黃 宇，趙漢君，蘇立杰，陳 婕，阮小芬，姚軼立，王肖龍，薛金貴

近年來，隨著人口高齡化和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，動脈粥樣硬化(AS)所致的心血管疾病(atherosclerotic cardiovasculardisease，ASCVD)死亡率及發(fā)病率逐步升高[1]，亟須深入闡明其發(fā)病機(jī)制進(jìn)而優(yōu)化治療措施。AS產(chǎn)生機(jī)制復(fù)雜，但目前普遍認(rèn)為與內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)等相關(guān)[2-5]。中醫(yī)藥具有作用多靶點、多途徑且安全有效的優(yōu)勢，越來越被臨床重視。益氣活血化痰方(黃連9 g，生黃芪30 g，丹參20 g，水蛭12 g，全瓜蔞15 g)為本院治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的經(jīng)驗方，經(jīng)過15年的臨床應(yīng)用，療效顯著。近年來課題組研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血化痰方抗AS作用可能與其改善內(nèi)皮功能、減輕炎癥反應(yīng)等機(jī)制有關(guān)，但其具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。本研究通過細(xì)胞實驗和生物信息學(xué)方法，驗證巨噬細(xì)胞外泌體miRNA-let-7-5p/TAB2信號通路，探尋益氣活血化痰方抗AS可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 無血清培養(yǎng)基(GIBCO，31800022)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、胎牛血清(FBS)購自南京拜睿生物科技有限公司，培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿(Corning)，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)由北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)提供，CD63、CD81、β-actin、TAB2(ABcam)，臺盼藍(lán)、結(jié)晶紫、胰酶、鎢磷酸(Sigma)，96孔板、6孔板(AXYgen)，轉(zhuǎn)染試劑盒、2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、免疫沉淀(IP)細(xì)胞裂解液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，miR-28-3p mimic、miR-28-3p NC購自吉凱基因，Luria-Bertani(LB)固體培養(yǎng)基(Solarbio，L1015)，LB液體培養(yǎng)基(Solarbio，L1010)，甲醇(MP)，十二烷基硫酸鈉(SDS，Bio-Rad，161-0302)，凝膠前體(AP，Bio-Rad，161-0700)，甘氨酸(Tris，Bio-Rad，161-0719)，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)，脫脂奶粉(伊利)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(生物工程有限公司)，無水乙醇、氯仿、異丙醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，胎牛血清(GIBCO，10270-106)，焦碳酸二乙酯(Sigma)，實驗無特定病原體(SPF)級雄性ApoE-/-小鼠(8周齡，體重20～25 g，所有小鼠提前飼養(yǎng)7 d以適應(yīng))。

1.2 儀器 超凈工作臺(蘇州凈化，SW-CJ-1FD)，高速冷凍離心機(jī)(德國，Eppendorf)，小型離心機(jī)(長沙湘瑞)，2.5 μL、10 μL、200 μL、1 000 μL移液器(德國，Eppendorf)，振蕩器(上海滬西分析儀器，WH-2)，立式壓力鍋(上海博訊，YXQ-LS-50)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海圣欣，101AS-3)，酶標(biāo)儀(Rayto，RT-6000)，顯微鏡(日本，OLYMPUS，CX23)，二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(日本，SANYO，XD-101)，脫水機(jī)(Leica，ASP 200)，凝膠成像分析儀(Biorad)，納米孔板(Corning)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與構(gòu)建AS模型細(xì)胞 小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7(ATCC公司)于50 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)接種。無血清培養(yǎng)饑餓12 h后分為兩組，A組只加入PBS觀察24 h；B組加入ox-LDL 60 μg/mL誘導(dǎo)24 h。

1.3.2 外泌體的提取 取對數(shù)生長期RAW 264.7細(xì)胞接種，培養(yǎng)并去除FBS 中外泌體后再次培養(yǎng)48 h，試劑盒提取外泌體。測定外泌體的大小和濃度(qNano法)。通過免疫印跡實驗檢測外泌體標(biāo)記表達(dá)。

1.3.3 蛋白免疫印跡(Western Blot)實驗

1.3.3.1 蛋白樣品制備 根據(jù)細(xì)胞量加入IP裂解液200 μL、重懸細(xì)胞后離心，轉(zhuǎn)移上清轉(zhuǎn)液至1.5 mL離心管中放置于-80 ℃保存。

1.3.3.2 BCA法測定蛋白濃度 將標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清蛋白稀釋后配制BCA工作液，于37 ℃放置半小時，測定吸光度值計算得出蛋白濃度。

1.3.3.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 采取去離子水封閉所配制的10%分離膠表面，待膠凝結(jié)后加入上樣緩沖液混勻，煮沸后冰浴中冷卻。分次在80 V恒壓、分離膠電泳電壓120 V條件下電泳。取預(yù)先配置的1 L轉(zhuǎn)移緩沖液冷卻至4 ℃，PVDF膜于甲醇內(nèi)浸泡，置于轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡10 min，夾心法排列于電泳槽中200 mA恒流轉(zhuǎn)移。

1.3.3.4 免疫印跡 封閉及抗原抗體反應(yīng)：將PVDF膜置于平皿中，放入5%脫脂奶粉的封閉液，搖床振蕩封閉；用TBST洗膜10 min×3次；將膜置于含一抗稀釋液CD63(稀釋比例1∶1 500)、CD81(稀釋比例1∶1 000)、β-actin(稀釋比例1∶5 000)的平皿中，4 ℃搖床振蕩孵育12 h；取出置于室溫振蕩，棄置一抗，TBST洗10 min×3次；用TBST稀釋二抗(稀釋比例1∶10 000)，室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)；等二抗反應(yīng)結(jié)束，回收二抗。再次TBST洗膜3次。

顯色：采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒內(nèi)A、B兩種液體，等體積混合；取出TBST中PVDF膜，加合適工作液后保鮮膜覆蓋；然后將其移入凝膠成像分析儀中曝光顯影。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)

1.4.1 總RNA提取 于樣本中加入1 mL的Trizol放于冰上。在超凈臺中溫育5 min，12 000 r/min離心10 min。吸取上清液置于新離心管中并加入200 μL的氯仿，搖勻，室溫靜置2 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min。再次采吸上清液置于新1.5 mL離心管中并加入600 μL異丙醇混合，室溫靜置15 min，4 ℃，12 000 r/min，離心15 min，棄上清。加入1 mL 75 %的無水乙醇(750 μL無水乙醇和250 μL焦碳酸二乙酯水)漂洗沉淀，4 ℃，12 000 r/min，離心5 min，棄上清。加入1 mL無水乙醇，漂洗沉淀，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，棄上清，室溫干燥10 min。融入40 μL的焦碳酸二乙酯水，放在-80 ℃冰箱留存。

1.4.2 反轉(zhuǎn)錄 反轉(zhuǎn)錄以總RNA為模板，以隨機(jī)引物為反轉(zhuǎn)錄引物，進(jìn)行第一鏈cDNA合成，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因(采用Takara公司M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒)。所有操作遵循廠商提供的說明書進(jìn)行，所有樣本總RNA同一批反轉(zhuǎn)錄。

1.4.3 RT-qPCR檢測 RT-qPCR在Stepone Plus system (Applied Biosystems，F(xiàn)oster city，CA)上進(jìn)行，定量所用試劑為2×SYBR Green real-time PCR master mix。以GAPDH為內(nèi)參基因，均采用反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物作為模板進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)來檢測其表達(dá)量改變，反應(yīng)體系參考說明書。

1.5 雙熒光素酶報告基因檢測 取下游TAB2 3′-UTR插入pGL3雙熒光素酶miRNA靶表達(dá)載體，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增miRNA-let-7-5p的3′-UTR及其突變的3′-UTR，形成目標(biāo)突變體。人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC，2×104cells/well)分3份接種于12孔板，靜置至細(xì)胞密度達(dá)80%左右時，轉(zhuǎn)染熒光素酶報告質(zhì)粒。使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒將miRNA-let-7-5p模擬物或?qū)φ战M(50 nmol/L)和報告質(zhì)粒(100 ng/mL)共轉(zhuǎn)染至HAEC中。轉(zhuǎn)染36 h后測定熒光素酶活性。

1.6 AS動物模型的構(gòu)建 實驗組以高脂飼料(脂肪21.8%、膽固醇1.25%、標(biāo)準(zhǔn)飼料76.95%)喂養(yǎng)，對照組采用普通飼料喂養(yǎng)，每只小鼠5 g/d，早晚各飼養(yǎng)1次，小鼠喂養(yǎng)1周后隨機(jī)取1只處死，取小鼠主動脈根部至主動脈弓部的血管，常規(guī)脫水，石蠟包埋并切片，通過蘇木精-伊紅(HE)染色觀察AS程度(鏡下可見血管內(nèi)膜增生與明顯的脂質(zhì)條紋突起為成功標(biāo)記)。

1.7 動物分組和給藥方法 將小鼠隨機(jī)分為正常對照組、AS模型組、AS模型+益氣活血化痰方組。建模成功后第1周，AS模型+益氣活血化痰方組開始給予益氣活血化痰方干預(yù)，按照動物與人體間的等效劑量換算[6]，以等效劑量為標(biāo)準(zhǔn)，按照每20 g小鼠給予1 mL，給予益氣活血化痰方浸膏水溶劑生藥量為14.14 g/kg。正常對照組和AS模型組給予等量蒸餾水。小鼠每日定時灌胃1次(3周為1個療程)，每療程干預(yù)后停止給藥1周，共干預(yù)3個療程。

1.8 基因芯片篩選 小鼠大動脈組織基因芯片篩選：按上述方法，從正常對照組、AS模型組、AS模型+益氣活血化痰方組中每組隨機(jī)抽取3只小鼠的大動脈組織切片，篩選后續(xù)基因芯片。

基因芯片篩選方法：提取總RNA，用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，按照順序依次標(biāo)記合格RNA后，再結(jié)合miRNA芯片雜交，經(jīng)過洗脫和離心，得到干燥芯片。應(yīng)用高分辨率芯片掃描儀采集圖像，Genepix Pro 6.0分析數(shù)據(jù)輸出至Excel中，使用局部回歸方法扣除背景值，LOWESS方法進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化處理，采用平均連接和歐氏距離的層級法進(jìn)行聚類分析，后進(jìn)行靶基因預(yù)測及基因本體(GO)和Pathway富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 外泌體的鑒定 用SBI抽提試劑盒提取巨噬細(xì)胞RAW 264.7與AS模型細(xì)胞培養(yǎng)基中外泌體，后用Western Blot法檢測外泌體表面標(biāo)記物CD63及CD81的蛋白表達(dá)水平鑒定外泌體(見圖1)，對照組(RAW264.7+PBS)與AS模型組細(xì)胞上清液中CD61與CD81幾乎沒有表達(dá)，而對照組(RAW264.7+PBS)與AS模型組提取的外泌體中CD61與CD81均高表達(dá)。表明外泌體提取成功。

圖1 Western Blot法檢測外泌體表面蛋白標(biāo)記物CD61與CD81的表達(dá)情況

2.2 外泌體 miRNA qPCR Array與生物信息學(xué)分析 外泌體內(nèi)含miRNA，通過檢索3個與AS相關(guān)的數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)有12個miRNA共存在于這3個數(shù)據(jù)庫(見圖2)。通過芯片分析這12個miRNA在外泌體中的表達(dá)(見圖3)，與對照組相比，外泌體組有4個miRNA(miRNA-885、miRNA-21、miRNA-451與miRNA-let-7-5p)表達(dá)異常。外泌體與HAEC共培育后，RT-qPCR檢測miRNA表達(dá)(見表1)，與HAEC組相比，在外泌體與HAEC共培養(yǎng)組僅有miRNA-let-7-5p顯著表達(dá)。因此，選擇miRNA-let-7-5p作為后續(xù)的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。

圖2 生物信息學(xué)分析AS相關(guān)的miRNA

圖3 芯片分析miRNA的表達(dá)差異(圖中miR即miRNA)

表1 miRNA在HAEC和外泌體+HAEC中的表達(dá)差異(±s)

2.3 明確外泌體中差異表達(dá)的miRNA-let-7-5p對靶基因TAB2的調(diào)控機(jī)制 采用生物信息學(xué)剖析差異miRNA調(diào)控的靶向基因。運用雙熒光素酶報告基因方案驗證差異miRNA與預(yù)測的靶向基因之間聯(lián)系(見表2)，TAB2為miRNA-let-7-5p的靶基因。進(jìn)而探究miRNA-let-7-5p對TAB2的調(diào)控關(guān)系，過表達(dá)miRNA-let-7-5p后采用Western Blot法驗證TAB2在HAEC中表達(dá)(見圖4)，HAEC內(nèi)過表達(dá)的miRNA-let-7-5p抑制了TAB2的表達(dá)。

表2 雙熒光素酶基因報告檢測miRNA-let-7-5p的靶基因(Rluc/Luc比值)

圖4 Western Blot法檢測miRNA-let-7-5p對TAB2的調(diào)控作用(Control為主動脈內(nèi)皮細(xì)胞+miRNA等量安慰劑組；NC為主動脈內(nèi)皮細(xì)胞組；mimic為miRNA-let-7-5p模擬組)

2.4 動物模型大動脈組織基因芯片篩選 通過篩選AS模型組、AS模型+益氣活血化痰方組大動脈組織基因芯片，尋找差異性基因，發(fā)現(xiàn)miRNA-let-7-5p為具有差異性miRNA(見圖5)。其中差異基因mRNA的Pathway分析結(jié)果顯示，差異mRNA參與的通路中存在與炎癥反應(yīng)相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)通路，并且NF-κB通路中TAB2是主要的目標(biāo)mRNA(見圖6)。

圖5 AS模型+益氣活血化痰方組與AS模型組差異miRNA篩選

圖6 AS模型+益氣活血化痰方組與AS模型組差異mRNA參與的通路

3 討 論

據(jù)以往統(tǒng)計，缺血性疾病名列全世界死亡原因前茅[7]，其最主要的病理基礎(chǔ)為AS。眾多研究結(jié)果認(rèn)為AS的形成和發(fā)展進(jìn)程本質(zhì)上是一種血管內(nèi)皮慢性炎癥反應(yīng)，其中包括：①血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell，ECs)在一些損傷因素的影響下活化，釋放多種炎性因子進(jìn)入外周血循環(huán)；②經(jīng)過各種細(xì)胞因子的刺激誘導(dǎo)，外周血中單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖，從而引導(dǎo)ox-LDL聚積形成泡沫細(xì)胞；③而平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMCs)刺激后逐步生成纖維帽，隨泡沫細(xì)胞的匯集而壞死崩解構(gòu)成粥樣斑塊[8-12]。由此可見，在AS的進(jìn)展過程中，巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞作用關(guān)鍵。

研究顯示，體內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞均能分泌直徑為50～150 nm的微囊泡即外泌體，其攜帶mRNA、miRNA、lncRNA和蛋白質(zhì)等內(nèi)容物，在細(xì)胞間起通訊介質(zhì)的作用，進(jìn)而介入絕大部分生理和病理過程[13]，被認(rèn)為是除接觸依賴信號傳導(dǎo)和可溶性分子介導(dǎo)傳導(dǎo)外，最新發(fā)現(xiàn)的第3種細(xì)胞間信息傳遞形式[14]。有文獻(xiàn)報道，在AS發(fā)生過程中，巨噬細(xì)胞來源的外泌體攜帶大量促炎miRNA(miR-19、miR-21、miR-133、miR-155)等[15]。另有文獻(xiàn)報道，巨噬細(xì)胞遭刺激后，其外泌體中miR-150的分泌增加，從而調(diào)控C-Myb蛋白表達(dá)，加強內(nèi)皮細(xì)胞遷移。與此同時，AS病人血中分泌的外泌體中亦富含miR-150，這些外泌體與健康人外泌體對比，更能夠增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移[16]。通過外泌體的形式進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞凋亡和遷移，證實miRNA可以誘發(fā)AS發(fā)生[17]。

本研究首先通過細(xì)胞實驗成功提取巨噬細(xì)胞外泌體。然后通過檢索3個與AS相關(guān)的數(shù)據(jù)庫，獲得12個miRNA共存在于這3個數(shù)據(jù)庫。然后通過芯片分析這12個miRNA在外泌體中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)外泌體組有4個miRNA(miRNA-885、miRNA-21、miRNA-451與miRNA-let-7-5p)表達(dá)異常。進(jìn)一步將外泌體與HAEC共培育后，發(fā)現(xiàn)只有miRNA-let-7-5p在外泌體與HAEC共培育組中顯著表達(dá)。這充分表明miRNA-let-7-5p可能參與AS中外泌體與內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)控過程。隨后，運用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，進(jìn)一步驗證TAB2為miRNA-let-7-5p的靶基因，且在HAEC中過表達(dá)miRNA-let-7-5p抑制了TAB2的表達(dá)。

Dai等[18-19]在體外細(xì)胞試驗中證實miR-199a-3p可以抑制血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。在AS過程中，血管內(nèi)皮生長因子可由巨噬細(xì)胞等多種血管壁細(xì)胞產(chǎn)生并釋放，作為重要的細(xì)胞因子刺激巨噬細(xì)胞吞噬功能的激活、血管內(nèi)皮細(xì)胞的翻轉(zhuǎn)、血管平滑肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)型和遷移等過程。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-let-7-5p能夠大幅度下調(diào)經(jīng)γ-干擾素(IFN-γ)激活的巨噬細(xì)胞中促炎癥細(xì)胞因子，以及中度下調(diào)經(jīng)白細(xì)胞介素-4(IL-4)激活的巨噬細(xì)胞中部分抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這也可能是其發(fā)揮抗AS作用的一種新機(jī)制。而多項研究發(fā)現(xiàn)，TAB2能通過阻斷NF-κB激活和血管炎癥延緩AS進(jìn)展[20-21]。這些均提示miRNA-let-7-5p可能通過靶向調(diào)控TAB2發(fā)揮抗AS作用。

本研究通過與前期預(yù)實驗益氣活血化痰方干預(yù)過的小鼠大動脈組織芯片進(jìn)行比對，尋找差異性基因結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-let-7-5p和TAB2均為差異性基因。提示益氣活血化痰方可能通過巨噬細(xì)胞外泌體miRNA-let-7-5p/TAB2的信號通路發(fā)揮抗AS作用，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚需更深入的研究來證實。