葉招娣，周紹唐，徐 璐，劉中勇

心血管疾病(CVD)給社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致心血管疾病的主要原因，導(dǎo)致人群的高死亡率[1]。2017年的心臟病大會(huì)指出，冠心病的患病率呈攀升態(tài)勢(shì)，缺血性心臟病的患病率從2003年的0.46%提高到2015年的1.02%，增加了2倍多[2]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣斑塊中存在大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[3]，而很多醫(yī)家認(rèn)為機(jī)體的炎癥反應(yīng)與中醫(yī)熱毒有相似之處，邪毒入絡(luò)，脈絡(luò)瘀阻，氣血運(yùn)行不暢，郁而化熱，熱而傷陰，陰損及陽(yáng)，叢生變證[4]。四妙勇安湯具有清熱解毒的功效，可治療熱毒脫疽，越來(lái)越多的研究表明，四妙勇安湯能夠抑制炎癥反應(yīng)從而起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。基于系統(tǒng)生物學(xué)理論的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以更為系統(tǒng)地探究中藥復(fù)方的活性成分和作用靶點(diǎn)，指導(dǎo)基礎(chǔ)研究以及中藥新藥的研發(fā)。

1 資料與方法

1.1 四妙勇安湯相關(guān)靶點(diǎn)篩選 通過(guò)檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)并下載中藥化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18的2個(gè)ADME屬性值進(jìn)行活性成分初步篩選以獲得活性化合物及其作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，并根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充未預(yù)測(cè)到的活性化合物的已知靶點(diǎn)。篩選結(jié)束后，為標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息，統(tǒng)一在UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。

1.2 冠心病相關(guān)靶點(diǎn)篩選 冠心病相關(guān)靶點(diǎn)篩選以“cardiovascular disease”“coronary heart disease”“coronary artery disease”為關(guān)鍵詞在OMIM(http://www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)和GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選，合并疾病數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)后，刪除重復(fù)值得到冠心病的疾病靶點(diǎn)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中，Score值越高則代表該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系密切，若靶點(diǎn)過(guò)多則設(shè)定Score大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為冠心病的潛在靶點(diǎn)[5]。

1.3 四妙勇安湯成分-冠心病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 為探討四妙勇安湯藥物相關(guān)靶點(diǎn)與冠心病靶點(diǎn)間的相互作用，將得到的藥物有效成分及靶點(diǎn)與疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行合并，得到四妙勇安湯有效成分治療冠心病的靶點(diǎn)。將得到的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)上傳至 Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。其中節(jié)點(diǎn)代表金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草有效成分和靶點(diǎn)等，邊代表四味中藥成分與成分、成分與靶點(diǎn)之間、藥物與成分靶點(diǎn)之間的關(guān)系。

1.4 藥物-疾病核心蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將藥物和疾病的交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)輸入至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//string-db.org)中，將物種定義為“人”，構(gòu)建四妙勇安湯治療冠心病的PPI網(wǎng)絡(luò)。將STRING數(shù)據(jù)庫(kù)文件導(dǎo)入至Cytoscape 3.7.2軟件中，并運(yùn)用其內(nèi)置工具分析有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括連接度(Degree)、介度(Betweenness)及緊密度(Closenesss)等，以Degree值大于平均值為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出核心靶點(diǎn)[6]。

1.5 功能富集與生物通路分析 將藥物和疾病的交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)傳輸至DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中，選擇“OFFICE_GENE_SYMBOL”“genelist”，種屬選為“Homosapiens”，之后選取“gene ontology”下的“GOTERM_BP_DIRECT”以及“pathways”下的“KEGG_PATHWAY”進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析以及基因本體(gene ontology，GO)生物過(guò)程的富集分析。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 從RSCB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www．rcsb.org/)中下載白細(xì)胞介素6(IL6)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的晶體結(jié)構(gòu)，采用AutoDock Tools 1.5.6 軟件刪除IL6和VEGF復(fù)合物中水分子，分離配體和受體，添加非極性氫，計(jì)算Gasteiger 電荷，保存為pdbqt文件。從pubchem 下載小分子3D 坐標(biāo)文件，在pymol 中檢查空間結(jié)構(gòu)無(wú)誤后，利用openbabel 轉(zhuǎn)換為pdb 格式，將結(jié)構(gòu)件載入AutoDock Tools 1.5.6 程序，添加原子電荷，分配原子類型，所有柔性鍵均默認(rèn)可旋轉(zhuǎn)，保存為pdbqt 格式，作為對(duì)接配體。以IL6和VEGF作為受體，以中藥候選成分作為配體，根據(jù)靶蛋白復(fù)合物中配體的坐標(biāo)確定分子對(duì)接的活性位點(diǎn)，根據(jù)IL6和VEGF蛋白活性口袋設(shè)置Gridbox 坐標(biāo)及大小，采用AutoDock Vina 進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行分析處理。

2 結(jié) 果

2.1 四妙勇安湯活性成分的篩選 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草的有效成分，并與文獻(xiàn)中檢索得到的有效成分一同納入，初步提取出金銀花化學(xué)成分236種、玄參化學(xué)成分47種、當(dāng)歸化學(xué)成分125種、甘草化學(xué)成分280種，經(jīng)ADME篩選后共獲得金銀花23種、玄參9種、當(dāng)歸2種、甘草93種，共127種化學(xué)成分，按OB值的大小列舉出了30個(gè)，包括哈帕苷(harpagoside)、胺(inermine)、丁子香萜(mairin)、甘草酚(glycyrol)，詳見表1。金銀花成分作用靶點(diǎn)395個(gè)、玄參成分作用靶點(diǎn)95個(gè)、當(dāng)歸成分作用靶點(diǎn)92個(gè)、甘草成分作用靶點(diǎn)1 893個(gè)，合并后刪除重復(fù)值共得到靶點(diǎn)137個(gè)。

表1 四妙勇安湯的藥物活性成分

2.2 四妙勇安湯治療冠心病潛在作用靶點(diǎn) 將收集到的金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草靶點(diǎn)刪除重復(fù)值后，得到四味藥有效成分作用靶點(diǎn)137個(gè)，冠心病靶點(diǎn)3 177個(gè)，將藥物與疾病的靶點(diǎn)合集得到藥物與疾病的Venn圖。獲得藥物與疾病的共有靶點(diǎn)為116個(gè)，即為四妙勇安湯治療冠心病的潛在靶點(diǎn)。詳見圖1。

圖1 藥物與疾病靶點(diǎn)合集的Venn圖

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 治療冠心病的“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖見圖2，圖中左上方圓圈代表藥物的作用靶點(diǎn)，右下方長(zhǎng)方框代表藥物的活性成分，Degree值大于80的標(biāo)記為紅色，代表此節(jié)點(diǎn)更重要，圖中共有262個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中藥物4個(gè)，藥物治療疾病的活性成分121個(gè)，藥物的作用靶點(diǎn)137個(gè)，通過(guò)Cytoscape 3.7.1內(nèi)置的Network Analyzer分析四妙勇安湯治療冠心病的核心成分，按Degree值進(jìn)行排序：槲皮素(介度為0.260 949 55，緊密度為0.522 357 721 69，連接度為169)、β-谷甾醇(介度0.088 000 00，緊密度0.467 000 000 00，連接度為150)、山奈酚(介度為0.083 000 00，緊密度0.462 000 000 00，連接度105)，預(yù)測(cè)槲皮素、β-谷甾醇和山奈酚為四妙勇安湯治療冠心病的主要活性成分。

圖2 四妙勇安湯治療冠心病的藥物活性成分靶點(diǎn)圖

2.4 藥物-疾病的核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖 將藥物金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草與冠心病的靶點(diǎn)合并取交集，得到藥物治療疾病的116個(gè)靶點(diǎn)，將116個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，物種限定為“人”，得到藥物-疾病PPI網(wǎng)絡(luò)圖，圖中共有116個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 239條邊，平均連接度值為21.4，設(shè)置中將網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點(diǎn)隱藏，詳見圖3，節(jié)點(diǎn)代表靶標(biāo)蛋白，邊表示蛋白與蛋白之間的關(guān)系。再將該結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2軟件中，以Degree值大于平均值22為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，最終得到43個(gè)核心靶點(diǎn)，詳見圖4。其中顏色字體越大代表節(jié)點(diǎn)值較高的靶點(diǎn)，其中IL6、腫瘤壞死因子(TNF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A (VEGFA)可能是四妙勇安湯治療冠心病的主要靶點(diǎn)，TP53基因、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK8)、禽肉瘤病毒17的轉(zhuǎn)化基因(JUN)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、環(huán)氧化酶2(PTGS2)等亦為重要的靶點(diǎn)。

圖3 四妙勇安湯-冠心病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 四妙勇安湯-冠心病核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO生物過(guò)程分析 將藥物治療疾病的116個(gè)靶點(diǎn)錄入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行GO分析，得到分子功能(MF)、生物過(guò)程(BP)和細(xì)胞成分(CC)條目，再根據(jù)P≤0.05、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤0.05進(jìn)行篩選，得到GO-BP 47條、GO-CC 11條、GO-MF 12條。并通過(guò)在線網(wǎng)址omicsshare(http://omicsmart.com/)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。由結(jié)果可見，多個(gè)靶點(diǎn)的功能與冠心病的發(fā)生發(fā)展密不可分。四妙勇安湯主要參與的生物學(xué)過(guò)程包括對(duì)藥物反應(yīng)、對(duì)缺氧的反應(yīng)、對(duì)一氧化氮生物合成過(guò)程的正向調(diào)控和調(diào)節(jié)老化等；相關(guān)靶點(diǎn)治療冠心病的功能主要富集在與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、活化蛋白質(zhì)異源二聚體、與同一蛋白、血紅素結(jié)合等。詳見圖5～圖7。

圖5 四妙勇安湯-疾病交集的靶點(diǎn)GO-BP富集分析

圖6 四妙勇安湯-疾病交集的靶點(diǎn)GO-CC富集分析

圖7 四妙勇安湯-疾病交集的靶點(diǎn)GO-MF富集分析

2.6 KEGG通路富集分析 將藥物作用與疾病的靶點(diǎn)錄入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，得到KEGG通路73條，以P≤0.05以及FDR≤0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出了17條，包括癌癥通路(pathways in cancer)、TNF信號(hào)通路和低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號(hào)通路。詳見表2。

表2 四妙勇安湯治療冠心病靶點(diǎn)通路富集結(jié)果

2.7 四妙勇安湯中核心活性化合物作用于IL6和VEGFA的分子對(duì)接結(jié)果 結(jié)合能小于0說(shuō)明化合物與蛋白可以自發(fā)結(jié)合，使用autodock vina所做的對(duì)接，結(jié)合能在-5～-10 kJ/mol表明結(jié)合效果比較好[7]，化合物與蛋白結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低，發(fā)生的作用可能性越大。分子對(duì)接結(jié)果顯示，將四妙勇安湯在藥物化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中按Degree值選取13個(gè)核心活性化合物與IL6、VEGFA進(jìn)行分子對(duì)接，與IL6結(jié)合能最低的化合物分別為豆甾醇(結(jié)合能為-7.5 kJ/mol)、木犀草素(結(jié)合能為-7.0 kJ/mol)和異鼠李素(結(jié)合能為-7.0 kJ/mol)。與VEGFA結(jié)合能最低的化合物分別為豆甾醇(結(jié)合能為-8.3 kJ/mol)、shinpterocarpin(結(jié)合能為-7.7 kJ/mol)、β-谷甾醇(結(jié)合能為-7.6 kJ/mol)和licoagrocarpin(結(jié)合能為-7.6 kJ/mol)。由結(jié)合能可見四妙勇敢湯藥物核心成分與靶分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，結(jié)合活性較高。選取結(jié)合能較優(yōu)的10個(gè)核心化合物進(jìn)行展示(見表3)，分別展示了結(jié)合能最優(yōu)的豆甾醇與IL6和VEGFA的3D效果(見圖8、圖9)。

表3 四妙勇安湯中結(jié)合能較優(yōu)的10個(gè)核心化合物作用于IL6和VEGFA 單位： kJ/mol

圖8 豆甾醇與IL6的3D互作蛋白

圖9 豆甾醇與VEGFA的3D互作蛋白

3 討 論

冠心病是嚴(yán)重威脅人類健康的心臟疾病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)為防治冠心病制定了諸多策略，但治療過(guò)程中仍有胃腸道不適、重要臟器出血等不良反應(yīng)，中醫(yī)通過(guò)辨證治療冠心病往往能取得良好的效果。臨床工作中發(fā)現(xiàn)，四妙勇安湯加味治療穩(wěn)定型心絞痛療效確切，并能改善病人的臨床癥狀和血脂水平[8]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，四妙勇安湯能不同程度地降低白細(xì)胞介素1(IL1)、TNF-α和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)水平的作用以及減少斑塊區(qū)NF-κBp65亞基表達(dá)[9]。

冠心病的主要病因是動(dòng)脈粥樣斑塊形成，炎癥反應(yīng)介導(dǎo)了動(dòng)脈粥樣硬化形成的不同階段，從最初的白細(xì)胞募集到不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的最終破裂，一些炎癥級(jí)聯(lián)標(biāo)志物[如P-選擇素、IL6、TNF-α、可溶性細(xì)胞間黏附分子-1和C-反應(yīng)蛋白(CRP)]已經(jīng)被證明可以預(yù)測(cè)斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)[10]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的炎癥反應(yīng)與中醫(yī)的熱毒有相似之處，且冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病與脫疽均屬于血管病變，而四妙勇安湯為治療熱毒脫疽的千古名方，根據(jù)“異病同治”的治療原則，推測(cè)四妙勇安湯能夠治療冠心病，并在臨床治療中取得良好療效[11]。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步篩選出四妙勇安湯治療冠心病的活性成分為槲皮素、β-谷甾醇和山奈酚。槲皮素是天然的抗氧化劑之一，動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中低密度脂蛋白通過(guò)受損的內(nèi)皮進(jìn)入管壁內(nèi)膜，氧化修飾成低密度脂蛋白膽固醇，研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可以在體外抑制低密度脂蛋白氧化從而防治動(dòng)脈粥樣硬化[12]。植物甾醇β-谷甾醇可與膽固醇競(jìng)爭(zhēng)腸道內(nèi)膽鹽膠束內(nèi)的空間，從而減少膽固醇的吸收[13]，一項(xiàng)薈萃分析顯示，每天攝入2.15 g的甾醇可使低密度脂蛋白膽固醇降低8.8%[14]。山奈酚是一種天然的類黃酮，存在于多種植物中，研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚對(duì)心臟具有保護(hù)作用，通過(guò)多種途徑實(shí)現(xiàn)，如抑制炎性因子TNF、 IL1、IL6和NF-κB的激活而發(fā)揮抗炎作用[15]；抑制凝血酶和纖維蛋白聚合物的形成而發(fā)揮抗血小板作用[16]；提高超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的濃度而起到抗氧化作用[17]。分子對(duì)接結(jié)果顯示，四妙勇安湯中豆甾醇、木犀草素和異鼠李素等與靶點(diǎn)VEGFA和IL6具有一定的親和力，故推測(cè)四妙勇安湯主要通過(guò)豆甾醇、木犀草素和異鼠李素來(lái)治療冠心病。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，四妙勇安湯治療冠心病的靶點(diǎn)主要是IL6、TNF和VEGFA。動(dòng)脈粥樣斑塊的形成，巨噬細(xì)胞吞噬低密度脂蛋白后變成泡沫細(xì)胞，釋放大量的細(xì)胞因子，如IL6、TNF，這些炎性因子會(huì)促進(jìn)斑塊的不穩(wěn)定和導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[18]。VEGFA促進(jìn)動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)不成熟的病理性新生血管生成，動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中釋放的炎癥細(xì)胞、脂質(zhì)會(huì)通過(guò)這些新生血管滲漏出來(lái)，加重炎癥反應(yīng)。此外，不穩(wěn)定的病理性新生血管一旦破裂會(huì)導(dǎo)致出血，加重管腔狹窄，增加心腦血管疾病急性發(fā)作的風(fēng)險(xiǎn)[19]。

四妙勇安湯治療冠心病的通路包括TNF信號(hào)途通路、HIF-1信號(hào)通路和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路。TNF作為一種重要的細(xì)胞因子，與其受體(TNFR1、TNFR2)結(jié)合，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞存活、炎癥和免疫等多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑[20]。動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)，氧氣無(wú)法彌散至內(nèi)膜下組織而造成缺氧，缺氧可誘導(dǎo)HIF-1的激活，HIF-1α可以誘導(dǎo)VEGF的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)血管生成，血管生成進(jìn)一步導(dǎo)致斑塊體積增大和斑塊內(nèi)出血，造成斑塊的不穩(wěn)定[21]。PI3K可誘導(dǎo)下游的AKT與細(xì)胞膜相結(jié)合，并使AKT發(fā)生磷酸化，AKT激活可在體內(nèi)保護(hù)心功能，防止短暫性心肌缺血損傷，縮小梗死面積[22]。由此推測(cè)四妙勇安湯主要是通過(guò)抑制TNF、HIF-1信號(hào)通路以及PI3K/AKT途徑來(lái)防治冠心病。

綜上所述，本研究顯示金銀花-玄參-當(dāng)歸-甘草共有121個(gè)活性成分，作用于137個(gè)靶點(diǎn)，經(jīng)過(guò)多種蛋白功能，涉及多種通路和生物進(jìn)程，進(jìn)一步體現(xiàn)四妙勇安湯多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療冠心病的特點(diǎn)，后續(xù)可以此為基礎(chǔ)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，進(jìn)一步確認(rèn)四妙勇安湯治療冠心病的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路。