韓 笑,姚明江,任建勛,付建華,任鈞國(guó),金 龍,郭 浩,趙步長(zhǎng),王益民,劉建勛?

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,北京市中藥藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100091;2.西安步長(zhǎng)中醫(yī)心腦病醫(yī)院,西安 710082)

血管新生在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、心室重構(gòu)、腫瘤等生理病理過(guò)程中具有重要作用。近年來(lái)缺血性血管疾病的防治從單純改變病變血管供血,轉(zhuǎn)向如何促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立,因而促血管新生成為缺血性血管疾病的治療新方向[1]。心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞是心肌與血液交換能量的主要屏障,可合成多種細(xì)胞因子和活性物質(zhì),維持正常心肌的功能,參與心肌缺血后血管新生[2]。很多中藥可以促進(jìn)血管新生、促進(jìn)側(cè)支循環(huán),在治療缺血性心腦血管疾病方面具有良好的應(yīng)用前景[3]。

銀杏蜜環(huán)口服溶液主要由銀杏葉提取物和天麻蜜環(huán)菌組成,銀杏葉提取物有活血化瘀通絡(luò)之功,蜜環(huán)菌可鎮(zhèn)靜安神,臨床用于治療冠心病、心絞痛、缺血性腦血管疾病,可改善心腦缺血性癥狀[4-5]。藥理研究顯示,銀杏蜜環(huán)口服溶液可保護(hù)急性心肌缺血大鼠[6]和犬[7],減輕腦缺血再灌注大鼠腦梗死[8],對(duì)缺氧復(fù)氧損傷臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞[9]、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[10]具有保護(hù)作用,但是對(duì)血管新生方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在觀察銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管新生能力的影響,發(fā)掘銀杏蜜環(huán)口服溶液治療缺血性心血管疾病的藥效機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞CMECs(Cat NO.C645,ATCC)。

1.2 主要試劑與儀器

銀杏蜜環(huán)口服溶液(每10mL含30mg銀杏葉提取物和1000mg蜜環(huán)菌粉,邛崍?zhí)煦y制藥有限公司提供,批號(hào)190721);DMEM培養(yǎng)基(GIBCO,8119352);胎牛血清(Biowest,S14735S1820);胰蛋白酶消化液(Solarbio,T1300);青霉素-鏈霉素SP(Gibco,1894156);CCK-8試劑盒(Dojindo,CK04);Matrigel基質(zhì)膠(Corning,356237);RIPA細(xì)胞裂解液(Solarbio,R0010);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Solarbio,20191229);5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(KeyGEN BioTECH,20160712);10×電泳緩沖液、10×電轉(zhuǎn)移緩沖液、10×封閉洗滌液、封閉專(zhuān)用脫脂奶粉(北京普利來(lái)基因技術(shù)有限公司);化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(Thermo Scientific,UI291092);VEGF抗體(Abcam,A3098);CD31抗體(Abcam,ab24590);βactin抗體(Proteintech,66009-1);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(YUABIO,127760);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體(YUABIO,203700113)。

活細(xì)胞工作站(Olympus,IX81);酶標(biāo)儀(BioTek SYNERGY4);電 泳 儀(BIO-RAD,Power Pac Univeral);凝膠成像儀(BIO-RAD,ChemiDocTMXRS+)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CMECs細(xì)胞培養(yǎng)

CMECs細(xì)胞以DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%FBS和1%青/鏈霉素)培養(yǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí),胰蛋白酶消化液消化傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 分組及給藥

分組:對(duì)照組、銀杏蜜環(huán)口服溶液高劑量組(2.6mg/mL,簡(jiǎn)稱(chēng)銀蜜高)、中劑量組(1.3mg/mL,簡(jiǎn)稱(chēng)銀蜜中)、低劑量組(0.6mg/mL,簡(jiǎn)稱(chēng)銀蜜低)。對(duì)照組用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);銀蜜高、中、低組適時(shí)(給藥時(shí)間因?qū)嶒?yàn)不同而不同,具體見(jiàn)下)吸棄舊培養(yǎng)基,加入含藥DMEM培養(yǎng)基。

1.3.3 CMECs增殖檢測(cè)

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)用CCK-8法。細(xì)胞以1×105/mL的密度接種于96孔板,待細(xì)胞充分貼壁后,棄舊培養(yǎng)基,對(duì)照組換成DMEM培養(yǎng)基(每孔100μL),銀蜜高、中、低劑量組分別換成含銀蜜2.6、1.3、0.6 mg/mL的DMEM培養(yǎng)基(每孔100μL),將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。24h后取出加入CCK-8溶液每孔10μL,孵育3h,酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度OD值,OD值大小與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。細(xì)胞增殖率(%)=(給藥組OD值-對(duì)照組OD值)/對(duì)照組OD值×100%

1.3.4 CMECs遷移檢測(cè)

細(xì)胞遷移率借助細(xì)胞劃痕法,比較各組細(xì)胞劃痕面積愈合百分比(%),評(píng)價(jià)銀杏蜜環(huán)口服液對(duì)CMECs遷移能力的影響。CMECs以每孔5×105cells的密度接種于6孔板內(nèi),待形成完全融合的單層細(xì)胞層后,用200μL無(wú)菌槍頭在孔中畫(huà)“井”字型劃痕無(wú)菌PBS洗細(xì)胞3次,去除劃下的脫落細(xì)胞碎片,確保劃線后留下的間隙清晰可見(jiàn)。此時(shí),對(duì)照組加入DMEM培養(yǎng)基,銀蜜高、中、低劑量組分別換成含銀蜜2.6、1.3、0.6mg/mL的DMEM培養(yǎng)基,放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。于劃痕后即刻(0h)、劃痕后6h、劃痕后24h顯微鏡觀察橫豎劃痕交叉點(diǎn)四周的固定檢測(cè)點(diǎn),拍照,Image J軟件計(jì)算劃痕面積。細(xì)胞遷移率(%)=(原劃痕面積-殘留面積)/原劃痕面積×100%。

1.3.5 CMECs體外成管實(shí)驗(yàn)

將Matrigel基質(zhì)膠、24孔板、槍頭提前預(yù)冷。向預(yù)冷的24孔板中加入Matrigel基質(zhì)膠(每孔250 μL),放入培養(yǎng)箱30min固化成膠。將CMECs接種于Matrigel基質(zhì)膠包被好的24孔板中,放回培養(yǎng)箱待細(xì)胞貼壁后,對(duì)照組換成DMEM培養(yǎng)液,銀蜜高、中、低劑量組分別換成含銀蜜2.6、1.3、0.6mg/mL的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3h。3h后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞成管情況,每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照。Image J圖像分析軟件分析,以網(wǎng)眼數(shù)、網(wǎng)眼面積、交叉點(diǎn)數(shù)表示各組CMECs的成管能力。網(wǎng)眼和交叉點(diǎn)示意圖見(jiàn)圖1。

圖1 體外成管實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)指標(biāo)示意圖Figure1 Schematic diagram of main detection indexes in vitro tube forming experiment

1.3.6 CMECs CD31、VEGF蛋白免疫印跡檢測(cè)

CMECs經(jīng)藥物處理后預(yù)冷的RIPA裂解液冰上超聲裂解細(xì)胞,13000r/min,4℃離心后取上清測(cè)蛋白濃度。取等量蛋白上樣,SDS-PAGE分離后,將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1h,CD31、VEGF一抗(1∶1000),4℃冰箱孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶20000)室溫孵育2h,TBST洗滌3次后,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色,Image Lab3.0系統(tǒng)成像軟件采集凝膠成像圖片,分析條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)CMECs增殖的影響

與對(duì)照組相比,銀蜜高、中、低劑量可顯著促進(jìn)CMECs增殖,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05～0.001);銀蜜高促進(jìn)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的作用優(yōu)于銀蜜中、低組(P＜0.001);銀蜜中劑量與低劑量組相比,未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果提示銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)CMECs具有顯著的增殖效應(yīng),見(jiàn)表1。

表1 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)CMECs增殖的影響(±s,n=6)Table1 Effect of YM(Yinxing Mihuan oral solution)on proliferation of CMECs

表1 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)CMECs增殖的影響(±s,n=6)Table1 Effect of YM(Yinxing Mihuan oral solution)on proliferation of CMECs

注:與對(duì)照組比較,?P＜0.05,???P＜0.001;與銀蜜中組比較,△△△P＜0.001;與銀蜜低組比較,▲▲▲P＜0.001。Note.Compared with control group,?P＜0.05,???P＜0.001.Compared with YM medium dose group,△△△P＜0.001.Compared with YM low dose group,▲▲▲P＜0.001.

組別Groups劑量Dose增殖率(%)Proliferation rate對(duì)照組Control group / 0±0銀蜜高組YM high dose group2.6mg/mL 34.0±4.9???△△△▲▲▲銀蜜中組YM medium dose group1.3mg/mL 10.5±5.2?銀蜜低組YM low dose group 0.6mg/mL 8.6±4.5?

2.2 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)CMECs遷移的影響

結(jié)果顯示,6h時(shí)間點(diǎn),銀蜜高組細(xì)胞遷移率顯著高于對(duì)照組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001),銀蜜中、低組CMECs遷移率大于對(duì)照組,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);在24h時(shí)間點(diǎn),銀蜜高、中、低組細(xì)胞遷移率明顯高于對(duì)照組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001),且銀蜜高組遷移率顯著高于銀蜜中、低組(P＜0.001);銀蜜中組遷移率高于銀蜜低組(P＜0.001)。提示銀蜜可促進(jìn)CMECs遷移,且促進(jìn)CMECs遷移的能力隨著銀蜜劑量的增加而增強(qiáng)、隨時(shí)藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。見(jiàn)表2,圖2。

表2 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)CMECs遷移率(%)的影響(±s,n=6)Table2 Effect of YM on CMECs mobility rate

表2 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)CMECs遷移率(%)的影響(±s,n=6)Table2 Effect of YM on CMECs mobility rate

注:與對(duì)照組比較,???P＜0.001;與銀蜜中組比較,△△△P＜0.001;與銀蜜低劑量組比較,▲▲▲P＜0.001。Note.Compared with control group,???P＜0.001.Compared with YM medium dose group,△△△P＜0.001.Compared with YM low dose group,▲▲▲P＜0.001.

組別Groups劑量Dose 6h遷移率(%)6h mobility rate 24h遷移率(%)24h mobility rate對(duì)照組Control group / 6.5±5.7 22.1±6.0銀蜜高組YM high dose group 2.6mg/mL 15.1±3.3??? 57.7±5.5???△△△▲▲▲銀蜜中組YM medium dose group 1.3mg/mL 13.0±8.8 44.9±5.6???▲▲▲銀蜜低組YM low dose group 0.6mg/mL 11.7±4.7 31.4±2.9???

圖2 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)CMECs遷移能力的影響Figure2 Effect of YM on migration ability of CMECs

2.3 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)CMECs成管的影響

CMECs細(xì)胞接種于Matrigel基質(zhì)膠孔中后,剛開(kāi)始呈圓形或卵圓形,30min后基本貼壁,1h后細(xì)胞逐漸伸展并伸出突起,3h后突起相互連接形成小管樣結(jié)構(gòu)。銀蜜有良好的促進(jìn)CMECs成管作用,且促CMECs成管的能力隨藥物劑量的增加而增強(qiáng),見(jiàn)圖3、表3。

表3 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)CMECs網(wǎng)眼數(shù)、網(wǎng)眼面積、交叉點(diǎn)數(shù)的影響(±s,n=3)Table3 Effect of YM on meshes number,meshes area and junctions of CMECs

表3 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)CMECs網(wǎng)眼數(shù)、網(wǎng)眼面積、交叉點(diǎn)數(shù)的影響(±s,n=3)Table3 Effect of YM on meshes number,meshes area and junctions of CMECs

注:與對(duì)照組比較,?P＜0.05,??P＜0.01,???P＜0.001;與銀蜜中組比較,△△△P＜0.001;與銀蜜小組比較,▲P＜0.05,▲▲▲P＜0.001。Note.Compared with control group,?P＜0.05,??P＜0.01,???P＜0.001.Compared with YM medium dose group,△△△P＜0.001.Compared with YM low dose group,▲P＜0.05,▲▲▲P＜0.001.

組別Groups劑量Dose網(wǎng)眼數(shù)(個(gè))Nb meshes(NO.)網(wǎng)眼面積(像素)Meshes area(PX)交叉點(diǎn)數(shù)(個(gè))Nb junctions(NO.)對(duì)照組Control group / 2±2 9585±8034 30±11銀蜜高YM high dose group 2.6mg/mL 10±6??▲ 112307±96316??▲ 60±16???△△△▲▲銀蜜中YM medium dose group 1.3mg/mL 5±3? 35283±28857? 41±12?銀蜜低YM low dose group 0.6mg/mL 4±3 22072±13128? 39±14

圖3 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)CMECs小管形成的影響Figure3 Effect of YM on tubule formation of CMECs

網(wǎng)眼數(shù)及網(wǎng)眼面積結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比銀蜜高、銀蜜中組網(wǎng)眼數(shù)顯著增多(P＜0.01,P＜0.05)、網(wǎng)眼面積更大(P＜0.01,P＜0.05),其中銀蜜高組網(wǎng)眼的數(shù)量及面積與銀蜜低組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。銀蜜低組網(wǎng)眼數(shù)量增多,但與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),網(wǎng)眼面積顯著大于對(duì)照組(P＜0.05)。交叉點(diǎn)數(shù)結(jié)果顯示:銀蜜高組細(xì)胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的交叉點(diǎn)顯著多于對(duì)照組、銀蜜中、低劑量組(P＜0.001);銀蜜中、低組交叉點(diǎn)數(shù)高于對(duì)照組,銀蜜中組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

2.4 銀杏蜜環(huán)菌口服溶液對(duì)CMECs CD31、VEGF蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,銀蜜高、銀蜜中組CD31、VEGF蛋白表達(dá)量均顯著升高(P＜0.05～0.001),銀蜜低組CD31和VEGF表達(dá)有升高趨勢(shì),但統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);銀蜜高組CD31、VEGF表達(dá)量顯著高于銀蜜中、低組(P＜0.001),見(jiàn)圖4。

圖4 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)CMECs CD31、VEGF表達(dá)的影響Figure4 Effect of YM on the expression of CD31、VEGF in CMECs

3 討論

冠心病的死亡率呈逐年上升態(tài)勢(shì),建立有效的冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)可以在一定程度上緩解心肌缺血癥狀,降低患者的病死率[11-12],而側(cè)支循環(huán)的形成有賴(lài)于新生血管,血管新生能力是側(cè)支循環(huán)建立的基礎(chǔ)和關(guān)鍵[13]。治療性血管新生成為缺血性心臟病治療的新途徑[14]。

銀杏蜜環(huán)口服溶液主要有效物質(zhì)為銀杏葉提取物和天麻蜜環(huán)菌,其有銀杏葉具有活血、化瘀、通絡(luò)之功效,銀杏葉提取物具有保護(hù)線粒體、抑制細(xì)胞凋亡、抗氧化、抗炎、擴(kuò)張血管、改善血液循環(huán)的作用[15];天麻蜜環(huán)菌與天麻共生,與天麻有相似的藥理作用和臨床療效[16],具有抗炎、抑制細(xì)胞凋亡、抑制血小板活化、抗血栓等藥效[17],與化瘀通絡(luò)功效相似。銀杏蜜環(huán)口服溶液臨床用于治療缺血性心血管疾病,但機(jī)制是否與促進(jìn)心肌缺血區(qū)血管新生的作用少見(jiàn)報(bào)道。

血管生成是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程,涉及激活期血管基底膜降解;血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖、遷移;重建形成新的血管和血管網(wǎng)等環(huán)節(jié)[18]。血管生成受機(jī)體多種因素如CD31和VEGF的調(diào)節(jié)。CD31又稱(chēng)為血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子,存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接處,CD31胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸殘基磷酸化,啟動(dòng)絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)通路,調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡,促進(jìn)血管生成[19]。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂劑,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,增加血管的滲透性[20-21],使血漿蛋白溢出凝結(jié)形成凝膠體,成為血管生成的臨時(shí)基質(zhì),為內(nèi)皮細(xì)胞遷移提供纖維網(wǎng)絡(luò),在促血管生成的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[22-25]。

本研究觀察銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)體外培養(yǎng)CMECs增殖、遷移及血管樣管腔形成的影響;同時(shí)檢測(cè)與血管生成密切相關(guān)的CD31、VEGF蛋白表達(dá)情況,綜合評(píng)價(jià)銀杏蜜環(huán)口服溶液體外促血管新生的能力及機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,銀蜜高、中、低劑量具有顯著促進(jìn)CMECs增殖、遷移和成管的藥效,且藥效隨著銀蜜實(shí)驗(yàn)劑量的增加而增強(qiáng)。同時(shí),銀蜜還可明顯上調(diào)CD31和VEGF的蛋白表達(dá),銀蜜劑量越高,內(nèi)皮細(xì)胞CD31和VEGF的蛋白表達(dá)量越高。

依據(jù)上述細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果,可以推測(cè)銀蜜促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用將為血管生成提供足夠多的細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞遷移的能力則把增殖的內(nèi)皮細(xì)胞遷移至需要生成血管的部位,為血管生成提供物質(zhì)基礎(chǔ),之后銀蜜促成管的作用將幫助機(jī)體利用輸送過(guò)來(lái)的增殖細(xì)胞,組建管樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。同時(shí),銀蜜刺激內(nèi)皮細(xì)胞CD31和VEGF的表達(dá),二者協(xié)同內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管過(guò)程,并為血管網(wǎng)的生成提供臨時(shí)基質(zhì)和纖維網(wǎng)絡(luò),最終形成管腔樣結(jié)構(gòu)。

在Matrigel基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)中,銀蜜高劑量組網(wǎng)眼數(shù)量、網(wǎng)眼面積、交叉點(diǎn)數(shù)量都顯著高于對(duì)照組、銀蜜中、銀蜜低劑量組。網(wǎng)眼數(shù)量越多,網(wǎng)眼面積越大,代表可能形成血管管腔越多,血管管徑可能越粗,大口徑的新生血管將有可能為缺血組織提供更多的血供,更為有效地發(fā)揮缺血代償作用。交叉點(diǎn)越多,血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)就越牢固越成熟。可見(jiàn),銀蜜高劑量顯示出更好的促進(jìn)CMECs體外成管的藥效。

綜上所述,銀杏蜜環(huán)口服溶液可促CMECs增殖、遷移、成管,并能上調(diào)細(xì)胞CD31和VEGF的表達(dá),具有良好的體外促血管新生的能力,其活血、化瘀、通絡(luò)的功效及其治療缺血性心臟病的藥效機(jī)制與其促血管新生的作用具有一定相關(guān)性。促血管生成更深入的機(jī)制將在細(xì)胞及心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ蜕线M(jìn)行。