張銀英,朱靜祎,潘裕添,2,林志超,2,吳啟賜,3*
(1.閩南師范大學(xué)菌物產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)中心,福建 漳州 363000;2.福建省菌類活性物質(zhì)工程技術(shù)研究中心,福建 漳州 363000;3.福建伯利賽克萊生物科技有限公司,福建 漳州 363000)
靈芝(Ganoderma lucidum)是世界名貴的食藥兩用菌,具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1].據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載“靈芝不燥不寒無毒,益心氣,助心充脈,補(bǔ)中,好顏色,增智慧,利關(guān)節(jié),久食輕身不老,延年神仙”[2].靈芝多糖(Ganoderma lucidumpolysaccharide,GLP)存在于靈芝的菌絲體和子實(shí)體中,是靈芝的主要活性成分,目前已分離出200 多種靈芝多糖[3].構(gòu)成靈芝多糖的結(jié)構(gòu)單體除葡萄糖外,大多還有阿拉伯糖、木糖、半乳糖、巖藻糖、甘露糖、鼠李糖等單糖,單體間通過不同比例和類型的糖苷鍵連接而成,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,因而具有豐富的生物學(xué)活性.據(jù)報(bào)道,靈芝多糖有免疫調(diào)節(jié)[4]、抗腫瘤[5]、降血糖及抗糖尿病及其并發(fā)癥[6-9]、抗炎[10]、抗菌[11]、抗氧化[12],促進(jìn)腸上皮細(xì)胞修復(fù)[13]等功能,在國內(nèi)外被廣泛關(guān)注和應(yīng)用.
研究表明具有多種生物活性的多糖絕大多數(shù)是水溶性的,多糖結(jié)構(gòu)會(huì)直接或間接地影響其活性[14].通過化學(xué)改性,如羧甲基化、乙?;?、硫酸化、磷酸化等修飾手段,使多糖發(fā)生衍生化或轉(zhuǎn)化.一方面,可以改善水溶性,提高生物活性,甚至可以開拓新的生物學(xué)功能;另一方面,提高多糖水溶性還可以減少因多糖溶解所導(dǎo)致的時(shí)間和能量消耗,提高效率.因此,水不溶性多糖的改性研究對于改變多糖的性質(zhì)和生物活性具有重要意義.
羧甲基化是指向多糖中引入羧甲基官能團(tuán),進(jìn)而提高多糖的水溶性和生物活性[15-19].本文采用堿溶性GLP 為原料,通過羧甲基化修飾,得到水溶性的羧甲基化靈芝多糖CM-GLP,并對不同取代度(degree of substitution,DS)的CM-GLP 進(jìn)行了溶解性和紅外光譜分析,探索其體外抗氧化活性,研究結(jié)果可為堿溶性多糖的拓展應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù).
GLP,福建省菌類活性物質(zhì)工程技術(shù)研究中心;氯乙酸,上海麥克林生化科技有限公司;透析袋MD77(3.5 kDμ),美國Viskase.其余試劑均為市售分析純,現(xiàn)配現(xiàn)用.
恒溫水浴鍋(RE-2002),鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)設(shè)備(EV 322),北京萊伯泰科儀器股份有限公司;電子天平(TX323L),梅特勒-托利多儀器有限公司;pH 計(jì)(TX323L),梅特勒-托利多儀器有限公司;數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(85-2A),金壇市江南儀器廠;紫外可見分光光度計(jì)(UV-3200PC),上海美譜達(dá)儀器有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱(101 型),永光明醫(yī)療儀器有限公司;高速冷凍離心機(jī)(Centrifuge 5810 R),德國Eppendorf 公司;真空冷凍干燥機(jī)(LG-0.2),新陽速凍設(shè)備制造有限公司;紅外光譜掃描儀(NICOLET IS10),美國Nicolet公司.
1.3.1 羧甲基靈芝多糖的制備及其制備工藝優(yōu)化
按照蘆昶通等人的方法[20]適當(dāng)修改.1 g靈芝多糖溶解在120 mL的NaOH 溶液中,室溫下堿化1 h.堿化結(jié)束后,將氯乙酸溶解于80 mL異丙醇中,然后邊攪拌邊緩慢滴加至上述反應(yīng)液中,放入水浴鍋醚化2 h.反應(yīng)結(jié)束后,室溫萃取,棄除上層醇液,收集下層水相,加入4 倍體積95%乙醇進(jìn)行沉淀,靜置12 h.離心,沉淀用少量純水溶解,再用10%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 至中性,再次加入4 倍體積的95%乙醇,沉淀8 h,抽濾,95%乙醇洗滌沉淀兩次.將沉淀溶于少量純水,4 ℃純水透析48 h,經(jīng)凍干得羧甲基靈芝多糖CM-GLP.
(1)單因素實(shí)驗(yàn)
(a)氯乙酸用量
固定醚化時(shí)間2 h、醚化溫度60 ℃、NaOH 濃度為4.5 mol/L,考察氯乙酸用量(分別為2.6、3、3.4、3.8、4.2、4.6 g)對CM-GLP取代度的影響.
(b)醚化溫度
固定醚化時(shí)間2 h、氯乙酸用量為3.4 g、NaOH濃度為4.5 mol/L,考察醚化溫度分別為(30、40、50、60、70、80 ℃)對CM-GLP取代度的影響.
(c)NaOH濃度
固定醚化時(shí)間2 h、氯乙酸用量為3.4 g、醚化溫度為60 ℃,考察NaOH 濃度(分別為3.5、4、4.5、5、5.5、6 mol/L)對CM-GLP取代度的影響.
(2)正交試驗(yàn)
以CM-GLP 的取代度為指標(biāo),根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選取對取代度影響較大的三個(gè)因素即氯乙酸用量(A),NaOH 溶液濃度(B),醚化溫度(C)和其中三個(gè)最優(yōu)水平進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn),進(jìn)而確定靈芝多糖羧甲基化的最佳工藝參數(shù).其優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1.
表1 CM-GLP羧甲基化工藝優(yōu)化的因素水平表Tab.1 Orthogonal factors and levels table of carboxymethylation process of CM-GLP
1.3.2 CM-GLP取代度
按照蘆昶通等[20]的方法,取0.05 g CM-GLP 溶解在20 mL 標(biāo)準(zhǔn)HCl 溶液(0.1 mol/L)中,配制標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液(0.1 mol/L)并用其來滴定溶解好的溶液,記錄V1,V2.DS計(jì)算如下:
其中,V1:滴定過程中pH=2.1 時(shí)使用NaOH 溶液體積;V2:滴定過程中pH=4.3 時(shí)使用NaOH 溶液體積;m:CM-GLP質(zhì)量/g;C:NaOH溶液濃度/(mol/L).
1.3.3 溶解性測定
根據(jù)2020 版《中國藥典》凡例項(xiàng)下溶解度測定方法,稍作修改,分別稱取100 mg GLP 和不同取代度CM-GLP加入含有10 mL純水的試管中,室溫下充分振搖再靜置30 min,觀察樣品在純水中的溶解情況.
1.3.4 紅外光譜分析
采用KBr壓片法進(jìn)行紅外光譜分析[21].CM-GLP和GLP樣品與KBr粉末經(jīng)紅外干燥4 h,將1 mg樣品均勻混合至100 mg KBr 中,充分研磨后壓片,上機(jī)掃描,光譜范圍:4 000~400 cm-1,分辨率4 cm-1,掃描16次.
1.3.5 體外抗氧化性分析
(1)溶液配制
分別稱取100 mg 不同取代度的CM-GLP,溶于10 mL 純水中,配制成濃度為10 mg/mL 的母液,經(jīng)稀釋得質(zhì)量濃度為0.1、0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL的樣品溶液.
(2)羥基自由基(?OH)清除能力
羥基自由基清除能力測定根據(jù)文獻(xiàn)方法略作修改[22].取6根試管,分別依次加入2 mL CM-GLP溶液、2 mL 2 mmoL/L 的FeSO4溶液、2 mL 2 mmoL/L 的水楊酸溶液和1 mL 2 mmoL/L 的H2O2溶液,充分振蕩均勻后,室溫下避光靜置30 min,分光光度計(jì)測定(波長為510 nm)其吸光度值(A1).空白組用蒸餾水替代樣品溶液,吸光度值(A0);對照組用蒸餾水替代H2O2,吸光度值(A2).以維生素C(VC)為陽性對照,按照CMGLP濃度梯度繪制變化曲線.
?OH清除率公式如式(3)所示:
其中,A0:空白組;A1:樣品組;A2:對照組.
(3)總還原力
總還原力測定根據(jù)文獻(xiàn)方法略作修改[23].將1 mL樣品添加到干燥試管中,加入2.5 mL磷酸緩沖液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液.將反應(yīng)液充分振蕩混合,50°C 水浴加熱20 min,然后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸,混合均勻,室溫下離心(8 000 rpm,10 min).取2.5 mL 上清液,加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 0.1%氯化鐵溶液,充分振蕩混勻,避光靜置10 min,分光光度計(jì)測定(波長為700 nm)樣品溶液吸光度值(A1),空白組用蒸餾水替代樣品溶液,其余處理同上,測定吸光度(A0).以VC為陽性對照,按照CM-GLP 濃度梯度繪制變化曲線.
總還原力公式(4)為:
其中,A0:空白組;A1:樣品組.
1.3.6 數(shù)據(jù)處理方法
所有實(shí)驗(yàn)都至少3次處理,所有數(shù)據(jù)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.采用SPSS Statistics 26.0軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素顯著性分析,P<0.05表示結(jié)果顯著,并用不同字母標(biāo)示.
2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)
(1)氯乙酸用量的影響
考察氯乙酸用量對CM-GLP 取代度的影響,結(jié)果如圖1所示,隨氯乙酸用量的增加,羧甲基取代度呈先增加后減小的趨勢.當(dāng)氯乙酸用量為3.4 g 時(shí),CM-GLP 取代度到達(dá)最高值為4.72.在NaOH 堿化GLP過程中,由于加入的堿量一定,因此形成的多糖鈉鹽活性中心一定[24],當(dāng)氯乙酸用量增加時(shí),氯乙酸與GLP的活性中心相互碰撞的機(jī)率也會(huì)增加,所以CM-GLP的取代度增大;然而氯乙酸用量太高時(shí),多余的氯乙酸會(huì)與堿反應(yīng),從而改變整個(gè)堿性環(huán)境體系,堿性變?nèi)?,可能?dǎo)致兩種趨勢:一方面,醚化反應(yīng)速率逐漸降低,副反應(yīng)逐漸增加,因此羧甲基取代度降低,另一方面,堿溶性多糖溶解度下降,也可能導(dǎo)致反應(yīng)速率下降,所以選取3.4 g作為最佳氯乙酸用量.
圖1 氯乙酸用量對GLP取代度的影響Fig.1 Effect of chloroacetic acid dosage on the degree of substitution of CM-GLP
(2)NaOH濃度對CM-GLP取代度的影響
NaOH 濃度與取代度呈鐘形曲線關(guān)系(圖2),隨著NaOH 濃度的增大,CM-GLP 取代度呈現(xiàn)先增后降的趨勢,當(dāng)NaOH 溶液濃度為4.5 mol/L 時(shí),CM-GLP 取代度達(dá)到最大為4.10.在堿化反應(yīng)中,NaOH 溶液提供了堿性的反應(yīng)環(huán)境,而且NaOH 溶液可以中和反應(yīng)過程中釋放出來的酸類物質(zhì),促進(jìn)多糖溶脹[25],從而可以提高醚化反應(yīng)活力,使得取代度上升.當(dāng)NaOH 溶液濃度過高時(shí),靈芝多糖在強(qiáng)堿濃度下會(huì)發(fā)生降解,且降解比較嚴(yán)重[26];另外,過高的NaOH濃度將影響氯乙酸濃度在體系內(nèi)的濃度,進(jìn)而導(dǎo)致CM-GLP取代度下降,因此選取4.5 mol/L作為最佳NaOH濃度.
圖2 NaOH濃度對CM-GLP取代度的影響Fig.2 Effect of NaOH concentration on the degree of substitution of CM-GLP
(3)醚化溫度對CM-GLP取代度的影響
醚化溫度對CM-GLP取代度的影響結(jié)果如圖3所示,隨醚化溫度的升高,羧甲基取代度呈先增加后減小的趨勢.當(dāng)醚化溫度為60°C時(shí),CM-GLP取代度達(dá)到最大為4.87.溫度升高會(huì)加快反應(yīng)速率,因此能促進(jìn)醚化反應(yīng)發(fā)生,取代度逐漸提高,然而隨著溫度進(jìn)一步升高,副反應(yīng)速率也會(huì)隨之增加,并且在高溫下多糖通常會(huì)被降解[27],導(dǎo)致已被取代的羧甲基再次被裂解[25],也可能是因?yàn)椴焕陟`芝多糖羥基基團(tuán)的顯露,而且逐漸縮小反應(yīng)空間,不利于取代反應(yīng)[19],從而使羧甲基取代度逐漸降低.因此,選取60 ℃作為最佳醚化溫度.
圖3 醚化溫度對CM-GLP取代度的影響Fig.3 Effect of etherification temperature on the degree of substitution CM-GLP
2.1.2 CM-GLP羧甲基化工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果
CM-GLP 羧甲基化工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果見表2,根據(jù)R值大小可知,靈芝多糖羧甲基化結(jié)構(gòu)修飾的影響因素的主次順序?yàn)锽>C>A,即NaOH 濃度>醚化溫度>氯乙酸用量,理論最優(yōu)工藝組合為A3B2C3,即氯乙酸添加量為4.0 g,NaOH 濃度為4.5 mol/L,醚化溫度為65 ℃,理論上此條件下取代效果最好.進(jìn)一步對該工藝參數(shù)進(jìn)行方差分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表3),因素B 和C 對試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響,其中因素B 對CMGLP取代度的影響極顯著,而因素A各水平改變對CM-GLP取代度影響不顯著.
表2 CM-GLP羧甲基化工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果Tab.2 Optimization of carboxymethylation process of CM-GLP by orthogonal test
表3 CM-GLP羧甲基化工藝優(yōu)化結(jié)果的方差分析Tab.3 Variance analysis of carboxymethylation process of CM-GLP
然而,正交試驗(yàn)結(jié)果中最高取代度(4.83)卻出現(xiàn)在工藝組合A2B2C3 中,即氯乙酸添加量為3.8 g,NaOH濃度為4.5 mol/L,醚化溫度為65 ℃.因此,需對理論最優(yōu)工藝進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果如表4所示,理論最優(yōu)工藝的取代度為4.94,與正交試驗(yàn)的最優(yōu)工藝結(jié)果相比,沒有顯著提高(僅提高2.49%).因此,選擇組合A2B2C3為最優(yōu)工藝,不僅能節(jié)約氯乙酸用量,還能減少因過度使用氯乙酸而引起的一系列環(huán)境問題.
表4 工藝驗(yàn)證Tab.4 Process verification
采用藥典方法分析CM-GLP 的溶解性.選取取代度為4.58、3.54 和1.86 的CM-GLP,分別標(biāo)記為CM-GLP-H、CM-GLP-M 和CM-GLP-L.結(jié)果顯示,在該測試條件下,CM-GLP-H 的溶解度≥10 mg/mL;CM-GLP-M 和CM-GLP-L 在相同溶解條件下,均有不同程度的剩余量,并且CM-GLP-M 比CM-GLP-L 的不溶物更少;而GLP則大部分沒有溶解.可見GLP經(jīng)羧甲基化后,溶解性明顯提高,并且溶解性與羧甲基的取代度呈正相關(guān).
GLP 和不同取代度CM-GLP 的紅外光譜如圖4所示.GLP 和CM-GLP 在4 000~500 cm-1范圍內(nèi)圖譜基本相似,只存在部分差異.GLP 和CM-GLP 在1 000~1 100 cm-1、1 400~1 530 cm-1、2 800~2 900 cm-1和3 100~3 500 cm-1均有多糖的特征吸收峰.3 400 cm-1附近是羥基(O-H)的伸縮振動(dòng)峰,經(jīng)羧甲基化后,吸收峰由3 408 cm-1高波數(shù)移動(dòng)(3 423.8 cm-1).2 920 cm-1附近是烷基的(C-H)的伸縮振動(dòng).CM-GLP在1 604 cm-1和1 324 cm-1附近發(fā)現(xiàn)吸收峰,說明存在羧基(C=O)的非對稱和對稱的伸縮振動(dòng)[28],意味著GLP 確實(shí)發(fā)生了醚化,表明(COO-)基團(tuán)成功被連接到GLP上.
圖4 GLP和CM-GLP的紅外光譜分析Fig.4 Infrared spectrum analysis of GLP and CM-GLP
考察CM-GLP的抗氧化性.如圖5A(A:清除?OH 自由基活性)所示,CM-GLP是具有很強(qiáng)的清除羥基自由基能力,其清除能力與CM-GLP 濃度和取代度呈正相關(guān).在0.5~10 mg/mL 濃度范圍內(nèi),CM-GLP 清除自由基能力約為10%~98%.當(dāng)濃度為10 mg/mL 時(shí),CM-GLP-H 清除能力最強(qiáng)為97.99%,CM-GLP-M稍差(97.21%),CM-GLP-L最弱(94.60%).
由圖5B(B:還原力)可知CM-GLP 具有一定的還原力,其變化規(guī)律與清除羥基自由基能力基本一致.隨著CM-GLP 濃度和取代度的增加,CM-GLP 還原力也隨之加強(qiáng),說明還原力與CM-GLP 濃度和取代度呈正相關(guān).在0.5~10 mg/mL 濃度范圍內(nèi),CM-GLP 還原力為0.007~0.214.當(dāng)濃度為10 mg/mL 時(shí),CMGLP-H還原力最強(qiáng),為0.214.
圖5 CM-GLP的體外抗氧化性分析Fig.5 In vitro antioxidant analysis of CM-GLP
本文以堿溶性靈芝多糖為原料,通過羧甲基化改性制備了羧甲基靈芝多糖CM-GLP,利用正交試驗(yàn)優(yōu)化了靈芝多糖羧甲基化工藝,并對CM-GLP進(jìn)行了水溶性和紅外光譜分析,研究其體外抗氧化活性,得到如下結(jié)論:
(1)通過單因素實(shí)驗(yàn)可知,氯乙酸用量、NaOH濃度、醚化溫度等因素與CM-GLP取代度之間的關(guān)系呈鐘形曲線變化.在單因素的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)探究CM-GLP 的最佳工藝為氯乙酸用量3.8 g,NaOH濃度4.5 mol/L,醚化溫度65 ℃;進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到CM-GLP的平均取代度為4.82,優(yōu)化工藝準(zhǔn)確可靠.
(2)對不同取代度CM-GLP 和GLP 進(jìn)行溶解度測試.結(jié)果顯示,CM-GLP-H 的溶解度≥10 mg/mL,CM-GLP-M次之,CM-GLP-L最差,但溶解性優(yōu)于GLP,說明經(jīng)羧甲基修飾后,GLP溶解性有很大改善,并發(fā)現(xiàn)其溶解能力與羧甲基取代度呈正相關(guān).紅外光譜分析表明,CM-GLP具備多糖的特征吸收峰,1 604 cm-1和1 324 cm-1吸收峰的發(fā)現(xiàn),說明(COO-)基團(tuán)成功被連接到GLP上.
(3)體外抗氧化性分析顯示,CM-GLP 的清除羥基自由基能力和還原力與CM-GLP 的濃度和取代度之間均呈正相關(guān).