任雪鋒，鄧亞博，臧國長，鄭軼琦

（河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，河南 洛陽 471000）

狗牙根（Cynodon dactylon）隸屬禾本科狗牙根屬，別名行儀芝，爬根草，百慕大草，是世界上暖季型草坪草的廣布種之一，廣泛應(yīng)用于綠地建植，水土保持，運(yùn)動場鋪設(shè)，畜牧等［1-3］。狗牙根原產(chǎn)于非洲，在全世界廣泛分布［4］。我國擁有豐富的狗牙根種質(zhì)資源，主要分布在黃河流域及以南地區(qū)，另外在華北、新疆、河南、甘肅等地區(qū)都有分布［5］。前人應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)對我國的狗牙根種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行了大量研究，Li 等［6］對我國11 個省的95 份狗牙根利用ISSR 分子標(biāo)記進(jìn)行了遺傳多樣性研究，Zheng 等［7］對我國20 個省共157 份狗牙根利用SRAP 分子標(biāo)記進(jìn)行了遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析與評價，周少云［8］對我國華南地區(qū)的118 份狗牙根應(yīng)用ISSR 分子標(biāo)記進(jìn)行了遺傳多樣性研究，凌瑤等［9］運(yùn)用AFLP 與SRAP 標(biāo)記對四川、重慶、貴州、西藏、云南以及非洲地區(qū)共59 份狗牙根的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，劉杰［10］運(yùn)用ISSR 分子標(biāo)記對采自安徽省的150 份狗牙根的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，李會彬等［11］運(yùn)用SSR 分子標(biāo)記對河北省的34 份狗牙根的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，李江華等［12］應(yīng)用SRAP 分子標(biāo)記對我國新疆地區(qū)的48 份狗牙根材料的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，以上研究均表明我國的狗牙根具有豐富的遺傳多樣性。

河南省地處中國中部，是南北氣候帶的過渡區(qū)域，植物資源豐富［13］。狗牙根在河南省分布廣泛，主要分布于海拔1000 m 以下的淺山、丘陵、平原地區(qū)［14］。目前對河南省狗牙根種質(zhì)資源的鑒定與評價工作較少。鄧亞博等［15］基于河南省狗牙根的表型性狀對遺傳多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明河南省狗牙根具有豐富的表型遺傳多樣性，遺傳變異主要來源于居群內(nèi)，另外緯度和年降水量是影響狗牙根表型性狀變異的主要因素。由于表型性狀容易受外部環(huán)境的影響，因此有必要應(yīng)用DNA 分子標(biāo)記對河南省狗牙根的遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)研究。本研究應(yīng)用SSR 分子標(biāo)記，對采集于河南省15 個狗牙根居群的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和評價，以期為合理開發(fā)和利用河南省狗牙根種質(zhì)資源，推動我國草坪草新品種的培育奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及來源

在河南省選取15 個采樣點(diǎn)，每個采樣點(diǎn)采集一個居群，每個居群采集16～20 份樣本，居群內(nèi)各樣本間采樣間隔不小于10 m，每份樣本采集生長良好，無病蟲害的葉片，裝入有硅膠的自封袋中進(jìn)行保存。采樣地點(diǎn)見圖1，采樣點(diǎn)概況見表1。

表1 狗牙根居群采集點(diǎn)概況Table 1 Survey of collecting sites of bermudagrass populations

圖1 狗牙根居群采集點(diǎn)分布Fig.1 The map of collection site for bermudagrass populations

1.2 試驗(yàn)方法

采用植物DNA 提取試劑盒（DP350-02，北京天根生化科技有限公司）提取DNA。對提取的DNA 質(zhì)量用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，對DNA 的濃度與純度用紫外分光光度計（T6 新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）進(jìn)行檢測，將DNA 溶液稀釋至50 ng·μL-1，放置-20 ℃保存?zhèn)溆?。從本?shí)驗(yàn)室前期篩選的狗牙根SSR 引物中，選擇多態(tài)性高，重復(fù)性好的10 對引物（表2）進(jìn)行分析，引物序列、擴(kuò)增反應(yīng)體系以及擴(kuò)增程序參照Wang 等［16］的報道。

表2 本研究所采用的SSR 引物序列Table 2 Sequences of SSR primers used in the study

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行人工判讀，對每一條帶，按照有、無分別賦值1 和0，建立SSR 分子標(biāo)記0/1 矩陣。使用POPGENE 1.32 軟件［17］計算遺傳多樣性的相關(guān)參數(shù)，包括觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s 遺傳多樣性指數(shù)、Shannon’s 信息指數(shù)、多態(tài)性條帶百分率、Nei’s 遺傳距離、遺傳一致度、居群間基因分化度（gene differentiation coefficient，Gst）、基因流（gene flow，Nm）等。將POPGENE 計算的居群遺傳一致度導(dǎo)入NTSYSpc 2.1 軟件［18］，按照UPGMA 法進(jìn)行聚類分析，并對狗牙根居群間地理距離與遺傳距離進(jìn)行Mantel 檢驗(yàn)。用NTSYS-pc 2.1 軟件計算供試材料的遺傳距離矩陣，將計算結(jié)果導(dǎo)入MEGA 6.0［19］中采用UPGMA 法形成288 份狗牙根的樹狀聚類圖。

使用軟件Structure 2.3.4［20］分析供試材料的群體遺傳結(jié)構(gòu)，將群體數(shù)目預(yù)測值K設(shè)置為2～10，將開始時的MCMC（markov chain monte carlo）不作數(shù)迭代設(shè)置為10000 次，然后將不作數(shù)迭代后的MCMC 設(shè)置為100000次，重復(fù)運(yùn)行5 次，將運(yùn)行結(jié)果導(dǎo)入在線程序Structure harvester（http://taylor0. biology. ucla. edu/structureHarvester/）進(jìn)行最佳群體數(shù)預(yù)測。根據(jù)各材料在各亞群中Q值是否大于0.7［21］來劃分不同亞群。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用SSR 引物對288 份狗牙根材料進(jìn)行檢測，擴(kuò)增結(jié)果見表3。10 對SSR 引物共擴(kuò)增出173 條條帶，其中多態(tài)性條帶共163 條，平均每對引物擴(kuò)增出16.3 條多態(tài)性條帶，引物CDCA77-78、CDCA747-748、CDE127-128、CDE375-376 擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)最多，各有18 條，引物CDCA155-156 擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)最少，有13 條。引物CDCA379-380 和CDE127-128 多態(tài)性百分率最高，達(dá)到100%，引物CDCA747-748 和CDE375-376 多態(tài)性條帶百分率最低，為90.00%，平均多態(tài)性條帶百分率為94.29%。Nei’s 基因多樣性指數(shù)最高的是引物CDCA55-56（0.3850），最低的是引物ES295577（0.1187），平均Nei’s 基因多樣性指數(shù)為0.2307。Shannon’s 遺傳多樣性信息指數(shù)最高的是引物CDCA55-56，達(dá)到0.5678，最低的是引物ES295577，為0.2016，平均Shannon’s 遺傳多樣性信息指數(shù)為0.3736。綜上所述，所選引物均具有較高的多態(tài)性，對供試材料具有較高的分辨率。

表3 引物擴(kuò)增結(jié)果Table 3 Primers amplification results

2.2 遺傳多樣性分析

狗牙根居群遺傳多樣性分析結(jié)果見表4，觀測等位基因數(shù)為1.4220～1.7572，最大的為P5 居群（開封市杞縣老莊村），最小的為P1 居群（鶴壁市淇濱區(qū)楊莊村），平均為1.5437；有效等位基因數(shù)為1.1971～1.3555，最大的為P4 居群（焦作市中站區(qū)鑫珠春村），最小的為P1 居群，平均為1.2552；Nei’s 基因多樣性指數(shù)為0.1186～0.2144，最大的為P4 居群，最小的為P1 居群，平均為0.1151；Shannon’s 遺傳多樣性信息指數(shù)為0.1830～0.3293，最大的為P4 居群，最小的為P1 居群，平均為0.2398；多態(tài)性條帶百分率為42.20%～75.72%，最大的為P5 居群，最小的為P1 居群，平均為54.37%。在居群水平上，15 個狗牙根居群各參數(shù)差異較大，其中來自P4 居群的3 個參數(shù)值（有效等位基因數(shù)、Nei’s 基因多樣性指數(shù)、Shannon’s 遺傳多樣性信息指數(shù)）均最大，P1 居群的5 個參數(shù)值最小，綜合表明P4 居群的遺傳多樣性水平最高，P1 居群的遺傳多樣性水平最低。物種水平上的Nei’s 基因多樣性指數(shù)、Shannon’s 遺傳多樣性信息指數(shù)、多態(tài)性條帶百分率分別為0.2288、0.3717、100%，表明采集于河南省的狗牙根材料具有豐富的遺傳多樣性。

表4 河南省狗牙根居群的遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of bermudagrass populations in Henan Province（mean±SD）

2.3 居群遺傳分化分析

基于POPGENE 1.32 計算居群間的遺傳分化系數(shù)和基因流結(jié)果表明，15 個居群間的遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.3857，即發(fā)生在居群間的遺傳變異達(dá)到38.57%，61.43%的遺傳變異存在于居群內(nèi)，表明河南省狗牙根居群的遺傳變異主要發(fā)生于居群內(nèi)?；蛄鳎∟m）為0.7964，表明居群間存在一定程度的基因交流，但不頻繁。

2.4 狗牙根居群的聚類分析

基于POPGENE 1.32 計算15 個居群間遺傳一致度，其變化范圍是0.746～0.964，平均為0.767，遺傳一致度最小的是來自鶴壁市淇濱區(qū)楊莊村P1 居群和信陽市潢川縣八里村P15 居群，為0.746，遺傳一致度最大的是來自商丘市睢陽區(qū)辛莊村P6 居群和登封市中岳區(qū)康村P7 居群，為0.964。15 個居群UPGMA 聚類分析結(jié)果如圖2 所示。在遺傳一致度0.89 處，將15 個居群分為5 組，第1 組只包含來自鶴壁市淇濱區(qū)楊莊村的P1 居群，第2 組包含P2、P3、P4、P5、P13、P14、P15 共7 個居群，分別來自濮陽市華龍區(qū)辛莊新村、新鄉(xiāng)市長垣縣常村鎮(zhèn)常村、焦作市中站區(qū)鑫珠春村、開封市杞縣老莊村、南陽市唐河縣老潘莊村、信陽市羅山縣厲家灣村、信陽市潢川縣八里村，第3組包含P8、P9、P10 共3 個居群，分別來自洛陽市洛寧縣鳳翔村、許昌市鄢陵縣蔣莊村、周口市西華縣高莊村，第4組包含P6、P7 兩個居群，分別來自商丘市睢陽區(qū)辛莊村、登封市中岳區(qū)康村，第5 組包含P11、P12 兩個居群，分別來自南陽市淅川縣李家灣村、駐馬店市確山縣李岈村。聚類結(jié)果表明，居群沒有完全按照地理來源進(jìn)行聚類，如組成第2 組的居群包括豫東地區(qū)的P5、豫北地區(qū)的P2、P3、P4 居群和豫南地區(qū)的P13、P14、P15 居群。為進(jìn)一步闡明地理距離和遺傳距離之間的相關(guān)性，經(jīng)Mantel 檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)r=-0.0950（P=0.2708＞0.05），表明供試狗牙根居群的地理距離與遺傳距離之間無相關(guān)性。

圖2 15 個居群間UPGMA 聚類分析Fig.2 UPGMA cluster analysis among 15 populations

2.5 288 份狗牙根聚類分析

供試材料的遺傳距離為0.0173～0.5205，平均遺傳距離為0.3113，其中遺傳距離最小的材料是來自P10 居群的184 號和186 號，遺傳距離最大的是來自P1 居群的14 號和P15 居群的272 號。根據(jù)聚類結(jié)果將所有材料分成為3 組（圖3）。Ⅰ組包含P1 居群、P2 居群、P6 居群、P7 居群、P8 居群、P9 居群的所有材料，P3 居群的10 份材料，P5 居群的2 份材料，P10 居群的16 份材料；Ⅱ組包含P11 居群、P12 居群、P13 居群、P14 居群、P15 居群的所有材料，P10 居群的3 份材料；Ⅲ組包含P4 居群的所有材料，P3 居群的10 份材料，P5 居群的18 份材料。結(jié)果表明，絕大多數(shù)來自同一居群的材料被分到同一組，并且在同一組中的材料并沒有嚴(yán)格按照材料的地理來源進(jìn)行聚類。

圖3 288 份狗牙根材料UPGMA 聚類分析Fig.3 UPGMA cluster analysis of 288 bermudagrass materials

2.6 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

本研究采用Structure 軟件對狗牙根材料進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，K與ΔK的變化關(guān)系如圖4，當(dāng)K=2 時ΔK出現(xiàn)最大值，由此判斷可將288 份狗牙根材料分為2 個亞群，K=2 時的群體遺傳結(jié)構(gòu)如圖5 所示。分析各材料在不同亞群的Q值發(fā)現(xiàn)第1 個亞群（紅色）主要來自P1、P2、P3、P6、P7、P8、P9、P10 居群，共8 個居群，包含144 份材料（50.0%），第2 個亞群（綠色）主要來自P11、P12、P13、P14、P15 居群，共5 個居群，包含96 份材料（33.3%），兩大亞群的Q值≥0.7，屬于單一型群體，其余48 份材料（16.7%）主要來自P3、P4、P5 居群，該亞群Q值＜0.7，沒有明確的亞群歸屬，形成了混合型群體，群體遺傳結(jié)構(gòu)分析與288 份狗牙根材料的聚類分析結(jié)果基本一致。

圖4 基于Structure 軟件分析的K 與ΔK 的變化趨勢Fig.4 Trend of K and ΔK based on Structure analysis

圖5 基于SSR 標(biāo)記的K=2 時288 份狗牙根群體遺傳結(jié)構(gòu)Fig.5 Genetic structure of 288 bermudagrass accessions at K=2 based on SSR markers

3 討論

3.1 多態(tài)性分析

SSR 分子標(biāo)記技術(shù)具有高多態(tài)性，高穩(wěn)定性，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，可快速分析植物的遺傳多樣性。本試驗(yàn)對采自河南省15 個居群共288 份狗牙根材料，用10 對SSR 引物共擴(kuò)增出163 條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶百分率達(dá)到94.29%。張延輝等［22］對新疆地區(qū)的106 份野生狗牙根，運(yùn)用20 對SSR 引物進(jìn)行研究，多態(tài)性位點(diǎn)比率為87.86%；李會彬等［11］對河北省的34 份狗牙根材料，用21 對SSR 引物共擴(kuò)增出185 條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比率占81.90%；凌瑤等［23］對我國西南地區(qū)5 個省份的55 份野生狗牙根材料進(jìn)行SSR 與AFLP 聯(lián)合分析，其中用18對SSR 引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，多態(tài)性條帶比率為75.10%。與上述研究結(jié)果相比，本研究所選擇的10 對SSR 引物能有效用于檢測狗牙根的遺傳多樣性，同時表明河南省野生狗牙根具有豐富的遺傳多樣性。

3.2 遺傳分化分析

河南省15 個居群的遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.3857，說明居群間的遺傳分化占總體遺傳變異的38.57%，居群內(nèi)占61.43%，居群遺傳分化主要發(fā)生于居群內(nèi)。居群間的基因流（Nm）為0.7964，根據(jù)Govindaraju［24］對基因流（Nm）大小的劃分，共分為3個等級，Nm≥1.00 為高水平，0.25≤Nm≤0.99 為中等水平，Nm≤0.25 為低水平，說明狗牙根居群間存在著中等水平的基因交流，即居群間存在著一定程度的基因交流，但不頻繁，有限的基因流導(dǎo)致狗牙根居群間存在著一定程度的遺傳分化。馬濤［25］對湖南省野生狗牙根的遺傳多樣性研究中發(fā)現(xiàn)，居群間的遺傳分化系數(shù)為0.4693，基因流為0.5075，指出居群間存在較高的遺傳分化。凌瑤等［23］對西南地區(qū)的野生狗牙根遺傳多樣性研究中同樣也發(fā)現(xiàn)居群內(nèi)遺傳分化系數(shù)達(dá)到0.6741，居群間存在較高的遺傳分化。狗牙根屬于異花授粉植物，在同一居群內(nèi)雜交現(xiàn)象頻發(fā)，后代存在較大的遺傳分化，導(dǎo)致遺傳變異主要來源于居群內(nèi)；同時不同居群之間由于地理隔離，種子和花粉的廣泛傳播受到阻礙，貧乏的基因交流使居群內(nèi)遺傳變異大于居群間，使得居群間存在著遺傳分化。

3.3 聚類分析

15 個狗牙根居群的聚類分析結(jié)果表明各居群沒有完全按照地理來源進(jìn)行聚類，Mantel 檢驗(yàn)的結(jié)果也顯示遺傳距離與地理距離之間無相關(guān)性。288 份狗牙根材料的聚類分析結(jié)果表明，同一居群的材料或相鄰居群的材料有優(yōu)先聚類的趨勢，但沒有嚴(yán)格按照材料的地理來源進(jìn)行聚類，在劉杰［10］、劉偉［26］、周少云［8］等的研究中也檢測到這種情況。傳統(tǒng)的種群遺傳學(xué)主要是基于距離隔離理論（isolation by distance，IBD）來探討種群的遺傳結(jié)構(gòu)，該理論對解釋同一分布區(qū)域的不同種群存在高度的遺傳分化及種群的漸變樣式等存在不足［27-28］。研究發(fā)現(xiàn)不同種群因自然選擇壓力而導(dǎo)致的適應(yīng)性變異，對種群的遺傳結(jié)構(gòu)形成也具有重要影響［29-30］，由此建立了適應(yīng)性隔離理論（isolation by adaptation，IBA）。目前，IBD 和IBA 都被認(rèn)為是影響種群遺傳結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素，因此在今后的研究中，可以通過分析不同狗牙根居群的環(huán)境因子對居群遺傳分化的影響，揭示狗牙根種群遺傳分化的成因。

3.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

聚類分析和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析都能夠反映出供試材料的遺傳多樣性，相比聚類分析，群體遺傳結(jié)構(gòu)分析能夠更加清晰地反映出材料間的遺傳背景和基因交流情況，為后期進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析奠定基礎(chǔ)［31-32］。本研究基于貝葉斯模型的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析方法，將288 份狗牙根材料分為2 個亞群，與288 份狗牙根UPGMA 聚類分析結(jié)果基本一致。第1 亞群（144 份）和第2 亞群（96 份）Q值≥0.7，表明供試的288 份狗牙根中絕大多數(shù)材料遺傳背景單一，基因滲透較少。其余材料（48 份）的Q值＜0.7，屬于混合型群體，遺傳背景較為復(fù)雜，存在一定的種質(zhì)基因滲透。混合群體的形成在其他自交不親和、異花授粉的多年生植物中也曾有報道［33-34］，形成的原因可能是不同區(qū)域之間由于人及動物活動，或風(fēng)力傳播將狗牙根花粉、種子或匍匐莖等營養(yǎng)器官帶離原居群，造成種質(zhì)資源的交換和基因交流。群體遺傳結(jié)構(gòu)分析是進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的基礎(chǔ)，可以有效消除基因型與性狀之間的假關(guān)聯(lián)等不準(zhǔn)確因素［35-36］。本研究中供試的狗牙根群體遺傳結(jié)構(gòu)較簡單，遺傳變異較豐富，可以用于開展狗牙根重要性狀的關(guān)聯(lián)分析研究。

4 結(jié)論

本研究對河南省自然分布的狗牙根進(jìn)行遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，河南省狗牙根具有較高的遺傳多樣性，供試材料沒有嚴(yán)格按照地理來源進(jìn)行聚類，地理距離與遺傳距離不具有相關(guān)性，居群間存在較大的遺傳分化，Structure 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，河南省狗牙根存在一定的種質(zhì)基因滲透，遺傳背景較為復(fù)雜。本研究結(jié)果可以為河南省狗牙根的合理開發(fā)利用和新品種的培育奠定理論基礎(chǔ)。