王晨驍，王 斌，馮 航，吳 克，王 娟，楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica)原名溶血性巴氏桿菌，舊歸于巴氏桿菌屬，后單獨建立曼氏桿菌屬。本屬成員均發(fā)酵甘露醇，不發(fā)酵甘露糖，可與巴氏桿菌屬細菌進行鑒別[1]。該菌為革蘭氏陰性球桿菌，無芽孢，有莢膜和菌毛，共12個血清型，其中A1和A6是感染牛的主要血清型[2]，可致奶牛急性敗血癥和肺炎，致死率達25%～50%[3]，近年血清型A5及A7的患病率有所增加[4]。A2型是從綿羊分離到的該菌代表株[1]，與血清型A6同為感染羊的重要血清型，A1血清型的檢出頻率較低[5]。溶血性曼氏桿菌感染羊后引發(fā)羔羊呼吸道癥狀和死亡，在長途運輸、氣候突變等應(yīng)激因素下更易發(fā)病[6]，當(dāng)羊受到副流感病毒和支原體等病原感染時也常繼發(fā)溶血性曼氏桿菌病[7]。溶血性曼氏桿菌也可導(dǎo)致嚴重的乳腺炎及乳房壞死，且尚無有效的預(yù)防手段[8]。本研究用死亡羔羊肺臟組織進行細菌分離培養(yǎng)，獲得1株溶血性曼氏桿菌，并對分離菌進行病原學(xué)研究、小鼠致病性分析和藥敏試驗，為羊溶血性曼氏桿菌病的實驗室診斷和臨床防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 病死羔羊來自陜西省富平縣某養(yǎng)殖場，病死羔羊剖檢后可見胸腔黏連，肺臟表面彌漫化膿灶，其余組織器官未見異常，無菌采集病變肺組織進行實驗室診斷。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺，濟南鑫貝西生物科技有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；生物顯微鏡，重慶重光實業(yè)有限公司；離心機，上海川翔生物科技有限公司；基因擴增儀，杭州博日科技有限公司；全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.1.3 主要試劑 營養(yǎng)瓊脂及腦心浸出液肉湯(BHI)，青島海博生物技術(shù)有限公司；綿羊血采自實驗動物中心健康綿羊；細菌革蘭氏染液，北京索萊寶科技有限公司；細菌生化鑒定管，杭州濱河微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，天根生化科技有限公司；DNA Marker及PCR Mix，Gen Star公司；50×TAE及瓊脂糖，廣州賽國生物科技有限公司；18種常用獸藥藥敏紙片由實驗室根據(jù)歐盟藥敏試驗標準(EUCAST 2017)自行制作并保存；引物合成與測序由西安擎科澤西生物科技有限公司完成。

1.1.4 實驗動物 5周齡SPF昆明系雌鼠共10只，購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng)及純化 在超凈工作臺中用采集的肺臟組織涂片接種于50 mL/L綿羊鮮血瓊脂平板，分別放置于恒溫培養(yǎng)箱和厭氧培養(yǎng)箱中36℃±1℃培養(yǎng)24 h，同時制備組織涂片染色鏡檢。血平板培養(yǎng)24 h后，挑取平板上單菌落再次接種血瓊脂平板，36℃±1℃培養(yǎng)24 h，得到純化細菌并進行染色鏡檢。

1.2.2 生化試驗 用接種針挑取已純化菌落接種于生化鑒定培養(yǎng)基內(nèi)，按照生化鑒定管說明書操作，36℃±1℃恒溫靜置培養(yǎng)，24 h～48 h內(nèi)觀察結(jié)果。

1.2.3 細菌16S rRNA擴增與遺傳進化分析 以分離菌的DNA為模板，引物為16S rRNA擴增通用引物27 F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492 R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，反應(yīng)體系為20 μL，PCR反應(yīng)程序為：94℃ 10 min；94℃ 30 s,62℃ 30 s,72℃ 1 min，共40個循環(huán)；72℃ 10 min。吸取PCR產(chǎn)物6 μL進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，剩余產(chǎn)物送西安擎科澤西生物科技有限公司測序。獲得產(chǎn)物序列后，登錄NCBI網(wǎng)站進行比對，獲得分離菌鑒定信息，同時用MEGA 7軟件對分離菌的16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進行遺傳進化分析。

1.2.4 血清型鑒定 參考文獻[9],用溶血性曼氏桿菌莢膜1、2和6型血清型的多重PCR方法進行擴增，目的基因分別為Hyp、Core2和TupA，引物信息見表1。反應(yīng)總體系為50 μL，2×TaqPCR Mix 25 μL，dd H2O 15 μL，3對引物上、下游各1 μL，DNA模板4 μL。PCR反應(yīng)程序為:94℃ 10 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小。

表1 溶血性曼氏桿菌莢膜血清型引物序列Table 1 Primer sequences of Mannheimia haemolytica capsular serotype

1.2.5 藥敏試驗 按照歐盟藥敏試驗標準規(guī)定的紙片擴散法(2017版)對分離菌進行藥敏試驗，將純化后的菌落接種于BHI肉湯中于恒溫搖床36℃±1℃振蕩培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌液濃度至0.5麥氏值，吸取50 μL菌液均勻涂布于表面干燥的MH-50 mL/L血清瓊脂，貼附藥敏片置于培養(yǎng)箱中36℃±1℃培養(yǎng)12 h后觀察結(jié)果。

1.2.6 小鼠致病性試驗 使用無菌生理鹽水將菌液稀釋至108CFU/mL，試驗組小鼠(n=5)每只腹腔注射200 μL菌液，對照組小鼠(n=5)每只腹腔注射200 μL無菌生理鹽水，連續(xù)觀察小鼠，死亡小鼠進行解剖觀察，并進行細菌分離鑒定。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離純化結(jié)果

培養(yǎng)24 h后，厭氧培養(yǎng)平板無菌生長，恒溫培養(yǎng)的血瓊脂平板上可見有β溶血環(huán)的單一圓形灰白色、半透明、表面光滑的露珠樣菌落，挑取單菌落革蘭氏染色鏡檢可見兩極著色的紅色球桿菌，散在或聚集存在；堿性美藍染色鏡檢可見兩極濃染菌體(圖1)。

a.50 mL/L綿羊血平板上菌落形態(tài)；b.革蘭氏染色鏡檢(1 000×)；c.堿性美藍染色鏡檢(1 000×)a.Colony morphology on 50 mL/L sheep blood plate;b.Gram staining;c.Alkaline methylene blue staining圖1 分離菌菌落形態(tài)與染色鏡檢結(jié)果 Fig.1 Colony morphology and staining microscopic examination results of isolated bacteria

2.2 生化鑒定結(jié)果

根據(jù)細菌生化鑒定管結(jié)果判定說明書，判定記錄分離菌的生化試驗結(jié)果(表2)。將生化試驗結(jié)果與《伯杰細菌鑒定手冊》比對，結(jié)合菌落特征，初步懷疑分離菌為溶血性曼氏桿菌。

表2 分離菌生化試驗結(jié)果Table 2 Biochemical identification results of isolates

2.3 分離株16S rRNA擴增結(jié)果及遺傳進化分析

凝膠電泳結(jié)果顯示分離株出現(xiàn)一約為1 300 bp的條帶，與預(yù)期相符(圖2)。剩余產(chǎn)物經(jīng)16S rRNA測序和序列比對顯示，分離菌與溶血性曼氏桿菌高度相似。16S rRNA序列進化樹(圖3)，顯示分離株與2015年美國分離到的一株羊源溶血性曼氏桿菌(KX278422.1)遺傳進化關(guān)系最近[10]，進一步說明分離株為溶血性曼氏桿菌。

2.4 血清分型鑒定結(jié)果

以分離的溶血性曼氏桿菌DNA為模板，進行莢膜血清型1、2和6的三重PCR擴增鑒定，凝膠電泳結(jié)果顯示樣品擴增處有大小約106 bp的條帶(圖4)，測序分析和序列比對表明所分離的溶血性曼氏桿菌為血清2型。

M.DNA標準DL 2 000;1.分離株;2.陽性對照;3.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000;1.Isolated strain;2.Positive control;3.Negative control圖2 分離株16S rRNA PCR擴增結(jié)果Fig.2 16S rRNA PCR amplification results of isolated strain

FL為本次試驗分離株,FL is the strain isolated in this test圖3 溶血性曼氏桿菌16S rRNA基因進化樹分析Fig.3 Analysis of 16S rRNA gene phylogenetic tree of Mannheimia haemolytica

2.5 藥敏試驗結(jié)果

根據(jù)美國臨床實驗室標準化委員會頒布的《抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準》判定藥敏試驗結(jié)果，結(jié)果顯示分離株對青霉素、新霉素、安普霉素、替米考星、泰樂菌素、泰萬菌素耐藥；對氨芐西林、慶大霉素中介；對阿莫西林、頭孢噻呋鈉、鏈霉素、氟苯尼考、多西環(huán)素、金霉素、土霉素、恩諾沙星、復(fù)方磺胺、泰妙菌素敏感(表3)。

表3 分離的溶血性曼氏桿菌藥敏試驗結(jié)果Table 3 Results of antibacterial susceptibility test of Mannheimia haemolytica

2.6 小鼠致病性試驗結(jié)果

試驗組小鼠18 h內(nèi)全部死亡，剖檢死亡小鼠可見肺臟與胸腔粘連，肺臟充血腫脹，表面有膿性黏液，從死亡小鼠肺臟組織中均再次分離到溶血性曼氏桿菌。對照組小鼠于試驗后18 h剖檢，各組織器官未見異常，從肺臟組織中未分離到溶血性曼氏桿菌。

M.DNA標準DL 2 000 ;1.分離株;2.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000;1.Isolated strain;2.Negative control圖4 分離的溶血性曼氏桿菌血清型多重PCR鑒定結(jié)果Fig.4 The results of multiplex PCR identification of the serotype of Mannheimia haemolytica

3 討論

從病死羔羊肺臟組織中成功分離到一株溶血性曼氏桿菌，血瓊脂平板上生長良好，菌落形態(tài)大小及染色鏡檢都與溶血性曼氏桿菌相符，生化鑒定結(jié)果與文獻報道基本一致，但甘露糖生化鑒定結(jié)果為陰性，與文獻[9，11]分離到的羊源溶血性曼氏桿菌甘露糖生化鑒定結(jié)果不一致，除可能由于海拔原因?qū)е录毦哪承┥匦园l(fā)生改變外，也可能與氣候及飼養(yǎng)方式有關(guān)，不同飼喂條件下動物體內(nèi)菌群的差異也有可能是影響同種細菌出現(xiàn)不一樣生化特性的原因之一[12]。由此推測，不同地區(qū)、不同品種來源的羊源溶血性曼氏桿菌甘露糖發(fā)酵試驗結(jié)果可能不一致。

藥敏試驗以生產(chǎn)中常用的18種抗生素進行藥敏試驗，試驗結(jié)果與相關(guān)報道基本一致，分離菌對青霉素及鏈霉素耐藥或敏感性不強[13]，可能由于兩者的普遍性高頻使用導(dǎo)致溶血性曼氏桿菌對這該兩種抗生素的耐藥性增強，對阿莫西林、頭孢噻呋、氟苯尼考、金霉素及恩諾沙星等藥物敏感性較高，可為今后針對該病的臨床用藥提供指導(dǎo)。