王佩華，張桂梅，王慧楠，楊子燁，陳夢(mèng)雨，姜明瑞，岳珠珠，王志成，張婧秋，王英姿

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京102488)

千金子為大戟科植物續(xù)隨子(EuphorbialathyrisL.)的干燥成熟種子[1]，含有脂肪油、二萜、甾醇、黃酮、香豆素、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分[2]。二萜醇酯類化合物是其主要活性成分，具有瀉下逐水、祛斑美白、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等多種藥理作用，其中千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3是含量相對(duì)較高且具有顯著藥理活性的二萜醇酯類成分[3-4]。千金子二萜醇酯類成分的傳統(tǒng)提取方法主要有回流提取法、冷浸提取法和超聲提取法等，這些方法存在有效成分富集效率低、試劑用量大、耗時(shí)繁瑣等缺點(diǎn)[5-7]。而閃式提取法具有提取快速、無(wú)需加熱、有效成分損失少等優(yōu)點(diǎn)，廣泛適用于中藥根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等的提取[8-9]，目前未見(jiàn)閃式提取千金子二萜醇酯類成分的報(bào)道。

響應(yīng)面法是一種綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，將因素與指標(biāo)的相互關(guān)系用多元二次回歸多項(xiàng)式方程近似擬合，可有效指導(dǎo)工藝參數(shù)的優(yōu)化[10-11]。熵權(quán)法是一種確定指標(biāo)權(quán)重的客觀賦權(quán)法，可用于確定多指標(biāo)評(píng)價(jià)系統(tǒng)中各指標(biāo)權(quán)重[12-13]。2020版《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)千金子中千金子甾醇(即千金子素L1)的含量進(jìn)行了規(guī)定[1]，因此，作者選用千金子中主要的二萜醇酯類成分千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3為指標(biāo)成分，以料液比(g∶mL，下同)、提取時(shí)間、提取電壓為考察因素，通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法結(jié)合熵權(quán)法對(duì)千金子二萜醇酯類成分的閃式提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為千金子二萜醇酯類成分的提取提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

千金子藥材，購(gòu)自安徽亳州，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為大戟科植物續(xù)隨子(EuphorbialathyrisL.)的干燥成熟種子。

千金子素L1對(duì)照品(批號(hào)111789-200901)、千金子素L2對(duì)照品(批號(hào)111790-200901)、千金子素L3對(duì)照品(批號(hào)111791-200901)，純度均大于98%，中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇，質(zhì)譜純，F(xiàn)isher公司；乙醇，化學(xué)純，北京虹湖聯(lián)合化工產(chǎn)品有限公司。

閃式提取器，北京金鼎科技發(fā)展有限公司；高效液相色譜儀，美國(guó)Thermo Fisher；KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；BSI10型萬(wàn)分之一電子天平，德國(guó)Sartorius。

1.2 千金子二萜醇酯類成分的提取

精密稱取一定量的千金子加入閃式提取器中，在一定條件下提取，減壓抽濾，收集濾液，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中定容至刻度，即得提取液。

1.3 千金子二萜醇酯類成分含量的測(cè)定

1.3.1 對(duì)照溶液的配制

分別精密稱取千金子素L1對(duì)照品5.13 mg、千金子素L2對(duì)照品5.12 mg、千金子素L3對(duì)照品5.08 mg，加甲醇溶解并定容至5 mL容量瓶中，搖勻，即得1.026 mg·mL-1千金子素L1、1.024 mg·mL-1千金子素L2、1.016 mg·mL-1千金子素L3的對(duì)照儲(chǔ)備液，臨用前用甲醇稀釋成相應(yīng)濃度的對(duì)照溶液。

1.3.2 供試溶液的配制

精密量取提取液0.5 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，取續(xù)濾液作為供試溶液。

1.3.3 色譜條件

ODS-3 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫程序：0～5 min，75%A；5～35 min，75%～70%A；35～45 min，70%～85%A；45～60 min，85%～90%A；60～65 min，90%～75%A；檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm；流速1 mL·min-1；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

各對(duì)照溶液及供試溶液的HPLC圖譜如圖1所示。

圖1 千金子素L1對(duì)照溶液(a)、千金子素L2對(duì)照溶液(b)、千金子素L3對(duì)照溶液(c)及供試溶液(d)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC spectra of standard solution of euphorbia factor L1(a),euphorbia factor L2(b) and euphorbia factor L3(c)，and test solution(d)

1.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)及單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用Design-Expert 10.0軟件進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，以料液比、提取時(shí)間、提取電壓為考察因素，以提取液中千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3通過(guò)熵權(quán)法計(jì)算的綜合評(píng)分(Y)為響應(yīng)值。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

1.5 綜合評(píng)分的計(jì)算

采用熵權(quán)法計(jì)算指標(biāo)的權(quán)重，先將各指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，根據(jù)公式(1)計(jì)算第j個(gè)指標(biāo)的信息熵Ej，根據(jù)公式(2)計(jì)算j指標(biāo)的權(quán)重Wj，再根據(jù)公式(3)計(jì)算j指標(biāo)的綜合評(píng)分Y。

(1)

(2)

Y=千金子素L1的提取率×千金子素L1的權(quán)重+千金子素L2的提取率×千金子素L2的權(quán)重+千金子素L3的提取率×千金子素L3的權(quán)重

(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系

分別精密移取適量各對(duì)照儲(chǔ)備液，加甲醇稀釋成6個(gè)濃度的對(duì)照溶液，按1.3.3色譜條件進(jìn)樣分析。以對(duì)照溶液濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合結(jié)果如表2所示。

表2 千金子素L1、千金子素L2 、千金子素L3的線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of euphorbia factor L1,euphorbia factor L2，and euphorbia factor L3

由表2可知，各成分在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度

精密移取千金子素L1對(duì)照儲(chǔ)備液1.500 mL、千金子素L2對(duì)照儲(chǔ)備液0.625 mL、千金子素L3對(duì)照儲(chǔ)備液1.250 mL于5 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得0.308 mg·mL-1千金子素L1、0.128 mg·mL-1千金子素L2、0.254 mg·mL-1千金子素L3的混合對(duì)照溶液，按1.3.3色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3峰面積的RSD值分別為0.26%、1.20%、1.08%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性

取同一供試溶液6份，按1.3.3色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3的平均提取率分別為0.49%、0.19%、0.43%，RSD值分別為1.90%、2.55%、1.23%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性

取同一供試溶液，分別室溫放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后，按1.3.3色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3峰面積的RSD值分別為0.30%、0.29%、0.20%，表明供試溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加標(biāo)回收率

取已知含量的供試溶液6份各0.25 mL，按千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3含量的100%水平精密加入混合對(duì)照溶液0.25 mL，按1.3.2方法制備供試溶液，按1.3.3色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3的平均加標(biāo)回收率分別為103.22%、98.33%、97.76%，RSD值分別為1.22%、0.75%、1.14%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(表3)

表3 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.3 Design and results of Box-Behnken response surface methodologies

2.2.2 回歸模型方程與方差分析

通過(guò)Design-Expert 10.0軟件對(duì)表3中的綜合評(píng)分進(jìn)行多元二次回歸擬合，得回歸模型方程：Y=-5.36757+0.20140A+0.027576B+0.066837C+0.00741401AB-0.000814960AC-0.000461503BC-0.00409654A2-0.013082B2-0.000210412C2。對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示。

表4 回歸模型的方差分析Tab.4 Variance analysis of regression model

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

利用Design-Expert 10.0軟件根據(jù)模型繪制各因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面圖與等高線圖，如圖2所示。

響應(yīng)面和等高線可以直觀形象地反映各因素的交互作用，響應(yīng)面越陡峭，說(shuō)明兩因素的交互作用越顯著[15]；等高線的形狀越趨于橢圓說(shuō)明交互作用越顯著，越趨于圓形說(shuō)明交互作用越不顯著[16]。由圖2可知，料液比與提取電壓的響應(yīng)面最陡峭，且等高線呈橢圓形，表明料液比與提取電壓的交互作用對(duì)千金子二萜醇酯類成分提取率的影響最顯著；其次是料液比與提取時(shí)間的響應(yīng)面較陡峭，表明料液比與提取時(shí)間的交互作用對(duì)千金子二萜醇酯類成分提取率有一定程度的影響；而提取時(shí)間與提取電壓的響應(yīng)面最平緩，表明提取時(shí)間與提取電壓的交互作用對(duì)千金子二萜醇酯類成分提取率的影響不顯著。

圖2 各因素交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.2 Response surface plots and contour plots for effect of interaction between each factor on comprehensive score

根據(jù)Design-Expert 10.0軟件優(yōu)化分析得到千金子二萜醇酯類成分的最佳閃式提取工藝為：料液比1∶14.021(g∶mL)、提取時(shí)間2.5 min、提取電壓128.932 V，此條件下，3種二萜醇酯類成分提取率綜合評(píng)分的預(yù)測(cè)值為0.396。

2.2.4 最佳工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由于儀器精度等條件的限制，將最佳閃式提取工藝調(diào)整為：料液比1∶14(g∶mL)、提取時(shí)間2.5 min、提取電壓130 V，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到3種二萜醇酯類成分提取率綜合評(píng)分的平均值為0.370(RSD=0.412%)，證明該模型選擇合理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果理想。

3 結(jié)論

采用Box-Behnken響應(yīng)面法結(jié)合熵權(quán)法對(duì)千金子二萜醇酯類成分的閃式提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取工藝為：料液比1∶14(g∶mL)、提取時(shí)間2.5 min、提取電壓130 V，在此條件下，3種二萜醇酯類成分提取率的綜合評(píng)分為0.370，與模擬預(yù)測(cè)值(0.396)接近。閃式提取方法簡(jiǎn)便、節(jié)能、省時(shí)，可應(yīng)用于千金子主要二萜醇酯類成分的快速提取，對(duì)二萜醇酯類成分的深入研究及千金子的開(kāi)發(fā)利用具有十分重要的意義。