曲小姝，石 丹，趙 娜，于曉洋，楊艷艷，劉 巖

(吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

多金屬氧酸鹽(Polyoxometalates，POMs)，簡(jiǎn)稱(chēng)多酸，是由高價(jià)態(tài)的前過(guò)渡金屬通過(guò)氧原子橋連結(jié)合而成的金屬氧簇[1].幾十年來(lái)，隨著世界各國(guó)對(duì)多酸藥理活性和結(jié)構(gòu)修飾的研究不斷深入，多酸藥物化學(xué)蓬勃發(fā)展，其中最引人注目的是多酸抗腫瘤藥物的研究.多酸抗癌譜廣、抗腫瘤活性強(qiáng)、化合物本身毒性低，在抗腫瘤藥物領(lǐng)域有極高應(yīng)用價(jià)值[2-5].仲鎢酸鹽-B是一種經(jīng)典的同多酸，結(jié)構(gòu)式為[H2W12O42]10-，其具有良好的抗艾滋病毒活性[6-8].我們報(bào)道了一種新型仲鎢酸鹽-B化合物[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)過(guò)渡金屬Cu修飾后的仲鎢酸鹽藥理活性顯著增強(qiáng)[9-10]，這說(shuō)明化合物中Cu和W12簇為雙活性抗腫瘤中心.文獻(xiàn)記載很多金屬配合物具有生物活性，如過(guò)渡金屬鋅配合物在抗腫瘤研究方面受到廣泛關(guān)注[11-13].本文采用常規(guī)水溶液合成方法，以仲鎢酸鹽-B為基本建筑單元，利用過(guò)渡金屬鋅作為連接子，構(gòu)筑基于仲鎢酸鹽-B的雙活性中心新化合物 (H3O)6[Zn(H2O)6]6{Zn6(C5H11NO)6(H2O)6[H2W12O42]3}·4H2O (簡(jiǎn)寫(xiě)為ZnW12)，選擇HeLa、HepG2、SHY5Y、SKOV-3 4種腫瘤細(xì)胞對(duì)其體外抗腫瘤活性進(jìn)行了研究.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：Bruker Smart CCD Apex(Ⅱ)型單晶衍射儀；AlpHa Centaurt FT/IR型紅外光譜分析儀；美國(guó)TA Q600同步熱分析儀；日本Olympus倒置相差顯微鏡；BIORAD公司680型酶標(biāo)儀.

試劑：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 (MTT) 購(gòu)自美國(guó)sigma公司；胎牛血清(Fetal bovine Serum)、RPMI 1640 (pH在7.0～7.2之間)、胰蛋白酶(trypsin)均購(gòu)自Gibco公司；雙抗(青霉素鈉、硫酸鏈霉素)購(gòu)自西安制藥公司；其他化學(xué)試劑均為分析純.HeLa、HepG2、SHY5Y和SKOV-3細(xì)胞株為吉林醫(yī)藥學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存并提供.

1.2 化合物的制備

稱(chēng)取Na2WO4·2H2O (2.30 g，6.96 mmol) 溶于100 mL水中，用稀H2SO4調(diào)pH值至4.16.稱(chēng)取Zn(NO3)2·6H2O (2.56 g，8.61 mmol) 溶于50 mL水中，將鎢酸鈉溶液與硝酸鋅溶液緩慢混合，用甲基嗎啉溶液 (酸化到pH等于4.22) 和HOAc-NaAc溶液 (pH為 4.36) 調(diào)節(jié)pH至3.4左右，常溫?cái)嚢?0 min，冷卻至室溫，靜置，20 d后出現(xiàn)無(wú)色塊狀晶體.

1.3 X-射線(xiàn)單晶衍射測(cè)試

選取大小為0.279×0.181×0.183 mm3的單晶，采用Mo-Kα(λ=0.071 073 nm)為輻射源，室溫296 K下，用Bruker Smart CCD Apex(Ⅱ)衍射儀，掃描范圍1.65°<θ<25°.應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)吸收校正.共收集29 071個(gè)衍射數(shù)據(jù)(獨(dú)立衍射點(diǎn)6 916，Rint=0.054 6[I>2σ(I)，hkl值范圍：-29≤h≤30，-30≤k≤19，-37≤l≤36].晶體結(jié)構(gòu)用直接法解出，對(duì)全部非氫原子及其各向異性熱參數(shù)進(jìn)行全矩陣最小二乘法修正，氫原子坐標(biāo)采用理論加氫方法得到，最終偏離因子R1=0.028 0，wR2=0.072 3[I>2σ(I)；R1=0.035 3，wR2=0.074 8 (all data).結(jié)構(gòu)分析表明，該晶體屬于三方晶系，空間群R-3m：H，a=2.443 48 (7) nm，b=2.443 48 (7) nm，c=3.045 86 (19) nm，α=90 (3)°，β=90 (3)°，γ=120 (2)°，V=15.749 2 (13) nm3，Z=3.結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式為C30H66N6O190W42Zn6，相對(duì)分子質(zhì)量為11 664.81.所有計(jì)算均使用SHELXTL-2018/3 (Sheldrick，2018) 程序完成.

1.4 MTT法測(cè)腫瘤細(xì)胞活力

把對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa、SKOV-3、HepG2和SHY5Y細(xì)胞調(diào)成密度為1×105個(gè)/mL，在96孔培養(yǎng)板中每孔加入200 μL密度為1×105個(gè)/mL的腫瘤細(xì)胞懸液，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，24 h后把腫瘤細(xì)胞分成空白對(duì)照組及6組實(shí)驗(yàn)組(濃度為0.1，1，10，20，50及100 μmol/L的藥物)，用DMEM培養(yǎng)基稀釋液分別培養(yǎng)24 h.培養(yǎng)結(jié)束，每孔加入新鮮配制的MTT溶液20 μL并再孵育4 h，當(dāng)在倒置顯微鏡下看到孔板內(nèi)的細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn)絲狀紫色結(jié)晶體時(shí)倒掉上清液，每孔加DMSO150 μL振蕩溶解細(xì)胞并用平板搖床搖勻，在波長(zhǎng)570 nm使用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值(OD).按以下公式計(jì)算增殖抑制率：增殖抑制率=[1-藥物試驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值]×100%.重復(fù)試驗(yàn) 3次，取平均值.

1.5 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa、SKOV-3、HepG2和SHY5Y細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，去上清液，將細(xì)胞分成正常對(duì)照組以及濃度為0.1，1，10，20，50及100 μmol/L的ZnW121—6組，4種腫瘤細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基稀釋液培養(yǎng)24 h后，與正常對(duì)照組一起于倒置顯微鏡下觀察不同濃度藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，從生長(zhǎng)抑制、細(xì)胞形態(tài)角度進(jìn)行評(píng)估.

2 結(jié)果與討論

2.1 晶體結(jié)構(gòu)

X-射線(xiàn)晶體學(xué)研究表明，ZnW12中仲鎢酸鹽陰離子[H2W12O42]10-通過(guò)Zn八面體連接成了二維結(jié)構(gòu)，游離態(tài)的配陽(yáng)離子[Zn(H2O)6]2+和結(jié)晶水存在于晶格之間.如圖1所示，在[H2W12O42]10-陰離子中，W—O鍵可分為3種類(lèi)型：(1)端氧W—O(t)鍵長(zhǎng)范圍為0.171 3(10)～0.242 7(7) nm；(2)橋氧W—O(μ)鍵長(zhǎng)范圍為0.176 8(7)～0.215 7(6) nm；(3)鍵連到3個(gè)鎢原子上的橋氧W—O鍵長(zhǎng)范圍為0.228 1(9)～0.222 8(6) nm.化合物中Zn原子呈6配位八面體構(gòu)型，分別和4個(gè)來(lái)自[H2W12O42]10-的O，1個(gè)配位水上的O以及1個(gè)甲基嗎啉分子上的O配位.如圖2所示，從c軸方向看，3個(gè)W12簇通過(guò)Zn八面體連接而成一個(gè)三角形的小環(huán)，小環(huán)之間又通過(guò)Zn八面體的連接以及W12簇的共用連接形成了二維層結(jié)構(gòu).二維層結(jié)構(gòu)中含有由12個(gè)W—O八面體連接而成的大環(huán)，形成了圓形的孔洞，其間容納著6個(gè)椅式構(gòu)象的甲基嗎啉分子.值得一提的是，結(jié)構(gòu)中還存在另一種Zn2+原子，與6個(gè)配位水配位形成了八面體構(gòu)型，孤立存在于鎢簇構(gòu)成的二維層間.二維層之間是孤立的，在三維空間錯(cuò)位排列，從c軸方向觀察化合物具有孔洞，其間容納著游離水.

圖1 Zn修飾的[H2W12O42]10-陰離子球棍圖

綠色：鎢氧八面體；紫色：鋅氧八面體

2.2 紅外光譜

圖3 ZnW12的紅外光譜

2.3 熱重分析

合成化合物的熱重分析如圖4所示，在TG曲線(xiàn)中，化合物共有3步連續(xù)失重：47 ℃～118 ℃，118 ℃～148 ℃和148 ℃～447 ℃，分別對(duì)應(yīng)于結(jié)晶水、配位水和有機(jī)物甲基嗎啉的失去.達(dá)到665 ℃后，多酸骨架開(kāi)始坍塌，最后炙灼殘?jiān)鼮閃和Zn的氧化物.實(shí)際失重量為15.44%，與理論計(jì)算值15.07%基本一致，說(shuō)明熱重分析與晶體結(jié)構(gòu)表征吻合.

圖4 ZnW12的TG曲線(xiàn)

2.4 MTT法測(cè)腫瘤細(xì)胞活力

采用MTT法評(píng)估了ZnW12對(duì)HeLa、SKOV-3、HepG2和SHY5Y腫瘤細(xì)胞株增殖的影響(見(jiàn)表1).與對(duì)照組比較，不同濃度的ZnW12對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率增大，表明ZnW12對(duì)4種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，且隨著濃度的增加細(xì)胞的存活率下降，具有藥物劑量依賴(lài)性，與母體酸Na10(H2W12O42)·26H2O (簡(jiǎn)寫(xiě)為NaW12) 相比[10]，經(jīng)過(guò)渡金屬鋅修飾的仲鎢酸鹽抗腫瘤活性顯著增強(qiáng).

表1 不同濃度NaW12和ZnW12處理腫瘤細(xì)胞的抑制率和IC50

2.5 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察

分別用濃度1，10，20，50及100 μmol/L的ZnW12處理腫瘤24 h后，觀察細(xì)胞形態(tài).圖5顯示正常對(duì)照組的腫瘤細(xì)胞緊貼瓶底，細(xì)胞密集，細(xì)胞間連接緊密，呈有規(guī)則的多邊形，細(xì)胞觸角較短，圓形細(xì)胞較少.ZnW12處理后，細(xì)胞較為稀疏，附壁疏松，脫壁，細(xì)胞變圓變亮.

a—d：對(duì)照組；e：50 μmol/L ZnW12處理的HeLa；f：20 μmol/L ZnW12處理的SKOV-3；g：50 μmol/L ZnW12處理的HepG2；h：20 μmol/L ZnW12處理的SHY5Y

3 結(jié)論

本文基于分子設(shè)計(jì)的思想，利用常規(guī)水溶液合成方法，合成了一種由過(guò)渡金屬鋅修飾的新型仲鎢酸鹽.通過(guò)X-射線(xiàn)單晶衍射、紅外光譜和熱重分析對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，同時(shí)對(duì)其體外抗腫瘤性質(zhì)進(jìn)行了初步研究.MTT細(xì)胞活性檢測(cè)說(shuō)明，ZnW12對(duì)HeLa、SKOV-3、HepG2和SHY5Y腫瘤細(xì)胞增殖均有抑制作用，IC50遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于未經(jīng)鋅修飾的母體多酸，這表明過(guò)渡金屬鋅修飾的仲鎢酸鹽具有雙活性抗腫瘤中心，藥理活性顯著增強(qiáng).