楚瑞雪,孫先桃,王 惠

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院,河南省兒童醫(yī)院,鄭州兒童醫(yī)院眼科,鄭州 450000)

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity,ROP)是發(fā)生在早產(chǎn)兒、低出生質(zhì)量?jī)旱囊暰W(wǎng)膜血管異常增生疾病,現(xiàn)已成為兒童致盲和視力損傷的主要原因[1]。目前治療ROP的主要方法包括抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、激光術(shù)、冷凝術(shù)等,但治療后部分患兒仍出現(xiàn)視覺(jué)異常甚至失明現(xiàn)象[2],因此,探求更有效的治療方法是臨床上ROP治療關(guān)鍵。隨著研究深入,發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨梢杂绊懸暰W(wǎng)膜新生血管的形成,且炎癥能夠激活小膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨痆3-4],推測(cè)炎癥可能是ROP形成的原因之一。柚皮素(naringenin,NAR)作為抗炎、抗氧化的黃酮類化合物,能夠通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化從而緩解小鼠記憶功能[5],但其在ROP中的作用機(jī)制尚未發(fā)現(xiàn)研究。微小RNA(microRNA,miR)-223在單核/巨噬細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞分化、破骨細(xì)胞形成等方面發(fā)揮重要作用,研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-223后可以抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein3,NLRP3)炎癥體表達(dá),進(jìn)而可以改善脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度活化現(xiàn)象[6],推測(cè)NAR亦可能通過(guò)miR-223/NLRP3軸發(fā)揮作用。因此,本文建立氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen induced retinopathy,OIR)模型,通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察NAR對(duì)OIR的影響,并初步探討其作用機(jī)制,為臨床上ROP的治療提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只健康成年SPF級(jí)C57BL/6J小鼠(雌性:雄性=2∶1),8周齡,體重(23±2)g,均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所[SCXK(滇)K2019-0002]。小鼠均在鄭州大學(xué)(藥物研究院)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)[SYXK(豫)2018-0004],飼養(yǎng)條件:單個(gè)分籠飼養(yǎng),均在溫度(25.0±0.5)℃、濕度(45±5)%、12 h光照12h黑暗條件下自由飲食攝水,并保持飼養(yǎng)環(huán)境透氣、干凈。20只雌性小鼠和10只雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,按雌雄2∶1合籠交配,雌性小鼠懷孕后取出單獨(dú)飼養(yǎng),并足日齡產(chǎn)下幼鼠,其中150只幼鼠母乳喂養(yǎng)至7日齡(postnatal7,P7),進(jìn)行隨機(jī)分組,開(kāi)始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合3R原則,經(jīng)本院動(dòng)物倫理審查委員會(huì)審查(IACUC:2020090123),符合動(dòng)物倫理。

1.2 主要試劑與儀器

羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose,CMC)(伊士曼,執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn):GB/T5005-2001);NAR(美國(guó)Sigma公司,批號(hào):192025,純度≥95%);miR-223拮抗劑陰性對(duì)照、miR-223拮抗劑均購(gòu)自廣州銳博生物科技公司;miRNA提取分離試劑盒、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TIANGEN,批號(hào)分別為:20201006、20201205);熒光素鈉注射液(廣州白云山明興制藥有限公司,批號(hào):20190206);一抗小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物鈣離子結(jié)合蛋白-1(ionized calcium binding adapter-1,Iba-1)、NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18,Alexa Fluor?488標(biāo)記的熒光二抗(英國(guó)abcam公司,批號(hào)分別為:12-NOV-2019、05-DEC-2020、26-JAN-2020、08-Nov-2019、02-NOV-2020、09-FEB-2020)。眼底熒光造影儀(上海伊沐醫(yī)療器械有限公司,型號(hào):SK-650B);實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time quantitative PCR,RT-qPCR)儀(美國(guó)ABI公司,型號(hào):StepOnePlus);蛋白凝膠成像儀(賽默飛世爾,型號(hào):iBright CL750)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物建模與分組

實(shí)驗(yàn)前所有幼鼠均用眼科裂隙燈觀察眼部,均未發(fā)現(xiàn)異常。150只幼鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為常氧組、OIR組、NAR組、NAR+陰性對(duì)照組、NAR+miR-223拮抗劑組,每組30只。除常氧組外,其余各組參考文獻(xiàn)[7],幼鼠及其母鼠在P7～P12移至封閉氧箱中,氧氣體積分?jǐn)?shù)(75±2)%,連續(xù)5d,P12返回正常氧環(huán)境中。常氧組在正常氧環(huán)境中常規(guī)飼養(yǎng)。

250mg CMC溶于ddH2O中,定容至100mL過(guò)夜。1.0g NAR溶于含CMC的溶劑中,定容100 mL,配置成10mg/mL溶液備用。NAR組幼鼠腹腔注射100mg/(kg·d)NAR,NAR+陰性對(duì)照組在NAR基礎(chǔ)上P12尾靜脈注射2.5mg/kg miR-223拮抗劑陰性對(duì)照,NAR+miR-223拮抗劑組在NAR基礎(chǔ)上P12尾靜脈注射2.5mg/kg miR-223拮抗劑,常氧組、OIR組每天腹腔注射等體積CMC、P12尾靜脈注射等體積生理鹽水。P17檢測(cè)幼鼠各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2 RT-qRCR檢測(cè)視網(wǎng)膜中miR-223水平

每組隨機(jī)取10只,小心取下視網(wǎng)膜,置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?miRNA提取試劑盒提取miRNA,非變性凝膠電泳檢測(cè)提取質(zhì)量,miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。miR-223上游引物:5’-GGTGGTGAATACCCTCCTG-3’,下游引物:5’-GTCTGTCCGTGGTGCTGA-3’;U6上游引物:5’-AAGACGGGCGGAGAGAAACC-3’,下游引物:5’-CGTTGACTCCGACCTTCACC-3’。RT-qPCR儀檢測(cè)miR-223水平。20μL反應(yīng)體系:50ng/μL cDNA1μL,10μmol/L上游引物/下游引物0.5μL/0.5μL,2×Hi SYBR Green QPCR Mix10μL,ddH2O 8.0μL。反應(yīng)條件:95℃、5min;94℃、50s,59℃、30s,40個(gè)循環(huán),72℃、10min。2-ΔΔCT法計(jì)算miR-223水平。

1.3.3 熒光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)檢查

每組隨機(jī)取10只,幼鼠散瞳、2mL/kg10%熒光素鈉注射液腹腔注射,待熒光素鈉循環(huán)至眼底時(shí),眼底熒光造影儀以視盤和激光光凝為中心對(duì)幼鼠行FFA檢查。

1.3.4 HE染色觀察視網(wǎng)膜形態(tài)

每組取剩余10只,處死后取眼球,置于4%多聚甲醛中固定。左眼球石蠟包埋后平行眼軸方向連續(xù)切片(切片厚度5μm),切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、蘇木精染色、1%鹽酸乙醇分色后,伊紅染色,再經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明,封片觀察。

1.3.5 免疫熒光檢測(cè)視網(wǎng)膜中Iba-1表達(dá)情況

4%多聚甲醛中固定的右眼球在4℃經(jīng)20%和30%蔗糖溶液脫水,冰凍切片機(jī)平行眼軸方向連續(xù)切片(切片厚度6μm),切片經(jīng)0.3% Trition處理30min,加入山羊血清37℃封閉1h,隨后加入一抗Iba-1(1∶1000),第2天洗去一抗滴加熒光二抗(1∶500)室溫孵育1h,統(tǒng)計(jì)單位面積Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.3.6 Western blot檢測(cè)視網(wǎng)膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β及IL-18蛋白表達(dá)情況

-80℃中取出視網(wǎng)膜,加100μL組織勻漿液勻漿,10000r/min4℃離心20min,上清(即為總蛋白)置于新的離心管中,每孔上樣20μg,凝膠電泳分離蛋白,PVDF膜轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2h,PBST清洗后分別添加一抗NLRP3(1∶1000)、Caspase-1(1∶1000)、IL-1β(1∶500)、IL-18(1∶500),4℃孵育過(guò)夜;PBST清洗后加入對(duì)應(yīng)二抗,室溫孵育1h。DAB顯色試劑盒避光顯色,蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)描述,多組間比較用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q法。P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NAR對(duì)視網(wǎng)膜中miR-223水平的影響

與常氧組相比,OIR組視網(wǎng)膜中miR-223水平降低(P＜0.05);與OIR組相比,NAR組、NAR+陰性對(duì)照組視網(wǎng)膜中miR-223水平升高(P＜0.05);分別與NAR組、NAR+陰性對(duì)照組相比,NAR+miR-223拮抗劑組視網(wǎng)膜中miR-223水平降低(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 NAR對(duì)FFA的影響

常氧組熒光分布均勻;OIR組出現(xiàn)血管破裂(黑色箭頭),熒光漏在視網(wǎng)膜中,視網(wǎng)膜泛白,血管出現(xiàn)收縮;NAR組、NAR+陰性對(duì)照組血管破裂現(xiàn)象緩解,視網(wǎng)膜泛白現(xiàn)象減輕;NAR+miR-223拮抗劑組血管破裂,熒光漏在視網(wǎng)膜中,視網(wǎng)膜泛白明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 5組幼鼠FFA情況Figure1 FFA situation of the young mice of5groups

2.3 NAR對(duì)視網(wǎng)膜形態(tài)的影響

常氧組各層次細(xì)胞排列整齊且緊密;OIR組視網(wǎng)膜厚度變厚、細(xì)胞排列松散,部分出現(xiàn)細(xì)胞缺失現(xiàn)象、血管新生現(xiàn)象(黑色箭頭);NAR組、NAR+陰性對(duì)照組視網(wǎng)膜變厚、細(xì)胞松散現(xiàn)象存在,未見(jiàn)新生血管;NAR+miR-223拮抗劑組細(xì)胞松散嚴(yán)重、細(xì)胞缺失明顯。見(jiàn)圖2。

圖2 5組幼鼠視網(wǎng)膜形態(tài)情況(HE染色)Figure2 Morphology of retina in the young mice of5groups(HE staining)

2.4 NAR對(duì)視網(wǎng)膜中Iba-1表達(dá)的影響

與常氧組相比,OIR組視網(wǎng)膜中Iba-1水平升高(P＜0.05);與OIR組相比,NAR組、NAR+陰性對(duì)照組視網(wǎng)膜中Iba-1水平降低(P＜0.05);分別與NAR組、NAR+陰性對(duì)照組相比,NAR+miR-223拮抗劑組視網(wǎng)膜中Iba-1水平升高(P＜0.05)。見(jiàn)圖3、表1。

圖3 5組幼鼠視網(wǎng)膜中Iba-1表達(dá)情況(免疫熒光)Figure3 Iba-1expression in the retina of the young mice of5groups(immunofluorescence)

表1 5組視網(wǎng)膜中miR-223水平及Iba-1表達(dá)比較(±s,n=10)Table1 Comparison of miR-223levels and Iba-1in the retinas of the5groups

表1 5組視網(wǎng)膜中miR-223水平及Iba-1表達(dá)比較(±s,n=10)Table1 Comparison of miR-223levels and Iba-1in the retinas of the5groups

注:與常氧組相比,#P＜0.05;與OIR組相比,?P＜0.05;與NAR組相比,△P＜0.05;與NAR+陰性對(duì)照組相比,▲P＜0.05。Note.Compared with normal oxygen group,#P＜0.05.Compared with OIR group,?P＜0.05.Compared with NAR group,△P＜0.05.Compared with NAR+negative control group,▲P＜0.05.

組別Groups miR-223 Iba-1(cells/mm2)常氧組Normal oxygen group 1.01±0.12 15.35±2.71 OIR組OIR group 0.38±0.05# 83.43±11.75#NAR組NAR group 0.74±0.07? 28.56±3.16?NAR+陰性對(duì)照組NAR+negative control group 0.75±0.06? 30.15±4.48?NAR+miR-223拮抗劑組NAR+miR-223antagomir group 0.26±0.03△▲ 76.18±8.15△▲

2.5 NAR對(duì)視網(wǎng)膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)的影響

與常氧組相比,OIR組視網(wǎng)膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白水平升高(P＜0.05);與OIR組相比,NAR組、NAR+陰性對(duì)照組視網(wǎng)膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白水平降低(P＜0.05);分別與NAR組、NAR+陰性對(duì)照組相比,NAR+miR-223拮抗劑組視網(wǎng)膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白水平升高(P＜0.05)。見(jiàn)圖4、表2。

表2 5組幼鼠視網(wǎng)膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)比較(±s,n=10)Table2 Comparison of NLRP3,Caspase-1,IL-1β and IL-18protein expression in the retina of young mice in the5groups

表2 5組幼鼠視網(wǎng)膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)比較(±s,n=10)Table2 Comparison of NLRP3,Caspase-1,IL-1β and IL-18protein expression in the retina of young mice in the5groups

注:與常氧組相比,#P＜0.05;與OIR組相比,?P＜0.05;與NAR組相比,△P＜0.05;與NAR+陰性對(duì)照組相比,▲P＜0.05。Note.Compared with normal oxygen group,#P＜0.05.Compared with OIR group,?P＜0.05.Compared with NAR group,△P＜0.05.Compared with NAR+negative control group,▲P＜0.05.

組別Groups NLRP3 Caspase-1 IL-1β IL-18常氧組Normal oxygen group 0.56±0.08 0.09±0.01 0.05±0.01 0.21±0.03 OIR組OIR group 1.13±0.12# 1.56±0.17# 1.73±0.18# 1.03±0.11#NAR組NAR group 0.69±0.08? 0.24±0.03? 0.45±0.05? 0.31±0.03?NAR+陰性對(duì)照組NAR+negative control group 0.70±0.06? 0.26±0.04? 0.46±0.06? 0.32±0.04?NAR+miR-223拮抗劑組NAR+miR-223antagomir group 1.02±0.05△▲ 1.05±0.10△▲ 0.81±0.09△▲ 0.93±0.08△▲

圖4 5組幼鼠視網(wǎng)膜中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)情況Figure4 NLRP3,Caspase-1,IL-1β,IL-18protein expression in the retina of young mice in the5groups

3 討論

ROP又稱晶狀體后纖維增生癥,是視網(wǎng)膜正常血管化停滯,新生血管異常增生,嚴(yán)重情況下會(huì)牽拉視網(wǎng)膜脫落,損害視力,甚至失明,即使患兒未失明,視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞發(fā)育異常,患兒出現(xiàn)斜視、弱視、屈光不正等的幾率也極高[8]。隨著研究深入,發(fā)現(xiàn)感染在ROP發(fā)生、發(fā)展中起一定作用,骨髓造血干細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞遷移至視網(wǎng)膜中并分化成小膠質(zhì)細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞能夠參與免疫系統(tǒng)的免疫監(jiān)視,損傷情況下小膠質(zhì)細(xì)胞激活,在初期可以作為抗原呈遞細(xì)胞,吞噬壞死的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞碎片,但小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活還可分泌一系列炎癥因子,發(fā)揮炎癥作用[9-10]。且在ROP中小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化傳遞缺氧信號(hào),促進(jìn)視網(wǎng)膜血管新生[11]。本研究以小鼠出生7d幼鼠為研究對(duì)象,OIR處理模擬ROP癥狀,研究發(fā)現(xiàn),OIR中FFA可見(jiàn)血管破裂嚴(yán)重,熒光漏在視網(wǎng)膜中,視網(wǎng)膜泛白,血管出現(xiàn)收縮現(xiàn)象;HE染色可見(jiàn)視網(wǎng)膜出現(xiàn)血管新生現(xiàn)象、細(xì)胞排列紊亂,提示OIR在一定程度上可以模擬ROP現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn),小膠質(zhì)細(xì)胞主要集中在神經(jīng)纖維層、內(nèi)核層和外叢狀層,本研究對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),在常氧組中僅有少量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞,可能用于對(duì)正常代謝的視網(wǎng)膜碎片進(jìn)行清理,但在OIR組中視網(wǎng)膜相同部位出現(xiàn)大量活化的小膠質(zhì)細(xì)胞,可能影響血管破裂、增生。中醫(yī)作為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué),中草藥的治療對(duì)于疾病意義重大,其中NAR作為中藥中重要成分,廣泛存在于植物和中藥中,研究發(fā)現(xiàn),其在糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠氧化損傷、細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。在本研究中,NAR可以減輕血管新生現(xiàn)象,降低小膠質(zhì)細(xì)胞活化現(xiàn)象,從而緩解OIR,但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

miRNA存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi),通過(guò)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)從而參與調(diào)控表觀遺傳[13],miR-223一直認(rèn)為是與造血、免疫相關(guān)的特異性miRNA,miR-223存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞中,在血管新生中處于下調(diào)狀態(tài),能夠拮抗血管新生[14];作為髓系細(xì)胞中表達(dá)miRNA,能夠調(diào)控免疫細(xì)胞發(fā)育和維持免疫細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[15],能夠通過(guò)調(diào)控多種炎癥相關(guān)因子表達(dá)從而調(diào)控單核細(xì)胞的分化和巨噬細(xì)胞極化[16]。NLRP3作為miR-223的靶基因之一[17],是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥小體,可觸發(fā)炎癥反應(yīng)過(guò)程,在OIR視網(wǎng)膜中處于高表達(dá)狀態(tài)[18]。NLRP3可以與效應(yīng)分子結(jié)合形成成熟的炎癥小體和成熟的Caspase-1,Caspase-1作為IL-1β、IL-18特異有效的蛋白酶,激活后的Caspase-1能夠促進(jìn)炎癥因子IL-1β、IL-18的表達(dá),IL-1β、IL-18進(jìn)一步發(fā)揮致炎促損傷作用[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn),在OIR視網(wǎng)膜中miR-223處于低表達(dá)狀態(tài),NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白水平均升高,提示在OIR中miR-223表達(dá)降低,從而升高NLRP3的表達(dá),發(fā)揮作用。NAR組較OIR組視網(wǎng)膜中miR-223水平升高、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白水平降低,而在NAR組的基礎(chǔ)上添加miR-223拮抗劑后可以逆轉(zhuǎn)上述過(guò)程,提示NAR能夠升高miR-223水平、降低NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白水平,實(shí)現(xiàn)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的緩解,進(jìn)而抑制血管新生。

綜上所述,NAR能夠上調(diào)miR-223的表達(dá)進(jìn)而抑制NLRP3炎癥小體的表達(dá),緩解視網(wǎng)膜炎癥作用,進(jìn)而緩解小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活,實(shí)現(xiàn)對(duì)OIR的保護(hù)。但miR-223下游靶基因眾多,亦可能通過(guò)別的基因發(fā)揮作用,且小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活機(jī)制復(fù)雜,需進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其機(jī)制。