王志恒，魏玉清，趙延蓉，王悅娟

（北方民族大學生物科學與工程學院，寧夏 銀川 750021）

干旱和鹽脅迫是限制植物生長發(fā)育和產量的兩大非生物逆境，也是我國西北干旱和半干旱地區(qū)農業(yè)發(fā)展的主要障礙之一［1］。植物對鹽分和干旱脅迫的響應機制是一個復雜的生物過程，植物會從生長發(fā)育、形態(tài)結構、生理生化、活性氧代謝、滲透調節(jié)、信號轉導、基因的表達調控、次生代謝產物、膜運輸和能量代謝等多個層次對脅迫做出響應［2-5］。以往植物耐鹽性和抗旱性的研究主要在生態(tài)學、生理學、生物化學和分子生物學水平上進行。近年來大量與干旱和鹽脅迫響應相關的基因和代謝途徑已被發(fā)現，這些脅迫響應基因涉及光合作用（1，5-二磷酸核酮糖、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸磷酸雙激酶）、水分運輸（水通道蛋白）、離子轉運（質膜H+-ATP 酶）、細胞膜完整性（脯氨酸、甜菜堿、甘露醇）、植物激素（脫落酸、生長素、細胞分裂素、赤霉素）、清除自由基（超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶）以及其他蛋白質（轉錄因子、蛋白激酶）等，以不同的方式幫助植物抵御干旱和鹽脅迫［6-8］。滲透調節(jié)和細胞壁相關基因的表達是玉米（Zea mays）幼苗耐旱性較強的主要原因［9］，玉米幼苗通過上調表達清除活性氧的過氧化物酶、谷胱甘肽基轉移酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶基因增強了其耐鹽性［10］；高粱（Sorghum bicolor）的類黃酮生物合成代謝途徑可能是其耐鹽性強弱的重要原因之一［11-12］，植物激素信號轉導、碳代謝、苯丙素的生物合成在甜高粱（Sorghum dochna）幼苗抵御干旱脅迫中起到主要作用［13］；鹽脅迫下，甜高粱幼苗根系通過編碼質膜ATPase 和液泡膜質子泵相關基因表達促進多余Na+的排出，并且清除活性氧的水通道蛋白和抗氧化劑基因也參與了鹽脅迫下甜高粱幼苗根系的拒鹽分子機制［14］；可見通過研究植物對不同非生物脅迫的耐受性是挖掘植物抗逆相關基因的常用策略。

甜高粱屬C4高光效植物，是普通粒用高粱的一個變種，具有抗逆性強、生長速度快、生物產量高等特點，作為飼料青貯后質地細軟，適口性極好，有較高的飼用價值，在我國西北地區(qū)種植前景廣闊［15-16］。目前對甜高粱的抗逆分子機制主要集中在抗旱或耐鹽基因挖掘方面，對于比較分析甜高粱在干旱和鹽脅迫下的生理變化和轉錄組測序分析方面研究較少。本研究以‘遼甜1 號’甜高粱為材料，通過測定中度干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗光合氣體交換參數、有機滲透調節(jié)物質、內源激素含量和抗氧化物酶活性變化，并采用RNA-seq 方法分析不同脅迫下的差異基因，比較其生物學功能及所參與的代謝途徑，期望在生理生化和分子水平上揭示甜高粱適應干旱和鹽脅迫的共同機制和不同機制，以期為甜高粱抗逆栽培和育種奠定研究基礎，這對于發(fā)展甜高粱作為草食家畜的優(yōu)質飼草具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

由遼寧省農業(yè)科學院提供‘遼甜1 號’甜高粱。

1.2 試驗處理

本試驗于2019 年7-9 月在北方民族大學植物逆境生理生態(tài)學實驗室進行。采用盆栽試驗方法，將種子用體積分數為10%的次氯酸鈉溶液浸泡20 min，用無菌水沖洗7～8 次，直至干凈無味，將種子移至裝有等量石英砂（直徑約為0.3 cm 左右）的塑料花盆中，每盆15 粒種子，后置于光照周期為光照12 h（25 ℃）/黑暗12 h（20 ℃）的室內智能人工氣候箱（上海博訊，BIC800）內進行光照培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每周更換1 次Hoagland 營養(yǎng)液。待苗四周齡時，每盆定苗8 株，根據前期預實驗結果，確定了10%的PEG-6000 和0.9%的NaCl 分別為甜高粱幼苗中度干旱和鹽脅迫濃度，在本試驗中共設置了3 個處理，分別為：1）對照（CK），正常施加Hoagland 營養(yǎng)液；2）干旱脅迫（drought，D），采用10%的PEG-6000 進行模擬中度干旱脅迫，將其與Hoagland 營養(yǎng)液混合后施加；3）鹽脅迫（salt，S），采用0.9%的NaCl 進行模擬中度鹽脅迫，將其與Hoagland 營養(yǎng)液混合后施加。在處理后的第2 天和第7 天，將甜高粱幼苗葉片包入錫箔紙，做好編號后用液氮速凍，貯存于-80 ℃超低溫冰箱中，用于內源激素含量、有機滲透調節(jié)物質和抗氧化物酶活性測定。

1.3 光合氣體交換參數

在試驗處理第2 天和第7 天的9：00-11：00，選擇甜高粱幼苗受光方向一致、大小相同的最上面完全展開葉，采用美國LI-COR 公司LI-6400XT 便攜式光合作用測定系統進行凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、氣孔導度（stomatal conductance，Gs）、胞間CO2濃度（intercellular CO2concentration，Ci）和蒸騰速率（transpiration rate，Tr）測定，設定溫度為25 ℃，Flow 值為500 μmol·s-1，CO2為400 μmol·mol-1，光強為1000 μmol·mol-2·s-1，具體參考郝正剛［16］的方法，重復3 次。

1.4 內源激素含量的測定

脫落酸（abscisic acid，ABA）、生長素（auxin，IAA）、細胞分裂素（cytokinin，CTK）含量通過中國農業(yè)大學提供的酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒進行測定［17］，重復3 次。

1.5 有機滲透調節(jié)物質含量的測定

使用北京索萊寶科技有限公司的試劑盒對可溶性糖和脯氨酸（proline，Pro）含量進行測定，采用考馬斯亮藍G-250 法測定可溶性蛋白含量，重復3 次。

1.6 抗氧化物酶活性的測定

采用氮藍四唑光還原法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；采用愈創(chuàng)木酚顯色法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性；采用紫外吸收比色法測定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性；參考孫云［18］的方法測定抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性；每個處理重復3 次。

1.7 轉錄組測序

在甜高粱幼苗處理第2 天和第7 天時，將新鮮葉片組織置入液氮中，送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，采用TRIzol（Invitrogen）法提取樣本中的總RNA，通過質量檢測進入Illumina Novaseq 6000 平臺進行測序，使用Illumina Truseq TM RNA sample prep Kit 方法進行文庫構建，將質控后的原始數據，即過濾后數據（clean data，reads），與參考基因組（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=sorghum）比對，獲得用于后續(xù)轉錄本組裝、表達量計算等的數據，同時對RNA-seq 的比對結果進行質量評估，轉錄組數據使用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司自主研發(fā)的云平臺進行分析。

1.8 差異基因的篩選

將樣品處理兩兩比較得到差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），使用DEG-Seq 軟件進行計算，使用FDR（false discover rate）作為篩選差異變量的評價指標體系矯正最后的P值，利用RSEM 得到的基因reads 數目數據開展差異表達計算DEGs，基因發(fā)生顯著差異表達的篩選標準為：表達倍數≥2、P-value＜0.05。

1.9 差異基因GO 和KEGG 富集分析

使用軟件Goatools 進行GO 富集分析，使用方法為Fisher 精確檢驗，當經過校正的P值≤0.05 時，認為此GO功能存在顯著富集情況。使用KOBAS（https://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do）進行KEGG 富集分析，計算原理同GO 富集分析，使用Fisher 精確檢驗進行計算，經過校正的P值以0.05 為閾值，滿足此條件的KEGG 通路定義為在差異表達基因中顯著富集的KEGG 通路。

1.10 實時熒光定量PCR 驗證

隨機挑選10 個差異基因，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成引物設計（表1）及合成，內參基因β-Actin，引物序列為：β-Actin-F AGATGGTGTCAGCCACACTG，β-Actin-R CGAGCTTCTCCTTCATGTCC，擴增體系：95 ℃3 min；95 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃40 s，35 個循環(huán)。

表1 差異基因引物序列Table 1 Differential gene primer sequences

1.11 數據處理與分析

利用Microsoft Office Excel 2016 進行數據統計處理，GraphPad Prism 5.0 進行作圖，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片光合氣體交換參數的變化

干旱和鹽脅迫下，甜高粱幼苗葉片Pn顯著下降，Gs和Tr也均低于CK，而Ci高于CK；Pn和Tr在CK 和干旱脅迫下隨脅迫時間延長呈逐漸升高趨勢，在鹽脅迫下呈逐漸降低趨勢；CK 處理的Gs隨脅迫時間的延長呈升高趨勢，干旱和鹽脅迫下呈逐漸降低趨勢；不同處理下的Ci隨脅迫時間的延長呈降低趨勢，其中鹽脅迫下降低幅度最大（圖1）。

圖1 干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片光合氣體交換參數的變化Fig.1 Changes in leaf photosynthetic parameters of sweet sorghum seedlings under drought and salt stress

2.2 干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片內源激素含量的變化

干旱和鹽脅迫下，甜高粱幼苗葉片ABA 含量均高于CK，其中鹽脅迫下最高，IAA 和CTK 含量均低于CK，其中鹽脅迫下均最低。ABA 含量在CK 和鹽脅迫下隨脅迫時間的延長呈降低趨勢，干旱脅迫下呈升高趨勢；IAA 含量在CK 處理下隨脅迫時間的延長呈降低趨勢，在干旱和鹽脅迫下呈升高趨勢；CTK 含量在CK 處理下隨脅迫時間的延長呈升高趨勢，在干旱和鹽脅迫下呈降低趨勢（圖2）。

圖2 干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片內源激素含量的變化Fig.2 Changes in leaf endogenous hormone content of sweet sorghum seedlings under drought and salt stress

2.3 干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片主要有機滲透調節(jié)物質含量的變化

干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片的可溶性糖、可溶性蛋白和Pro 含量均高于CK，并隨脅迫時間延長呈逐漸升高趨勢，其中干旱脅迫下可溶性糖含量顯著高于CK 和鹽脅迫，而可溶性蛋白和Pro 含量低于鹽脅迫，說明甜高粱幼苗在干旱脅迫下可溶性糖是其主要滲透調節(jié)物質，而鹽脅迫下可溶性蛋白和Pro 起主要滲透調節(jié)作用（圖3）。

圖3 干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片主要有機滲透調節(jié)物質含量的變化Fig.3 Changes in leaf osmotic adjustment substance content in sweet sorghum seedling under drought and salt stress

2.4 干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片抗氧化物酶活性的變化

干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片的SOD、POD、CAT 和APX 活性均高于CK，并隨脅迫時間延長呈逐漸升高趨勢，其中干旱脅迫下升高幅度低于鹽脅迫，說明甜高粱幼苗在鹽脅迫下活性氧產物多于干旱脅迫，因而抗氧化物酶活性較高，能夠清除多余的活性氧產物，從而減輕對甜高粱幼苗的傷害（圖4）。

圖4 干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片抗氧化物酶活性的變化Fig.4 Changes in leaf antioxidant enzyme activity of sweet sorghum seedlings under drought and salt stress

2.5 轉錄組測序數據評估

為了研究干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗基因表達情況的變化，分別對CK、D、S 處理2 和7 d 時甜高粱幼苗葉片進行RNA-seq，RNA-seq 共建立18 個cDNA 文庫，每個測序文庫的原始測序數據見表2。18 個樣品RNA-seq 過濾后數據為48330116～60983370，Q20值均超過98.29%，Q30值均超過94.98%，GC 含量為54.97%～57.72%，錯誤率不超過0.0226%，分別將各樣品的clean reads 與指定的參考基因組進行序列比對，比對率為95.88%～96.78%，測得的數據準確度較高，數據質量好，利于后期數據的分析。

表2 樣品測序和數據比對統計Table 2 Sample sequencing and data comparison statistics

2.6 差異基因篩選

干旱脅迫響應基因相關分析顯示（圖5），甜高粱幼苗在干旱脅迫2 d 時共有1897 個差異基因，包括922 個上調基因和975 個下調基因，干旱脅迫7 d 時共有211 個差異基因，其中包括157 個上調基因和54 個下調基因，CK 處理7 d 相比于2 d 產生861 個上調基因和556 個下調基因，在CK2_vs_D2 和CK7_vs_D7 兩組兩兩比較的重疊差異基因CK2_vs_CK7 相比有40 個差異表達基因，稱其為干旱脅迫響應基因。甜高粱幼苗在鹽脅迫2 d 時共有3761個差異基因，包括2047 個上調基因和1714 個下調基因，鹽脅迫7 d 時共有1517 個差異基因，其中包括795 個上調基因和722 個下調基因，在CK2_vs_S2 和CK7_vs_S7 兩組兩兩比較的重疊差異基因CK2_vs_CK7 相比有493 個差異表達基因，稱其為鹽脅迫響應基因。

圖5 差異表達基因統計和韋恩圖Fig.5 DEG statistics graph and Venn diagram

2.7 GO 富集分析

干旱脅迫響應基因GO 富集分析結果表明（圖6），在40 個干旱脅迫響應基因中共有31 個GO 條目顯著富集，其中生物過程包括24 個，分子功能包括7 個；而細胞組分無顯著富集的GO 條目，富集程度前10 的基因均分布在生物過程中，主要與脅迫響應相關。493 個鹽脅迫響應基因GO 富集分析表明共有16 個GO 條目顯著富集，生物過程包括15 個；分子功能包括1 個；而細胞組分無顯著富集的GO 條目，富集程度前10 的基因均分布在生物過程中，主要與脅迫響應相關。在干旱和鹽脅迫響應基因中，除了與干旱、鹽脅迫相關的“對水的響應（response to water）”“對鹽脅迫的響應（response to salt stress）”“對滲透脅迫的響應（response to osmotic stress）”等得到顯著富集外，其他非生物逆境脅迫響應途徑如：“對溫度刺激的響應（response to temperature stimulus）”“對光強度的響應（response to light intensity）”“對熱的響應（response to heat）”“對冷的響應（response to cold）”也在干旱或鹽脅迫響應基因中顯著富集，說明植物對不同的非生物逆境脅迫的響應是相互聯系且交織在一起的，植物可能會利用同一種響應機制來抵御不同的非生物逆境脅迫。

圖6 干旱和鹽脅迫響應差異基因GO 富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of DEG in response to drought and salt stress

2.8 KEGG 富集分析

干旱脅迫響應基因進行KEGG 富集分析表明，有2 個代謝通路顯著富集，分別為“內質網中的蛋白質加工（protein processing in endoplasmic reticulum）”和“剪接體（spliceosome）”，這2 個通路均屬于“遺傳信息加工”代謝通路（圖7）。將鹽脅迫響應基因進行KEGG 富集分析后只有1 個代謝通路顯著富集（圖7），為“植物激素信號轉導（plant hormone signal transduction）”，這個通路屬于“環(huán)境信息加工”代謝通路。表明甜高粱幼苗通過激活與干旱脅迫防御相關蛋白的表達和誘導參與碳水化合物代謝相關的基因表達來增強其滲透調節(jié)能力，維持細胞膨壓來響應干旱脅迫；而通過植物激素信號轉導來響應鹽脅迫。

圖7 干旱和鹽脅迫響應差異基因KEGG 富集分析Fig.7 KEGG enrichment analysis of DEG in response to drought and salt stress

2.9 干旱和鹽脅迫下的相關差異基因分析

根據RNA-seq 結果分析，甜高粱幼苗在干旱和鹽脅迫下有23 個差異基因定位到光合作用代謝途徑上，這些差異基因參與光系統I、光系統Ⅱ、細胞色素b6/f 復合體、光合電子傳遞鏈、ATP 酶、天線蛋白和碳同化（圖8A）。注釋導天線蛋白代謝通路的基因有Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4和Lhcb5；定位到光系統I 的基因有Psa D、Psa E、Psa O、Psa N、Psa G、Psa L、Psa F和Psa H；編碼光系統Ⅱ的基因主要有Psb P和Psb Y；參與光合電子傳遞途徑的差異表達基因主要有Pet E；編碼細胞色素b6/f 復合體的為Pet C；編碼ATP 酶的基因主要有delta和b；各有1個 基 因 編 碼 核 酮 糖-1，5- 二 磷 酸（ribulose-1，5-diphosphate，RuBP）、磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 羧 化 酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）、丙酮酸磷酸二 激酶（pyruvate orthophosphate dikinase，PPDK）和NADP-蘋果酸酶（NADP-malic enzyme，NADP-ME）。除了PEPC 外，其余注釋到光合作用上的基因整體表現為鹽脅迫下調幅度明顯高于干旱脅迫（圖2），干旱脅迫2 d 時大多數基因呈下調狀態(tài)，而在7 d 時則呈上調狀態(tài)，不過上調的幅度不如CK；PEPC 在干旱和鹽脅迫2 d 時基因下調，鹽脅迫基因下調倍數高于干旱脅迫，在處理7 d 時脅迫下PEPC 呈上調狀態(tài)，鹽脅迫下基因上調倍數最大。

海藻糖合成酶（trehalose synthase，TPS）能夠催化UDP-葡萄糖轉化為海藻糖-6-磷酸（trehalose-6-phosphate，T6P），在這個重要代謝通路中，干旱脅迫下甜高粱幼苗可能合成了大量的海藻糖（圖8B），脅迫2 和7 d 時4 個編碼TPS 的基因均全部上調表達；而鹽脅迫2 d 時3 個上調表達，1 個下調表達，7 d 時4 個均下調表達；在另一個關鍵通路T6P 被TPP 或者TPS 轉化為海藻糖的反應中，在干旱和鹽脅迫2 d 時均下調表達，7 d 時均上調表達，其中干旱脅迫下的上調幅度高于鹽脅迫。蔗糖也是常見的滲透調節(jié)物質之一，蔗糖合成酶（sucrose synthase，SUS）基因在干旱和鹽脅迫2 d 時均上調表達，7 d 時鹽脅迫上調表達，干旱脅迫下調表達，蔗糖-磷酸合成酶（sucrose phosphate synthetase，SPS）的2 個基因在干旱脅迫2 和7 d 的均上調表達，而鹽脅迫只有一個上調表達；在淀粉降解的相關代謝通路中，編碼α-葡聚糖磷酸化酶（α-glucan phosphorylase，glgP）和β-淀粉酶（βamylase，BAM）各有2 個基因，glgP 和BAM 基因在鹽脅迫下出現明顯上調現象，而干旱脅迫下大多為下調表達，表明鹽脅迫下淀粉的降解可能被加強。

參與活性氧清除的相關抗氧化物酶在植物抗逆性中起到重要作用，有2 個編碼SOD 基因和1 個編碼POD 基因在脅迫下均上調表達（圖8），其中編碼SOD 基因的1 個基因注釋到Cu-Zn 家族超氧化物歧化酶，1 個基因注釋到Cu-Mn 家族超氧化物歧化酶，編碼POD 基因的為POD-2C，編碼CAT 基因的為CAT-2和CAT-3，編碼APX的 基 因 為APX-1和APX-2，鹽 脅 迫 下 編 碼SOD 的2 個 基 因、POD 的1 個 基 因、CAT 的2 個 基 因 和APX 的2 個 基因上調幅度均高于干旱脅迫，相比于脅迫處理2 d，鹽脅迫處理7 d 時基因上調幅度明顯大于干旱脅迫，這一結果與抗氧化物酶活性的變化相符合。

圖8 干旱和鹽脅迫下的相關差異基因表達水平值熱圖Fig.8 Heat map of elated DEGs expression levels under drought and salt stress

植物激素信號轉導在植物對逆境脅迫的響應過程中起到至關重要的作用。根據RNA-seq 結果（圖8D～F），在ABA 信號轉導中，有2 個基因注釋到受體pyrabactin resistant/PYR-like（PYR/PYL）中，有6 個基因注釋到負調控因子2C 類蛋白磷酸酶（type 2C protein phosphates，PP2C）反應元件中，各有一個基因注釋到SNF1 相關的蛋白激酶2（SNF1-related protein kinase 2，SnRK2）和結合因子（ABRE binding factors，ABF）中；在注釋到IAA 信號轉導的14 個基因中，其中2 個基因注釋到gretchen Hagen3（GH3）中，有4 個基因注釋到small auxin-up RNA（SAUR）中，1 個基因注釋到auxin resistant 1（AUX1）上，1 個基因注釋到transport inhibitor response 1（TIR1）上，3個基因注釋到ARF 上，3 個基因注釋到auxin resistant 1/like aux 1（AUX/IAA）上；在注釋到CTK 信號轉導的14個基因中，其中1 個基因注釋到cytokinin response 1（CRE1）中，4 個 基 因 注 釋 到arabidopsis histidinephosphotransfer proteins（AHP）中，3 個基因注釋到Barabidopsis response regulators（B-ARR）中，6 個基因注釋到A-arabidopsis response regulators（A-ARR）中；注釋到植物激素信號通路的這些同源基因在不同處理中表達模式不同。

2.10 實時熒光定量PCR 驗證

為了進一步驗證RNA-seq 數據的準確性，隨機挑選10 個基因進行實時熒光定量PCR 的驗證，驗證基因的表達水平以2-△△CT方法計算。結果表明：通過RNAseq 確定的大多數基因的表達模式與qRT-PCR 所確定的相似，大多數RNA-seq 結果與qRT-PCR 結果顯著相關，相關系數為0.9193，P＜0.0001（圖9）。這些數據表明，RNA-seq 數據與本試驗中qRT-PCR 分析所確定的表達模式具有很好的一致性。

圖9 實時熒光定量PCR 驗證RNA-seq 數據Fig. 9 Real-time fluorescence quantitative PCR validation RNA-seq data

3 討論

植物響應干旱和鹽脅迫既有相同的機制也有不同的機制，基因作為植物應答環(huán)境脅迫的早期響應分子，對調控植物應對脅迫條件并逐漸適應起到關鍵作用，隨著組學技術的迅速發(fā)展，RNA-seq 在高粱抗逆性研究中得到廣泛應用［12-14，19-21］。本研究發(fā)現干旱和鹽脅迫2 d 時甜高粱差異基因數目分別是7 d 時的9.0 和2.5 倍，鹽脅迫2 和7 d 時差異基因數目是干旱脅迫的2.0 和7.2 倍，這表明甜高粱幼苗在脅迫2 d 時調動大量基因和生物學過程以響應脅迫，隨著脅迫時間的增加，干旱脅迫下差異基因的數量大幅度減少，并顯著高于鹽脅迫，說明甜高粱幼苗響應干旱脅迫的生物學過程達到一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)，而其對鹽脅迫的響應還沒達到穩(wěn)定狀態(tài)，說明甜高粱在轉錄水平上對鹽脅迫的適應穩(wěn)態(tài)落后于干旱脅迫。

基于GO 富集分析發(fā)現甜高粱在干旱和鹽處理下差異基因顯著富集于響應逆境脅迫調控；基于KEGG 富集分析發(fā)現甜高粱干旱脅迫響應基因顯著富集在內質網加工和剪接體上，內質網是調節(jié)蛋白質合成和折疊加工的場所，植物在非生物脅迫條件下會誘導內質網脅迫，剪接體變化能夠影響脅迫環(huán)境中植物mRNA 的穩(wěn)定性。鹽脅迫響應基因顯著富集于植物激素信號轉導途徑，說明甜高粱響應鹽脅迫的分子機制與激素信號轉導通路有關。甜高粱幼苗在響應干旱脅迫過程中能夠誘導參與碳水化合物代謝、次級代謝以及RNA 轉運相關的基因表達；激活與干旱脅迫防御和解毒相關蛋白的表達，有效維持蛋白加工和降解的平衡，同時增強了跨膜轉運離子，電子和蛋白以及細胞壁調節(jié)能力；有效地促進關鍵代謝物的合成代謝途徑（淀粉與蔗糖代謝和苯丙烷類生物合成），提高滲透調節(jié)能力和細胞膜穩(wěn)定性，從而更好地抵御干旱脅迫。而鹽脅迫下甜高粱幼苗通過調節(jié)植物激素提升植物抗氧化能力和減少細胞膜脂過氧化程度，植物激素作為重要的次級信號分子，可以激活抗氧化物酶基因的表達，從而提高抗氧化物酶活性，增強活性氧的清除能力［22］。

光合作用是植物生長發(fā)育和產量形成的重要生理過程，光合作用大多數能量來源于原初反應中捕光天線復合體（1ight harvesting complex，LHC）所吸收的光能，LHC 包括大部分葉綠素a 和全部葉綠素b 及類胡蘿卜素［23-24］。本研究中，有5 個基因注釋到光合作用-天線蛋白上，并且在脅迫條件下均呈下調表達，在鹽脅迫下這些基因的下調幅度高于干旱脅迫，這可能是由于為了維持鹽脅迫下細胞的生理生化活動，LHC 多個基因下調表達，從而降低光合速率適應脅迫環(huán)境，并且傷害越高基因下調倍數越大。RuBP、PEPC、PPDK 和NADP-ME 是碳同化過程的關鍵酶，大量研究發(fā)現C4植物在非生物脅迫下PEPC 活性增加，說明PEPC 的高表達可能有助于減緩脅迫引起的光合速率下降［25］。在本研究中，干旱和鹽脅迫下編碼RuBP 的基因呈下調狀態(tài)，但不同脅迫下基因的變化情況不同，總的來說隨著脅迫時間的延長，干旱脅迫編碼RuBP 的基因下調幅度縮小，而鹽脅迫的下調幅度增大，編碼PEPC 的基因在脅迫7 d 時呈上調變化，并且鹽脅迫下上調倍數最大，這些都表明干旱和鹽脅迫抑制了甜高粱幼苗的光合作用，并且鹽脅迫的抑制程度要高于干旱脅迫，這與光合生理參數的變化是相符合的。

植物內源激素作為信號分子參與調節(jié)植物生長發(fā)育過程，其含量變化在植物響應非生物脅迫中發(fā)揮重要作用［26］。當受到外界環(huán)境脅迫時，植物會產生大量的ABA，觸發(fā)ABA 誘導的下游生理過程［27］。在本研究中，干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片ABA 含量和編碼ABA 信號通路基因的表達不盡相同，脅迫2 d 時，干旱脅迫下葉片ABA 含量變化不顯著，鹽脅迫下ABA 含量顯著高于干旱脅迫和CK，CK 和干旱脅迫下編碼ABA 受體PYR/PYL、PP2C、ABF 和SnRK2 基因表達模式基本相同，而鹽脅迫下的編碼基因表達模式與CK 和干旱脅迫相反；脅迫7 d 時，干旱和鹽脅迫下葉片ABA 含量均顯著升高，其中鹽脅迫下ABA 含量顯著高于CK 和干旱脅迫，干旱脅迫 下 編 碼ABA 受 體PYR/PYL、SnRK2 和1 個PP2C 基 因 下 調 表 達，4 個 編 碼PP2C 和1 個 編 碼ABF 的 基 因 上 調表達，鹽脅迫下編碼ABA 受體PYR/PYL 基因下調表達，編碼PP2C、SnRK2 和ABF 基因均上調表達，CK 編碼ABA 信號通路的基因表達模式與鹽脅迫剛好相反；這可能是由于鹽脅迫早期，甜高粱通過上調ABA 合成基因NCED來促進ABA 的合成，從而減少氣孔導度和降低蒸騰速率來提高甜高粱幼苗的耐鹽能力。隨著脅迫時間的延長，甜高粱幼苗體內的ABA 積累過量，為了減少ABA 過量對其帶來的不利影響，甜高粱幼苗會通過激活ABA的負反饋調節(jié)機制來減少ABA 含量，當ABA 積累過量，會抑制ABA 受體蛋白PYR/PYL 基因表達，減少ABA與ABA 受體蛋白PYR/PYL 結合，PYR/PYL 不能與PP2C 互作，但PP2C 能與去磷酸化的SnRK2 結合，使SnRK2 處于失活狀態(tài)，無法磷酸化激活下游途徑，抑制下游ABA 應答基因調控網絡，從而減少ABA 的合成；因此推測甜高粱幼苗可能依賴植物激素ABA 相關調控來應答鹽脅迫，與鹽脅迫相比，干旱脅迫下基因的變化情況表現出不利于ABA 信號的轉導。

可溶性糖是植物應對干旱脅迫的主要有機滲透調節(jié)物質之一，具有維持滲透平衡和增強植物吸水的能力［28］。其中的海藻糖具有保護生物細胞、生物活性物質以及在脅迫中可以穩(wěn)定細胞膜結構和蛋白質的功能［29］。研究發(fā)現在干旱脅迫下木薯（Manihot esculenta）［28］、牛心樸子（Cynanchum komarovii）［30］、玉米［31］中的海藻糖起到主要滲透調節(jié)作用，Li 等［29］將OsTPS1導入到水稻（Oryza sativa）中，發(fā)現轉基因水稻的海藻糖含量顯著升高，從而提高轉基因水稻的抗逆性；Han 等［32］研究發(fā)現木薯葉片海藻糖含量與葉片持水能力呈正相關；項陽等［31］將酵母TPS1基因轉入玉米，干旱脅迫下轉基因玉米的根系生長情況和根系活力較野生型極顯著增加；以上結果均表明海藻糖合成相關基因的表達以及海藻糖的積累能夠提高植物的抗逆性。本研究中，在TPS 能夠催化UDP-葡萄糖轉化為T6P 這個重要代謝通路中，干旱脅迫上調的基因數目多于鹽脅迫，在下一個關鍵通路T6P 被TPP 或者TPS 轉化為海藻糖，基因上調表達的幅度在干旱脅迫下最高，同時生理數據也表明，干旱脅迫下甜高粱幼苗葉片的可溶性糖含量均顯著高于CK 和鹽脅迫，這表明糖代謝及其平衡在響應干旱脅迫中發(fā)揮重要作用，海藻糖等可溶性糖含量的大量增加增強了干旱脅迫下甜高粱幼苗的滲透調節(jié)能力。

逆境脅迫會導致植物細胞內活性氧的過量積累，過量的活性氧能啟動質膜過氧化連鎖反應，從而對細胞膜系統造成傷害，為了避免活性氧產物的過多積累，植物體內會產生SOD、POD、CAT 和APX 等抗氧化物酶清除多余活性氧產物，減輕對植物的傷害［33-34］。在本研究中，干旱和鹽脅迫下甜高粱幼苗葉片抗氧化物酶活性均升高，尤其是在鹽脅迫7 d 時葉片抗氧化物酶活性顯著高于CK，預示此時鹽脅迫已經導致甜高粱幼苗體內生理失調并積累大量活性氧產物，從而產生次級氧化脅迫，為了維持正常生理代謝活動，鹽脅迫下甜高粱幼苗通過更高的抗氧化物系統活性來清除多余活性氧產物，而在干旱脅迫下甜高粱幼苗葉片的抗氧化物酶活性均低于鹽脅迫，說明干旱脅迫對甜高粱幼苗造成的氧化脅迫低于鹽脅迫。進一步從轉錄水平來看，編碼抗氧化物酶的基因變化情況基本與酶活性變化表現一致，同時鹽脅迫下編碼抗氧化物酶的基因表達、抗氧化物酶活性變化與ABA 含量表現一致，表明脅迫下植物的ABA 與抗氧化物酶活性關系密切，這與Guo 等［35］關于ABA 可誘導相關抗氧化物酶基因的表達，提高抗氧化物酶活性的研究結論相吻合。鹽脅迫下甜高粱幼苗通過植物激素ABA 脅迫信號轉導來激活抗氧化物酶基因表達，提高抗氧化物酶活性，這些抗氧化物酶活性的變化和植物激素信號轉導的調控共同構成甜高粱幼苗抵御鹽脅迫的機制和策略。

4 結論

中度干旱和鹽脅迫下，甜高粱幼苗的生物過程具有共同的調控途徑，包括：下調光合氣體交換參數、積累有機滲透調節(jié)物質、增強抗氧化物酶活性以及調節(jié)ABA 等植物激素幫助甜高粱適應逆境脅迫；不同的機制包括：其在轉錄水平上對鹽脅迫的適應穩(wěn)態(tài)落后于干旱脅迫，中度脅迫下甜高粱幼苗對鹽脅迫的耐受性要低于干旱脅迫，可溶性糖在甜高粱幼苗抵御干旱脅迫中發(fā)揮重要作用，植物激素信號轉導和抗氧化物酶活性變化的共同調控是甜高粱幼苗對抗鹽脅迫的關鍵。