fā)育過程，這與在草本植物中的研究結(jié)果相似[6,8,28]。例如，在水稻（Oryza sativaL.）和小麥（Triticum aestivum）中，過表達(dá)NFYAs 能夠調(diào)控NRTs的表達(dá)[18,29]。同時(shí)，增加了轉(zhuǎn)基因小麥根尖對(duì)硝態(tài)氮的吸收，促進(jìn)了側(cè)根生長[18]。在本研究中，相比較于銨態(tài)氮處理，硝態(tài)氮處理導(dǎo)致灰楊根尖PcNFYA7（Potri.011G 101000）下調(diào)表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)楊樹主根伸長。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）根中柱鞘細(xì)胞中，5mM 硝態(tài)氮可以促進(jìn)ARF6/8的表達(dá)水平，促進(jìn)了擬南芥?zhèn)雀鹗己碗S后萌發(fā)的過程[17,30]。在本研究中，相比較于銨態(tài)氮處理，硝態(tài)氮處理導(dǎo)致灰楊根尖中PcARF8/16（Potri.004G078200和Potri.010G223200）上調(diào)表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)了主根伸長。上述研究表明，灰楊根尖部分差異表達(dá)的基因，能夠通過響應(yīng)不同氮形態(tài)而參與調(diào)控根尖生長發(fā)育過程。

對(duì)差異基因進(jìn)行GO 和KEGG 通路分析。結(jié)果表明，一些差異表達(dá)基因參與氮代謝和氨基酸代謝途徑。例如，氮代謝、色氨酸代謝、丙酮酸代謝和氨基甲酸代謝途徑等。同時(shí)，利用MapMan篩選出36 個(gè)氮代謝相關(guān)差異表達(dá)基因。其中，值得關(guān)注的是兩個(gè)硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)體基因PcNRT1.5（Potri.014G179400和Potri.003G088800）。相比較于銨態(tài)氮處理，硝態(tài)氮處理導(dǎo)致灰楊根尖中PcNRT1.5顯著下調(diào)表達(dá)。在擬南芥中，AtNRT1.1作為第一個(gè)被鑒定出的NRT 在根中有轉(zhuǎn)運(yùn)和感應(yīng)硝態(tài)氮兩個(gè)作用[31]。同時(shí)，在小麥和水稻中，硝態(tài)氮處理均能改變NRT 基因的表達(dá)水平，從而影響植物根尖生長發(fā)育過程[18-19]。該結(jié)果說明PcNRT1.5在楊樹根尖響應(yīng)不同氮形態(tài)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。進(jìn)一步，通過Popgenie 數(shù)據(jù)庫以及Cytoscape程序，構(gòu)建了灰楊根尖響應(yīng)不同氮形態(tài)的互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在基因作用網(wǎng)絡(luò)中，硝酸還原酶（Potri.005G 172400）作為硝態(tài)氮同化過程中第一步的關(guān)鍵酶，在楊樹根尖對(duì)不同氮形態(tài)響應(yīng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。這與在草本植物中的研究結(jié)果類似[20]。在擬南芥根中，硝酸還原酶作為氮素同化和根系構(gòu)型重塑的關(guān)鍵酶之一，能夠調(diào)控根系生長素水平，從而影響根尖生長發(fā)育過程[20]。同時(shí)，在水稻中，硝酸還原酶生成的一氧化氮，通過誘導(dǎo)水稻側(cè)根形成和無機(jī)氮的吸收，提高水稻對(duì)氮的吸收能力[21]。而楊樹作為多年生木本植物，其根系比淺根系草本植物發(fā)達(dá)得多，且構(gòu)型更為復(fù)雜[9]。同時(shí)，木本植物往往遭受季節(jié)性、物候性土壤氮素反復(fù)變化，面臨的土壤氮素環(huán)境復(fù)雜程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于草本植物[4,32-33]。因此，楊樹根系中硝酸還原酶可能存在著更為復(fù)雜的氮適應(yīng)性變化的作用機(jī)制，值得深入研究。同時(shí)，通過基因互作網(wǎng)絡(luò)的分析，可以逐步了解參與互作網(wǎng)絡(luò)的基因在響應(yīng)不同氮形態(tài)過程中的作用，其相互作用關(guān)系也有待進(jìn)一步確認(rèn)。

4 結(jié)論

本研究在不同氮形態(tài)處理10 d 后，對(duì)楊樹根尖進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，硝態(tài)氮處理下的主根長度幾乎是銨態(tài)氮處理?xiàng)l件下的一倍。同時(shí)，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選出2 207 個(gè)差異表達(dá)基因。通過GO 功能和KEGG 通路分析，理清了差異表達(dá)基因富集的分子功能與代謝通路。利用MapMan篩選出36 個(gè)氮代謝相關(guān)差異表達(dá)基因，并構(gòu)建了這些基因的互作網(wǎng)絡(luò)，得到了關(guān)鍵基因。綜上所述，本研究為挖掘和尋找楊樹根尖響應(yīng)不同氮形態(tài)關(guān)鍵調(diào)控基因提供了參考，并闡述了這些關(guān)鍵基因可能通過響應(yīng)不同氮形態(tài)，影響楊樹根尖生長發(fā)育過程，這為進(jìn)一步培育出高效吸收利用氮素的楊樹新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。