孫曉峰,黃欣怡,曾貴榮,龔力民,喬 江,陽松威,周 琳

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院,長沙 410208;2.湖南省藥物安全評價研究中心＆新藥藥效與安全性評價湖南省重點實驗室,長沙 410331;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,長沙 410208;4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科,長沙 410007;5.長沙醫(yī)學(xué)院,長沙 410219)

女性因使用化療藥物所導(dǎo)致卵巢儲備功能在40歲之前衰竭稱為化療性卵巢早衰(premature ovarian failure,POF),可導(dǎo)致繼發(fā)性閉經(jīng)并伴隨血促性腺激素升高和雌激素下降所引起的一系列癥狀,此類患者罹患骨質(zhì)疏松、心血管疾病等疾病風(fēng)險性也明顯增加。隨著腫瘤疾病的明顯年輕化以及病人對生育和生活質(zhì)量的要求,如何改善化療性卵巢早衰愈受關(guān)注[1-2]。發(fā)育中的卵泡由卵母細(xì)胞(oocyte,OC)、顆粒細(xì)胞(granulosa cells,GC)及膜細(xì)胞(theca cell,TC)組成,三者相互作用維持卵泡的生長發(fā)育以及卵巢的功能[3-4]。GC為OC提供支持和營養(yǎng),TC與GC密不可分,為優(yōu)勢卵泡提供穩(wěn)定的雌激素微環(huán)境,同時也是女性雌激素的主要來源?；熕幬锏男ЧQ于它對快速分裂細(xì)胞的破壞能力,常用的化療藥物環(huán)磷酰胺對卵巢損傷作用不僅表現(xiàn)為其對生長期卵泡中GC增殖和OC發(fā)育的破壞,也可以通過損傷DNA的方式破壞靜止期的原始卵泡,從而減小原始卵泡池的大小,降低卵巢儲備。本團(tuán)隊及其他研究均提示化療性POF動物模型中GC凋亡率上升,而左歸丸可減少GC凋亡率,在一定程度上恢復(fù)卵巢功能[5-6]。環(huán)磷酰胺的體外活性成分磷酰胺氮芥(phosphoramide mustard,PM)在體外可通過促進(jìn)凋亡和自噬過程損傷GC;此種損傷能被10%左歸丸(ZGW)含藥血清通過影響GC自噬和凋亡過程所緩解[7],目前關(guān)于TC的研究較少,其作用往往被小覷。本研究進(jìn)一步探討TC對化療損傷性GC的影響以及左歸丸含藥血清對TC和GC共培養(yǎng)的干預(yù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物SPF級雌性SD大鼠20只,體重250～270g,8周齡,用于制備含藥血清,由湖南省斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供[SCXK(湘)2019-0015],動物飼養(yǎng)于湖南省藥物安全評價研究中心SPF環(huán)境[SYXK(湘)2020-0015]。動物實驗經(jīng)湖南省藥物安全評價研究中心倫理委員會批準(zhǔn)(2020014),過程中遵循實驗動物學(xué)的3R原則。

1.1.2 細(xì)胞

原代大鼠卵巢GC(賽百慷上海生物技術(shù)股份有限公司,批號:iCell20191027)。原代大鼠卵巢TC(賽百慷上海生物技術(shù)股份有限公司,批號:iCell201912025)。

1.2 主要試劑與儀器

左歸丸由熟地、菟絲子、枸杞、川牛膝、山茱萸、山藥、鹿角膠、龜板膠組成,購自北京同仁堂。按原配方比制成含1g/mL生藥的浸膏。磷酰胺氮芥(江蘇倍達(dá),20180908);GC專用培養(yǎng)基(iCell,PriMed-iCell-028);TC專用培養(yǎng)基(iCell,PriMediCell-042);RIPA蛋白裂解液(碧云天,P0013B);BCA蛋白定量試劑盒(碧云天,P0012S);二抗(Anti Rabbit IgG/HRP,Abclonal,AS014,);β-actin內(nèi)參(Abclonal,AC026);兔 抗Beclin-1(Abclonal,A7353);兔抗Caspase-3(Abclonal,A19654);兔抗Bax(Abclonal,A19684);兔 抗p62(Abclonal,A19700);兔 抗LC3B(Abclonal,A19665);High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Thermo Fisher Scientific,EP0742);PowerUp SYBR Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific,A25742)。引物(上 海 生 工)。Fast Pure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit(Vazyme,RC101-01);化學(xué)發(fā)光儀(博路騰);倒置顯微鏡(OLYMPUS IX71);電泳儀(北京六一);實時熒光定量PCR儀(Thermo Fisher,7500);分光光度計(Thermo Fisher,NanoDrop Lite)。

1.3 實驗方法

1.3.1 左歸丸含藥血清制備與給藥

SD大鼠隨機(jī)分2組:左歸丸含藥血清組和正常血清組各10只。1g/mL的左歸丸浸膏,按照245.7 g/(kg·d)劑量(根據(jù)成人與大鼠體表面積的換算公式計算出的大鼠用藥量,相當(dāng)于臨床等效劑量的9倍),每天分2次給左歸丸含藥血清組動物連續(xù)灌服3d,正常血清組每天分2次給予等量純凈水連續(xù)灌服3d,兩組于第3天末次灌胃后的2～2.5h,麻醉后腹主動脈進(jìn)行采血,靜置30min后,離心并分離血清置于-20℃保存,實驗前于56℃、30min環(huán)境滅活,使用0.22μm濾器過濾后使用。

1.3.2 造模與分組

分為8組:(1)空白對照組:10%正常血清專用培養(yǎng)基培養(yǎng)48h;(2)共培養(yǎng)組:10%正常血清專用培養(yǎng)基,并插入培養(yǎng)用TC細(xì)胞的小室于孔板之上,培養(yǎng)48h;(3)ZGW血清組:10% ZGW血清專用培養(yǎng)基培養(yǎng)48h;(4)ZGW血清+共培養(yǎng)組:10% ZGW血清專用培養(yǎng)基,并插入培養(yǎng)用TC細(xì)胞的小室于孔板之上,培養(yǎng)48h;(5)模型組:向10%正常血清專用培養(yǎng)基中加入PM,濃度為30μmol/L,培養(yǎng)24 h后,換液加入10%正常血清專用培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h;(6)模型+共培養(yǎng)組:向10%正常血清專用培養(yǎng)基中加入PM,濃度為30μmol/L,培養(yǎng)24h后,換液加入10%正常血清專用培養(yǎng)基,并插入培養(yǎng)用TC細(xì)胞的小室于孔板之上,繼續(xù)培養(yǎng)24h。(7)模型+ZGW血清組:向10%正常血清專用培養(yǎng)基中加入PM,濃度為30μmol/L,培養(yǎng)24h后,換液加入10%ZGW血清專用培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h;(8)模型+ZGW血清+共培養(yǎng)組:向10%正常血清專用培養(yǎng)基中加入PM,濃度為30μmol/L,培養(yǎng)24h后,換液加入10% ZGW血清專用培養(yǎng)基,并插入培養(yǎng)用TC細(xì)胞的小室于孔板之上,繼續(xù)培養(yǎng)24h。各組均在37℃,5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。利用0.4μm孔徑的聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)-based小室進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)試驗,具體方法如下:先分別制備TC細(xì)胞和GC細(xì)胞的細(xì)胞懸液,進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),每組取3×105個細(xì)胞,放至1.5mL無菌EP管中,并用其各自專用培養(yǎng)基補(bǔ)齊至600μL。向6孔板中加入2.4 mL含有10%正常血清的GC細(xì)胞專用培養(yǎng)基,同時加入200μL事先準(zhǔn)備的GC細(xì)胞懸液;上面放細(xì)胞小室,先向小室中加入1.3mL含有10%正常血清的TC細(xì)胞專用培養(yǎng)基,將200μL的細(xì)胞懸液輕輕加入小室的上室中,盡量使細(xì)胞均勻分布到小室孔內(nèi)(注意:保證上下室液體相互接觸)。

1.3.3 qRT-PCR法檢測各組目的基因mRNA表達(dá)

根據(jù)試劑盒要求提取細(xì)胞總RNA,檢測RNA純度及濃度后,使用瓊脂糖電泳法檢測RNA完整性。參照試劑盒操作說明,將1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件為95℃、10min,95℃、10s,60℃、30s,72℃、15s,循環(huán)次數(shù)為40次。參照文獻(xiàn)[8]方法分析實驗數(shù)據(jù),以2-ΔΔct法(ct表示基本循環(huán)值)測定各目的mRNA基因相對表達(dá)量。試驗重復(fù)3次。各組目的基因引物序列見表1。

表1 各組引物序列Table1 Primer sequence of each group

1.3.4 Western blot檢測各組目標(biāo)蛋白的表達(dá)

棄培養(yǎng)基,用1mL PBS緩沖液漂洗細(xì)胞2次,吸掉PBS,用胰酶將細(xì)胞消化,使用移液槍反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液,取細(xì)胞懸液置于EP管內(nèi),1000r/min的速度離心5min后,去上清,轉(zhuǎn)移至無菌的1.5 mL EP管中。每管加入200μL細(xì)胞裂解液RIPA,用移液槍吸打,將細(xì)胞沉淀充分打散至溶液澄清,放入-80℃冰箱反復(fù)凍融2次后用超聲破碎儀破碎細(xì)胞,放入提前預(yù)冷到4℃的離心機(jī),12000r/min,離心10min;將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5mL EP管中,做好標(biāo)記待用。取80μg蛋白樣品量,加入6×SDS混合,置于105℃高溫變性10min,剩余的蛋白樣品置于-80℃保存。變性后的各組蛋白經(jīng)SDS凝膠電泳(2～3h)、轉(zhuǎn)膜(90min)、封閉(60min)、孵一抗(孵育4～6h或4℃過夜)、洗膜(10min×3次)、孵二抗(60min)、再次洗膜(10min×3次)后。使用ECL顯影液進(jìn)行顯影后,在Tanon-5200系統(tǒng)中,加入化學(xué)發(fā)光底物檢測熒光信號,進(jìn)行成像分析。定性和定量分析各組條帶Beclin-1、LC3B、Bax、Caspase-3及p62的表達(dá)。實驗重復(fù)3次,結(jié)果取3次平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS22.0軟件處理數(shù)據(jù),計量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)性和方差齊性,各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析法;若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性或方差齊性,采用Kruskal-Wallis秩和檢驗方法比較各組間均值。以P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組目標(biāo)蛋白mRNA基因表達(dá)

由圖1中結(jié)果所示,用PM處理大鼠卵泡GC后,GC中的Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的mRNA表達(dá)增加,p62的表達(dá)水平下降;而左歸丸給藥能顯著降低PM處理后GC升高的Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的mRNA水平,同時升高PM處理后GC降低p62的mRNA表達(dá)水平;加入TC細(xì)胞與GC細(xì)胞共培養(yǎng),同樣可以使化療損傷性的GC細(xì)胞中Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的mRNA表達(dá)水平降低,p62的表達(dá)水平升高,且在模型組中同時加入共培養(yǎng)及左歸丸含藥血清處理后,Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的mRNA表達(dá)水平較單純使用共培養(yǎng)或左歸丸含藥血清處理的更低,而p62的表達(dá)水平更高。以上差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 各組目的基因mRNA表達(dá)量Figure1 mRNA expression of target gene in each group

2.2 各組目標(biāo)蛋白表達(dá)

由圖2中結(jié)果所示,用PM處理大鼠卵泡GC后,GC中Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的蛋白表達(dá)增加,p62的表達(dá)水平下降;而左歸丸給藥能降低PM處理后GC升高的Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的水平,同時升高PM處理后GC降低的p62表達(dá)水平;加入TC細(xì)胞與GC細(xì)胞共培養(yǎng),同樣可以使GC細(xì)胞中Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的表達(dá)水平降低,p62的表達(dá)水平升高。且在模型組中同時加入共培養(yǎng)及左歸丸含藥血清處理后,Beclin-1、LC3B、Bax以及Caspase-3的蛋白表達(dá)水平較單純使用共培養(yǎng)或左歸丸含藥血清處理的更低,而p62的表達(dá)水平更高。以上差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2 各組目的蛋白表達(dá)Figure2 Expression of target proteins in each group

3 討論

作為廣譜抗腫瘤藥物的環(huán)磷酰胺,不僅對各種實體瘤、白血病有效,而且是目前應(yīng)用的各種免疫抑制劑中作用最強(qiáng)、應(yīng)用最多的藥物之一,由于其良好的臨床療效,應(yīng)用范圍日益廣泛[9],但其副作用也不容忽視,包括脫發(fā)、骨髓抑制、損傷卵巢功能等。本實驗以PM(環(huán)磷酰胺的體外活性成分)處理GC建立化療損傷性GC模型,并嘗試將TC與GC共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn):自噬啟動因子Beclin-1、微管結(jié)合蛋白輕鏈3(LC3B)、凋亡蛋白Bax、Caspase-3在PM作用的GC中,較對照組在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平上有高表達(dá),10%左歸丸含藥血清處理及與TC共培養(yǎng)處理可下調(diào)上述蛋白在模型組中的表達(dá);然而自噬受體蛋白p62的表達(dá)較對照組降低,與TC共培養(yǎng)或在培養(yǎng)基中加入10%左歸丸含藥血清可上調(diào)模型組GC中p62蛋白及其對應(yīng)mRNA的表達(dá)。且當(dāng)GC與TC共培養(yǎng)處理的同時加入10%左歸丸含藥血清后上述蛋白及其對應(yīng)的mRNA的表達(dá)變化程度更明顯。

自噬是一種溶酶體依賴的細(xì)胞內(nèi)降解系統(tǒng),在多種生理過程中起著重要的作用,在心血管疾病、腫瘤等各類疾病的發(fā)生發(fā)展中存在失衡狀態(tài)[10-11]。Beclin-1是自噬啟動關(guān)鍵因子;LC3B則是自噬過程的標(biāo)志物,主要參與了自噬小體的形成;p62可在自噬時降解,能反映自噬的強(qiáng)弱。當(dāng)LC3B升高,p62同時降低,則表明自噬流通暢[12-13]。凋亡是一種自主調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡過程,其特征是細(xì)胞收縮、膜泡出現(xiàn)、DNA斷裂和凋亡小體的形成,主要有2種途徑:外源性或死亡受體途徑、內(nèi)源性或線粒體途徑。這2條通路最終都通過由Caspase-3的裂解啟動的執(zhí)行通路。同時Bax蛋白不僅能作為Caspase-3的上游調(diào)控機(jī)制,調(diào)節(jié)其活性,也能作為Caspase-3的底物,在其下游機(jī)制發(fā)揮促凋亡作用,兩者相互聯(lián)系又相互制約,都是重要的促凋亡基因[14]。自噬和凋亡都是典型的程序性細(xì)胞死亡類型,通常發(fā)生在同一個細(xì)胞內(nèi)。自噬的順序先于凋亡,自噬是否誘導(dǎo)或抑制凋亡取決于細(xì)胞類型、刺激性質(zhì)和持續(xù)時間[15]。本實驗結(jié)果中模型組Beclin-1、LC3B基因表達(dá)上升的同時,p62基因表達(dá)下降,說明PM損傷GC過程中自噬流通暢,此過程中Bax和Caspase-3基因表達(dá)的上升也提示GC凋亡。

TC位于GC的周圍,源于卵巢的基質(zhì)細(xì)胞,內(nèi)含大量脂類物質(zhì)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并存在豐富的LH受體。既往研究提示其不僅為卵泡提供結(jié)構(gòu)支持,所分泌的雄激素也是GC合成雌激素的原料[16]:在TC產(chǎn)生大量雄激素及其誘導(dǎo)的芳香化酶活化的前提下,卵泡刺激素和黃體生成素相互協(xié)調(diào),才可產(chǎn)生雌激素的爆發(fā),同時OC即將完成第一次減數(shù)分裂,完成優(yōu)勢卵泡最后階段的發(fā)育。此外TC還可分泌各種生長因子調(diào)控卵巢閉鎖過程[17],對抗GC凋亡,但關(guān)于TC對化療損傷性GC的影響及其具體機(jī)制的相關(guān)研究甚少。本實驗證明TC能緩解PM作用于GC引起的化療性損傷,且與左歸丸含藥血清有協(xié)同作用。PM對GC的損傷以及左歸丸含藥血清和TC對GC的保護(hù)作用中都存在自噬與凋亡現(xiàn)象,且可能存在“自噬-凋亡”交叉對話,補(bǔ)充了TC對GC又一作用以及左歸丸治療化療性POF的作用機(jī)制。但關(guān)于左歸丸含藥血清與TC共培養(yǎng)協(xié)同作用的具體機(jī)制、左歸丸含藥血清和TC通過哪些作用位點影響GC的自噬與凋亡過程,GC與TC之間是否還有其他相互作用等問題仍待下一步實驗闡明。