劉俊果，陳 敏，張 弘，吳立強(qiáng)

(1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.華北制藥股份有限公司，河北 石家莊 050015；3.保定九孚生化有限公司，河北 保定 072150)

利普司他汀(結(jié)構(gòu)式見圖1)是由毒三素鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種次級代謝產(chǎn)物，具有胰脂肪酶抑制活性[1-2]，能有效減少脂肪的分解和吸收。利普司他汀的四氫衍生物奧利司他(Orlistat) 已被羅氏公司成功開發(fā)為減肥藥賽尼可[3-4]，是目前唯一一個作為非中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用而上市的治療肥胖癥的減肥藥物[5-6]，在促進(jìn)肥胖患者體重降低的同時能有效改善由肥胖癥帶來的心血管等疾病的困擾，且安全性和耐受性良好[7]。

圖1 利普司他汀的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of Lipstatin

硅膠柱層析法分離效果好，操作簡單，易于實現(xiàn)工業(yè)化，是目前分離純化一些生化產(chǎn)物的主流方法[8-9]，如白藜蘆醇、平貝總堿等。作者從毒三素鏈霉菌的發(fā)酵液中獲得利普司他汀粗品，采用硅膠柱層析法對利普司他汀相品進(jìn)行分離純化，考察洗脫劑配比、洗脫體積、洗脫流速、載樣量等參數(shù)[10-11]對利普司他汀純度和回收率的影響，以期為利普司他汀的分離純化研究提供理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

利普司他汀粗品(色譜純度66.917%)，自制。

正庚烷、丙酮，分析純，天津永大化學(xué)試劑有限公司；乙腈，色譜純，F(xiàn)isher Chemical；甲酸，色譜純，鵬發(fā)化工有限公司；蒸餾水，自制。

LC-PDA型高效液相色譜儀，島津企業(yè)管理(中國)有限公司；KQ-250B型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；玻璃層析柱(Φ45 mm×200 mm)。

1.2 濕法裝柱

硅膠活化：取60 g硅膠(120目)，于120 ℃烘箱中干燥0.5 h，加入正庚烷充分?jǐn)嚢杈鶆?，常溫下浸? h，備用。

裝柱和平衡：在層析柱內(nèi)加入高約 100 mm的正庚烷，打開閥門使之緩慢流出，充分潤洗柱子；將活化好的硅膠攪拌均勻，超聲10 min，沿玻璃棒一次性轉(zhuǎn)入層析柱內(nèi)，自然沉降，并用橡膠錘輕敲柱壁，趕走氣泡，裝實硅膠；在層析柱上層塞一團(tuán)脫脂棉，防止上樣時沖壞硅膠表面；用正庚烷淋洗至柱平衡。

1.3 硅膠柱層析純化

稱取一定量的利普司他汀粗品，用無水正庚烷溶解，配制成濃度為250 g·L-1的樣品溶液，均勻加入層析柱中，加入洗脫劑進(jìn)行柱層析，收集洗脫液；60 ℃下減壓蒸餾濃縮回收洗脫劑，濃縮物用甲醇定容，采用HPLC法測定洗脫液中利普司他汀的純度及回收率。分別考察洗脫劑配比、洗脫體積、洗脫流速及載樣量對利普司他汀的純度及回收率的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 利普司他汀粗品除油相后的雜質(zhì)分析

利普司他汀粗品用乙腈除油相后蒸干溶劑，溶解并過濾后進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 利普司他汀粗品除油相后的HPLC圖譜Fig.2 HPLC spectrum of crude Lipstatin after oil phase removal

由圖2可知，利普司他汀是極性較弱的物質(zhì)，雜質(zhì)1#～9#先于利普司他汀主峰出峰，說明其極性弱于利普司他??；雜質(zhì)10#～12#后于利普司他汀主峰出峰，說明其極性強(qiáng)于利普司他汀。雜質(zhì)1#～12#的相對保留時間分別為0.24、0.28、0.40、0.50、0.69、0.71、0.75、0.82、0.95、1.10、1.20、1.50，含量分別為1.221%、1.383%、1.252%、1.320%、0.977%、1.704%、14.989%、1.271%、0.578%、0.055%、2.467%、0.807%。利普司他汀粗品用乙腈除油相后的純度為66.917%，即為硅膠柱層析上樣的純度。

2.2 洗脫劑配比的確定

根據(jù)利普司他汀的極性、溶劑沸點、后續(xù)溶劑回收等，選取丙酮-正庚烷作為洗脫劑。用1 BV正庚烷平衡層析柱，然后按3%的載樣量(以硅膠質(zhì)量計，下同)慢慢且均勻加入樣品溶液，上樣結(jié)束后分別用6 BV的5%丙酮-正庚烷、10%丙酮-正庚烷、15%丙酮-正庚烷、20%丙酮-正庚烷、30%丙酮-正庚烷洗脫，洗脫流速為1 BV·h-1，收集洗脫液，采用HPLC法測定洗脫液中利普司他汀的純度及回收率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 洗脫劑配比對利普司他汀層析效果的影響Fig.3 Effect of eluent ratio on chromatography effect of Lipstatin

由圖3可知，以5%丙酮-正庚烷、10%丙酮-正庚烷為洗脫劑時，洗脫液中利普司他汀的純度和回收率均較低，大部分利普司他汀吸附于硅膠上，沒有被完全洗脫下來；以15%丙酮-正庚烷為洗脫劑時，利普司他汀純度為80.358%，回收率為81.88%；繼續(xù)增加丙酮比例，利普司他汀的純度逐漸降低，回收率逐漸升高，雖然以30%丙酮-正庚烷為洗脫劑時，利普司他汀回收率高達(dá)92.00%，但更多的雜質(zhì)也隨之被洗脫下來，導(dǎo)致純度僅為66.266%。綜合考慮，選擇15%丙酮-正庚烷洗脫利普司他汀組分。

2.3 洗脫體積及洗脫曲線

由2.1可知利普司他汀粗品除油相后有弱極性雜質(zhì)存在，根據(jù)2.2洗脫結(jié)果，可先分別用1 BV的5%丙酮-正庚烷、10%丙酮-正庚烷洗脫非極性及弱極性雜質(zhì)；然后用7 BV的15%丙酮-正庚烷洗脫硅膠柱上的利普司他汀組分，直至把大部分利普司他汀洗脫下來；最后用2 BV的30%丙酮-正庚烷洗脫強(qiáng)極性雜質(zhì)。按2.2條件上樣，按上述程序梯度洗脫，洗脫流速為1 BV·h-1，然后按1 BV 1個餾分分段收集洗脫液，采用HPLC法測定洗脫液中利普司他汀的純度及回收率，洗脫曲線如圖4所示。

圖4 利普司他汀的洗脫曲線Fig.4 Elution curve of Lipstatin

由圖4可知，餾分1和2洗脫出來的大部分是非極性或弱極性雜質(zhì)，硅膠上依舊吸附大量的利普司他??；餾分3洗脫出極少量的利普司他汀，為洗脫過渡段；餾分4將部分利普司他汀洗脫下來；餾分5、6的洗脫量最大，將大部分利普司他汀洗脫下來；餾分7～9的洗脫量減少，只將殘留的利普司他汀洗脫下來。餾分4～8中利普司他汀的純度及回收率呈先升高后降低的趨勢，且純度較高，說明利普司他汀主要是由15%丙酮-正庚烷洗脫劑洗脫下來的；餾分9～11中利普司他汀的純度及回收率迅速降低，說明層析柱中硅膠吸附的利普司他汀絕大部分已經(jīng)被洗脫下來，后續(xù)主要是由30%丙酮-正庚烷洗脫劑洗脫極性較強(qiáng)的雜質(zhì)。表明，上述梯度洗脫程序能較好地分離利普司他汀。在餾分接收過程中，將餾分 1～3合并，為弱極性組分段；餾分4～8合并，為利普司他汀組分段；餾分9～11合并，為較強(qiáng)極性組分段。

2.4 洗脫流速的確定

按2.3洗脫條件，保持其它條件不變，分別以洗脫流速0.5 BV·h-1、0.75 BV·h-1、1.0 BV·h-1、1.5 BV·h-1洗脫，分段收集，合并餾分4～8，采用HPLC法測定洗脫液中利普司他汀的純度及回收率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 洗脫流速對利普司他汀純度及回收率的影響Fig.5 Effect of elution flow rate on purity and recovery of Lipstatin

由圖5可知，洗脫流速為0.5 BV·h-1時，利普司他汀的純度及回收率均較低，且分離時間較長，分離效果較差；而洗脫流速為1.5 BV·h-1時，由于流速過快使兩相間的濃度難以分配平衡，分離效果也不理想；雖然洗脫流速為0.75 BV·h-1、1.0 BV·h-1時，純度相差不大，但1.0 BV·h-1的洗脫流速可能較快，導(dǎo)致洗脫量較少，回收率較低。綜合考慮，選擇洗脫流速為0.75 BV·h-1。

2.5 載樣量的確定

在硅膠柱層析分離的工業(yè)生產(chǎn)中，在保證純化效果的基礎(chǔ)上一般選用最大的載樣量。分別選用1%、3%、5%、10%的載樣量，洗脫流速為0.75 BV·h-1，其它條件不變，采用HPLC法測定洗脫液中利普司他汀的純度及回收率，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，載樣量為1%時，利普司他汀的純度及回收率均較低，且上樣量過低造成硅膠及洗脫劑的浪費；載樣量為3%、5%時，能夠較好地分離純化利普司他汀，但與3%載樣量相比，5%載樣量時的純度較低；而載樣量為10%時，由于超出了硅膠的負(fù)荷量，不能將大部分利普司他汀洗脫下來，導(dǎo)致純度及回收率均較低。綜合考慮，選擇載樣量為3%。

圖6 載樣量對利普司他汀純度及回收率的影響Fig.6 Effect of loading amount on purity and recovery of Lipstatin

2.6 硅膠柱層析純化前后的雜質(zhì)分析

將2.3中收集的餾分4～8合并，過濾后進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖7所示。

圖7 硅膠柱層析純化后利普司他汀的HPLC圖譜Fig.7 HPLC spectrum of Lipstatin purified by silica gel column chromatography

由圖7可知，雜質(zhì)1#、2#、3#、4#、5#、7#、8#、9#、11#、12#的相對保留時間分別為0.24、0.28、0.40、0.50、0.69、0.75、0.82、0.95、1.20、1.50，含量分別為0.191%、0.163%、1.202%、0.298%、2.020%、4.357%、1.546%、0.578%、0.239%、0.772%。

利普司他汀屬于酯類物質(zhì)，通過硅膠柱層析法可去除微生物代謝過程中產(chǎn)生的水溶性和脂溶性色素。與硅膠柱層析前利普司他汀除油相后的HPLC圖譜相比較，經(jīng)硅膠柱層析純化后，雜質(zhì)1#、2#、3#、4#、7#、9#能部分去除，雜質(zhì)5#、8#有所增加，雜質(zhì)6#、10#能完全去除，除雜效果顯著，利普司他汀純度達(dá)到80.499%。

3 結(jié)論

采用硅膠柱層析法對利普司他汀粗品進(jìn)行分離純化，確定最佳純化工藝條件如下：以120目硅膠為固定相，依次用1 BV 5%丙酮-正庚烷、1 BV 10%丙酮-正庚烷、7 BV 15%丙酮-正庚烷、2 BV 30%丙酮-正庚烷梯度洗脫，洗脫流速為0.75 BV·h-1，載樣量為3%，收集7 BV 15%丙酮-正庚烷的洗脫液。在此條件下，利普司他汀純度可達(dá)80.499%。該工藝除雜效果明顯，有利于后續(xù)工序分離純化得到高純度的利普司他汀。