羅曉恒，趙哲坤,2，高宜，趙爽*

（1.北京市農(nóng)林科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與食品營養(yǎng)研究所，北京市農(nóng)林科學院植物保護研究所，北京 100097）（2.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056038）（3.北京市西城區(qū)婦幼保健中心，北京 100053）

榆黃菇（Pleurotus citrinipileatus）又名金頂側耳、黃金菇、榆黃蘑，隸屬于擔子菌亞門（Basidiomycotina），層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目（Agaricales），側耳科（Pleurotaceae），側耳屬（Pleurotus），是較為珍貴的經(jīng)濟食用菌之一。野生榆黃菇子實體因呈淺黃色或黃色且腐生于榆木上而得名，主要分布于歐洲、美洲、中國、東南亞等地[1]，榆黃菇香味十分濃郁，形狀為淺漏斗形，菌肉為白色，肉質脆嫩；柄為偏生，菇體成簇生長[2]。榆黃菇是一種北方地區(qū)常見的食用菌，其因為外型喜人又是食藥兼用的食用菌，現(xiàn)在各地都有栽培，例如：在河南焦作泌陽縣擴大了榆黃菇的種植規(guī)模，增加了經(jīng)濟效益，幫助了很多村民脫貧致富，鞏固了脫貧攻堅的成果[3]。有些地方甚至將榆黃菇種植業(yè)與茶園業(yè)、林園等相結合科學的發(fā)展，進一步開發(fā)創(chuàng)新榆黃菇種植與農(nóng)村休閑資源結合的旅游模式，綜合提升茶園和林園的利用率和經(jīng)營效益[4]。

隨著人們對生活質量要求的提高，榆黃菇因其具高蛋白、低脂肪、低糖等特點，已經(jīng)成為了人們餐桌上常見的美味佳肴。榆黃菇富含蛋白質、氨基酸、維生素、多糖、鈉、鈣、鐵、鉀、鋅[5,6]等營養(yǎng)物質，食用榆黃菇不但可以幫助人體補充所需的營養(yǎng)物質和增強人體免疫力，而且長期食用可以發(fā)揮降低血壓、抗癌、抗脂肪肝、延緩衰老、降低血糖血脂和抗病毒[7,8]等功效。但是有關榆黃菇功能多糖的提取純化研究比較少，對于榆黃菇抗炎多糖的相關報道較為少見。其功能研究多集中在護肝消脂[9]、抗氧化和保濕等方面[10]。石堃等[11]對榆黃菇多糖進行體外抗氧化活性的測定，結果顯示榆黃菇多糖具有一定的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子清除能力以及還原力。王曉潔等[12]利用MTT比色法發(fā)現(xiàn)榆黃菇菌絲體胞外多糖對小鼠-S180癌細胞以及人結腸低分化腺癌細胞均具有抑制作用。同時榆黃菇多糖可以通過調節(jié)免疫細胞來提高身體抵抗病毒和抵御細菌入侵感染的能力，能夠明顯地增強體液免疫系統(tǒng)和細胞免疫功能的作用[13,14]。本試驗通過體外建立炎癥細胞模型，綜合評價榆黃菇多糖的抗炎作用，旨在為研制抗炎功能性食品或天然藥物的開發(fā)提供原料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

RAW264.7細胞，北納創(chuàng)聯(lián)生物技術有限公司；榆黃菇菌株，北京市農(nóng)林科學院植保所保藏菌株。

1.2 儀器與試劑

Steti-cycle371 CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；R-215旋轉蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；電子天平，美國奧豪斯公司；真空干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；電熱恒溫水浴鍋，北京長安永劍科學儀器有限公司；SHZ-88A恒溫水浴鍋，北京精科華瑞儀器有限公司；5810R冷凍離心機，美國Eppendrof公司；IX-71倒置顯微鏡，日本 Olympus公司；移液器，美國Drummond公司；熒光全波長酶標儀，Tecan Austria GmbH公司。

胎牛血清（FBS）、RPMI高糖培養(yǎng)液、胰酶和雙抗（青霉素和鏈霉素），美國 Invitrogen公司；MTT測試液、二甲基亞砜（DMSO），美國Amresco公司；臺盼藍染液和無水乙醇，國藥集團化學試劑有限公司；BCA測定試劑盒，北京博邁德基因技術有限公司；NOS測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)測定試劑盒，北京四正柏生物科技有限公司；水為超純水；化學試劑均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 榆黃菇多糖的提取及純化

榆黃菇菌株接種到綜合 PDA試管中進行活化，25 ℃恒溫培養(yǎng)；待菌絲長滿試管后將其接種到二級培養(yǎng)基中（棉籽殼80%、麩皮18%、石膏1%、糖1%、料水比為 1:1），25 ℃恒溫培養(yǎng)室培養(yǎng)至菌絲長滿；將二級種接種到栽培袋中（棉籽殼78%、麩皮20%、膏1%、糖1%、料水比為1:1），25 ℃的條件下進行發(fā)菌，菌種長滿栽培袋后進行搔菌并移入溫室大棚；出菇條件保持濕度在90%以上，溫度約為20～25 ℃，收集第一潮榆黃菇子實體，冷凍干燥后放入破碎機，制成質地均一的榆黃菇干粉。定量稱取榆黃菇干粉，按1:30的比例加入去離子水，在90 ℃高溫水浴鍋中水浴4 h，水浴后混合物在高速冷凍離心機中以6000 r/min離心30 min。取上清液，旋蒸濃縮，量取上清液體積，按照1:4的比例加入無水乙醇攪拌均勻后蓋上錫箔紙，置于4 ℃冰箱中冷藏過夜使多糖析出，然后以6000 r/min、離心30 min得到榆黃菇固體粗多糖，放入于 60 ℃的烘箱中烘干至溶劑揮發(fā)，再配置成多糖溶液待用[15]。

利用Sevage法去除多糖溶液中的蛋白質，重復多次直至無蛋白質凝膠層析出。收集好每次除蛋白后的上清液，混合上清液后加入無水乙醇得到沉淀的多糖，烘干去除溶劑再用去離子水溶解，得到去除蛋白的榆黃菇粗多糖溶液[16]。

利用 10 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖溶液（PBBuffer，PBS）平衡DEAE-Cellulose層析柱（5×20 cm），榆黃菇粗多糖溶液調節(jié)pH值上樣，用0、0.2 mol/L NaCl和1 mol/L NaCl進行梯度洗脫，洗脫流速為1.5 mL/min，分別收集不同時間段洗脫出的溶液，測定洗脫液的多糖濃度，收集到兩個多糖含量較高的洗脫峰D1和D2。將組分D1和D2分別上樣于Superdex-75分子凝膠層析柱，用超純水進行洗脫，洗脫流速為0.5 mL/min，測定洗脫液的多糖濃度，收集多糖洗脫峰PSI和PSII，冷凍干燥48 h后獲得多糖純品。

1.3.2 細胞的培養(yǎng)

將巨噬細胞 RAW264.7培養(yǎng)于含有 10%胎牛血清、1% 10 mg/L鏈霉素（原液濃度）和10000 U/mL青霉素的RPMI高糖培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔一天用PBS清洗后再用0.02% EDTA和0.25%的胰蛋白酶細胞消化液進行傳代培養(yǎng)。

1.3.3 利用LPS誘導巨噬細胞RAW264.7建立炎癥模型

取對數(shù)生長期細胞按照1×104cells/孔的數(shù)目接種到96孔板中，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后用PBS清洗，分別設置空白組和炎癥模型組，炎癥組加入不同濃度的LPS溶液，每個組分別設置3個復孔，每個孔終濃度分別為1、3、5、7、9 μg/mL，空白組則加入等體積的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，測定TNF-α濃度水平。因為TNF-α是細胞達到炎癥狀態(tài)最初產(chǎn)生的細胞因子，所以我們選擇TNF-α的分泌水平最高的一組來作為脂多糖的最佳誘發(fā)炎癥的濃度。

1.3.4 榆黃菇多糖純品對RAW264.7炎癥細胞活力的影響

取對數(shù)生長期細胞按照8×103cells/孔的數(shù)目接種到96孔板中，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后用PBS清洗，分別設置空白組、炎癥組和給藥組，除空白組外加入終濃度為5 μg/mL的LPS溶液誘導細胞形成炎癥，將不同作用濃度的榆黃菇多糖加入培養(yǎng)板中，使PSI和PSII終濃度為125、250、500、1000、2000 μg/mL，不加多糖的處理作為空白組，每組設置3個重復孔，炎癥組、空白組加入同等體積的細胞培養(yǎng)液，放置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，采用MTT法測定細胞存活率，以篩選到促增殖效果最強的作用濃度為目標，調整PSII作用濃度，使其終濃度為12.5、25、50、100、200、250 μg/mL，選擇刺激細胞增殖的最高濃度作為抗炎功能研究的給藥劑量。

1.3.5 中性紅試驗觀察細胞吞噬活性

取對數(shù)生長期細胞按照1×104cells/孔的數(shù)目接種到96孔板中，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用PBS清洗后，分別設置空白組、炎癥組和給藥組，除空白組外加入終濃度為5 μg/mL的LPS溶液誘導細胞形成炎癥，過2 h后給藥組加入用細胞培養(yǎng)液稀釋的多糖PSI和PSII濃度分別為500 μg/mL和200 μg/mL的溶液200 μL，每組設置3個重復孔，炎癥組、空白組加入同等體積的細胞培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗，加入0.09%中性紅溶液200 μL置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，吸棄中性紅培養(yǎng)液，用PBS清洗，加入200 μL細胞裂解液（體積比為1:1=冰醋酸:無水乙醇）裂解10 min，用酶標儀在690 nm波長處測定吸光度，計算細胞吞噬活性。

1.3.6 一氧化氮合酶的測定

取對數(shù)生長期細胞按照3×106cells/孔的數(shù)目接種到24孔板中，同1.3.5的設置組別及操作步驟，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細胞，利用100 μL超純水反復凍融細胞3次，12000 r/min離心10 min，取上清液，利用 BCA試劑盒測定細胞全蛋白的含量，用于NOS的檢測，同時用一氧化氮合酶試劑盒按照說明書操作，測定吸光值并換算成 NOS酶活力值[17]。酶活力單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol NO為一個酶活力單位。

式中：

ODNOS——總NOS測定OD值；

OD空——空白OD值；

V總——反應液總體積；

V樣——取樣量；

r——比色光徑；

t——反應時間；

C——待測樣本蛋白濃度。

1.3.7 細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的測定

取對數(shù)生長期細胞按照3×106個/孔的數(shù)目接種到6孔板中，同1.3.5的設置組別及操作步驟，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，測定各細胞因子的濃度水平[18]。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

使用DPS軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，使用Duncan新復極差法并進行多重比較。

2 實驗結果

2.1 榆黃菇粗多糖的 DEAE-Cellulose離子柱分離

榆黃菇子實體經(jīng)過水提醇沉、去除蛋白后得到的粗多糖樣品，多糖溶液經(jīng)過透析調節(jié)pH值后上樣于DEAE-Cellulose層析柱，分別利用 0、0.2、1 mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫，分別在0和0.2 mol/L NaCl溶液洗脫時獲得2個含量較高的洗脫峰D1和D2，洗脫曲線如圖1所示。

2.2 榆黃菇多糖的Superdex-75凝膠柱層析結果

D1和D2組分分別采用Superdex-75凝膠柱層析進行分離，D1和D2組分經(jīng)過凝膠過濾分離后呈現(xiàn)出單峰，說明已獲得多糖提純品，分別命名為 PSI和PSII，洗脫曲線見圖2和圖3所示。

2.3 LPS誘導巨噬細胞建立炎癥模型

TNF-α是細胞產(chǎn)生炎癥反應的始發(fā)因子，當一定濃度的LPS刺激巨噬細胞RAW264.7后能使細胞過量且持續(xù)地產(chǎn)生TNF-α引起炎癥反應，由圖4可以看出，當LPS濃度為5 μg/mL時，細胞分泌TNF-α含量水平最高，所以我們后續(xù)研究選擇LPS濃度為5 μg/mL作為炎癥誘導濃度。

由圖4可知，RAW264.7巨噬細胞在LPS的誘導下釋放炎性因子TNF-α的水平明顯增高，LPS濃度為5 μg/mL時，釋放炎性因子TNF-α的水平達到最高值，因此設定其為誘導炎癥模型的最佳濃度。

2.4 榆黃菇多糖對RAW264.7細胞活力的影響

經(jīng)不同濃度的榆黃菇多糖作用與被LPS刺激過的RAW264.7細胞培養(yǎng)24 h后，PSI濃度過高和過低時，細胞存活率出現(xiàn)下降的趨勢（p＜0.05），說明過高濃度的PSI對RAW264.7細胞具有毒性，濃度過低可能使細胞產(chǎn)生過激炎癥反應發(fā)生凋亡，但在 PSI為 500 μg/mL細胞存活率最大，為206.08%，雖然未與LPS處理組形成顯著性差異，但是該作用濃度是PSI刺激細胞增殖的最佳劑量。同理，可篩選出 PSII濃度為200 μg/mL時細胞存活率最大，為210.86%，后期我們選擇榆黃菇多糖PSI濃度為500 μg/mL和PSII濃度為200 μg/mL兩個劑量對LPS誘導的炎癥細胞進行抗炎癥功能的研究。

2.5 中性紅試驗觀察細胞吞噬活性

由圖7可知，與空白組相比較，以空白組的吞噬率 100%作為參照，炎癥組的細胞吞噬率增加了68.13%，由此可見巨噬細胞在受到LPS的刺激后其吞噬能力顯著性增加（p＜0.05）；與炎癥組相比，多糖純品 PSI的濃度為 500 μg/mL時的細胞吞噬率減少14.91%；多糖純品PSII的濃度為200 μg/mL時細胞的吞噬率減少17.84%，說明500 μg/mL多糖PSI和200 μg/mL的 PSII都具有顯著性減少細胞吞噬能力作用（p＜0.05），可以緩解LPS對巨噬細胞的刺激作用。

2.6 一氧化氮合酶的測定

如圖8測定PSI和PSII對炎癥細胞NOS酶活力的影響，與炎癥組中NOS濃度相比較，多糖PSI和PSII對巨噬細胞 NOS的活性抑制率分別 37.54%、51.24%，多糖 PSI和 PSII能顯著性降低 NOS水平（p＜0.05）。

2.7 細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的測定

由圖9所示，利用最佳濃度的PSI和PSII組分處理RAW264.7炎癥細胞24 h后，測定IL-1β的含量，與炎癥組相比較，多糖PSI和PSII組的IL-1β的含量分別為分別降低了28.84%和37.56%，說明多糖純品PSI和PSII均能顯著性降低炎癥細胞分泌IL-1β的水平（p＜0.05）。

由圖10可知，炎癥組與空白組的IL-6含量相比較增加了162.19%，存在差異顯著（p＜0.05）；炎癥組分別與PSI和PSII組IL-6的含量相比較，PSI組IL-6的分泌水平的抑制率為28.27%，PSII組IL-6分泌水平的抑制率為31.35%，說明PSI和PSII都能顯著性降低炎癥細胞的IL-6的分泌水平（p＜0.05）。

如圖11所示，利用最佳濃度的PSI和PSII組分處理RAW264.7炎癥細胞24 h后測定TNF-α的含量，與空白組的相比較，炎癥組的 TNF-α含量增加了86.54%，存在顯著性差異（p＜0.05）；與炎癥組比較PSI、PSII組的 TNF-α分泌水平的抑制率分別為30.25%、32.67%，存在顯著性差異（p＜0.05）。

3 討論

巨噬細胞在炎癥反應中具有關鍵的作用，其能夠通過促進機體免疫系統(tǒng)釋放炎癥介質來參與炎癥反應[19]。LPS作為一種細胞毒素，對巨噬細胞具有一定的激活作用，刺激巨噬細胞產(chǎn)生NO和釋放細胞免疫因子等生物活性物質，適量的免疫因子具有提高機體抵抗外界刺激和修復機體損傷的作用，而過量持續(xù)的刺激產(chǎn)生的免疫活性物質則會引起細胞的炎癥反應，導致細胞的損傷和凋亡[20]。

TNF-α、IL-6和 IL-1β作為主要細胞因子，在機體免疫應答和炎癥調節(jié)中發(fā)揮著重要作用。TNF-α是一類在炎癥調控中占據(jù)主導地位的雙重活性細胞因子，正常的機體可以適量的分泌TNF-α，其可以介導免疫應答，增強巨噬細胞的殺傷活性，進而增強機體的免疫機能。但是當TNF-α大量釋放的時候，其能夠誘導其它炎性介質和氧自由基的分泌，加劇炎癥發(fā)展的進程[21]。IL-6能調節(jié)各種生理過程，包括應急反應、炎癥、免疫反應、造血和細胞生長等，它通過促進嗜中性粒細胞運輸?shù)窖装Y部位而參與炎癥的引發(fā)和維持，導致產(chǎn)生許多炎癥介質，還可調節(jié)T淋巴細胞的激活和分化，促進B淋巴細胞成熟[22]。IL-1β是一種淋巴細胞及單核細胞激活因子，作用于機體的各個系統(tǒng)，參與免疫調節(jié)、介導炎性反應、影響組織代謝，誘導其它多種細胞因子的分泌，是炎性反應過程中重要的細胞因子之一[23]。一氧化氮合酶（NOS）是一種同工酶，分別存在于內皮細胞、巨噬細胞、神經(jīng)吞噬細胞及神經(jīng)細胞中，在免疫反應過程中，內毒素和某些細胞因子如IL-1、TNF-α、干擾素等可誘導NOS酶催化L-精氨酸產(chǎn)生大量NO，對腸黏膜具有殺傷毒性和促炎作用。

本實驗以榆黃菇多糖為活性物質，在體外抗炎研究中發(fā)現(xiàn)，多糖提純品PSI和PSII處理RAW264.7炎癥細胞24 h后，利用MTT法測定細胞存活率來篩選出促增殖活性最佳劑量分別為 500 μg/mL和 200 μg/mL，云少君等[24]通過使用MTT法檢測巨噬細胞的增殖發(fā)現(xiàn)巴氏蘑菇多糖在濃度為1000 μg/mL時效果最佳，相對比，榆黃菇多糖抗炎效用明顯優(yōu)于巴氏蘑菇多糖。研究通過測定巨噬細胞的吞噬能力來發(fā)現(xiàn)抗炎功效，與炎癥組比較，經(jīng)過500 μg/mL多糖PSI處理后，細胞的吞噬能力減少了15.05%；經(jīng)過200 μg/mL的PSII處理后，細胞的吞噬能力減少了17.82%，說明多糖PSI與PSII具有良好的抗炎功效；在抗炎功效研究中，與炎癥組相比，經(jīng)過500 μg/mL PSI處理后的炎癥細胞，其NOS活性減少了37.54%，細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平分別下降了29.25%、28.34%和30.27%；而經(jīng)過200 μg/mL PSII處理后的炎癥細胞，其NOS活性減少了51.24%，細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌水平分別下降了38.54%、31.45%和32.76%。這一結果說明了多糖PSI與PSII可通過降低炎癥細胞因子的分泌，抑制其誘導炎性介質的能力；同時多糖PSI與PSII還有效抑制炎癥細胞NOS酶的活力，降低其促炎作用，從而達到抗炎的效果。董瑛等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，香菇多糖聯(lián)合GP化療方案對于促炎性細胞分子 IL-1β、TNF-α的分泌具有良好的抑制作用，抑制率達到了46.66%，相比較PSI和PSII對于促炎性細胞分子 IL-1β、TNF-α的分泌也具有明顯的抑制作用，其中單獨使用PSII就可以抑制細胞分泌IL-1β達到38.54%，抑制率與香菇多糖和化療藥物聯(lián)合應用的效果相近，說明其作用優(yōu)于香菇多糖。另外，多糖被公認為是生物免疫反應調節(jié)劑，具有無毒的特性，與當前廣泛研究的抗炎醛類物質相比，其具有更為廣泛的應用前景。本研究發(fā)現(xiàn)榆黃菇多糖 PSI和PSII可以調節(jié)巨噬細胞增殖和吞噬能力，從而發(fā)揮抗炎的功能，這與歐陽學農(nóng)等[26]研究香菇多糖抗炎的作用機理相吻合。

4 結論

本研究從榆黃菇中提取得到PSI和PSII兩個多糖提純品，通過體外細胞炎癥模型的評價，確定了兩個多糖提純品能夠緩解細胞的炎癥反應，具備抗炎功能。其中低作用濃度的PSII對于細胞NOS的活性和細胞因子分泌的抑制作用更為明顯，其作用效果優(yōu)于PSI，該研究結果可以為榆黃菇多糖在抗炎功能研究及應用方向提供科學支持。