李晨，趙超敏，古淑青，鄧曉軍*，趙志慧

（1.上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海 200135）（2.上海如海光電科技有限公司，上海 201209）

孔雀石綠和結(jié)晶紫均為人工合成的三苯甲烷類堿性染料，主要用于防治水霉病，自20世紀(jì)30年代起就被廣泛用于漁業(yè)生產(chǎn)中[1,2]。但研究發(fā)現(xiàn)，這兩種人工合成染料，不論是對人還是對動(dòng)物，都具有較高的致癌性[3]。中國對水產(chǎn)養(yǎng)殖中添加該類藥物是嚴(yán)格禁止的[4]，同時(shí)歐盟也規(guī)定禁止添加該類藥物，并且評估了孔雀石綠及其主要代謝物隱色孔雀石綠在水產(chǎn)品中限量2 μg/L不存在健康問題[5]。雖然國內(nèi)外都明令禁止孔雀石綠和結(jié)晶紫在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用，但因其抗菌效果良好，價(jià)格低廉，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中仍有違規(guī)使用的情況[6]。

目前孔雀石綠和結(jié)晶紫檢測與水產(chǎn)相關(guān)的方法已非常成熟，常見方法有液相色譜法[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[8]，這類方法結(jié)果準(zhǔn)確，有較高的靈敏度，但受制于儀器條件，有檢測成本過高、檢驗(yàn)周期較長的缺陷。為了滿足養(yǎng)殖場以及現(xiàn)場監(jiān)管的需求[9]，快檢方法就是針對這些缺陷提出的新的解題思路?，F(xiàn)在較為成熟的快檢法是膠體金免疫盒試劑法[10]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定液相色譜法方法檢出低限為 0.50 μg/kg，膠體金免疫盒試劑法為2 μg/kg，現(xiàn)有的快速檢測低限相對于實(shí)驗(yàn)室方法仍有提升的空間。

拉曼光譜法是近年來新興流行的快速檢測方法。拉曼檢測是利用拉曼效應(yīng)對樣品進(jìn)行無損檢測的一種方法，它的優(yōu)點(diǎn)在于快速高效，但其缺點(diǎn)是靈敏度較低。表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)是對其這一缺點(diǎn)的有效彌補(bǔ)，在提高效率的同時(shí)增加了靈敏度[11]。因?yàn)槠洳僮鞑襟E簡單的特性，表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)方便設(shè)于口岸等現(xiàn)場監(jiān)管機(jī)構(gòu)，達(dá)到即到即測的目的，也可以用于對市場上的水產(chǎn)品進(jìn)行現(xiàn)場監(jiān)控，縮短檢測時(shí)間以及減少采樣量，讓商家和消費(fèi)者雙方都能受益。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，目前拉曼快檢方法對于孔雀石綠的檢測對象僅針對水產(chǎn)品養(yǎng)殖水[12]，未發(fā)現(xiàn)有針對水產(chǎn)品基質(zhì)的研究，也未發(fā)現(xiàn)有同時(shí)檢測孔雀石綠和結(jié)晶紫的研究。

本文采取一種簡便又高效的表面增強(qiáng)拉曼前處理方法，相較現(xiàn)有的快速檢測方法而言，可同時(shí)檢測孔雀石綠和結(jié)晶紫，且在魚和貝類基質(zhì)中均達(dá)到了常規(guī)國家標(biāo)準(zhǔn)方法的檢出低限。同時(shí)它也擁有常規(guī)檢測不具備的簡單、高效、低損耗、成本低的特點(diǎn)。同時(shí)本方法采用了新型的檢出概率模型（Probability of Detection，POD模型）來驗(yàn)證方法。POD模型既可以被用于對快速檢測中定量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性的考察，也可被用作定性分析的驗(yàn)證。因?yàn)樵搶?shí)驗(yàn)方法只需要定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以只研究了定性模型。POD通過濃度對檢測方法的靈敏度、特異性、假陽性、假陰性以圖形可視化分析，它是協(xié)調(diào)了定量和定性方法驗(yàn)證之間的統(tǒng)計(jì)概念和參數(shù)并提供相應(yīng)曲線的圖形表示工具[13]。本方法通過檢出概率模型，確定了蝦、蟹 1.00 μg/kg和魚、貝0.50 μg/kg的檢出限。該方法操作簡單、快速準(zhǔn)確，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中的孔雀石綠和結(jié)晶紫的現(xiàn)場快速檢測分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SEED 3000便攜式拉曼光譜儀，上海如海光電科技有限公司；Eppendorf 5810R離心機(jī)，德國Eppendorf公司；VORTEX-GENIE2渦旋混合器，美國Scientific Industries公司；Elmasonic P超聲震蕩器，德國Elma公司；JEM-1400透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；Uv-2600紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司；金納米粒子，上海如海光電科技有限公司；促凝劑（1 mol/L碘化鉀），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；孔雀石綠以及隱色孔雀石綠（工業(yè)品），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；結(jié)晶紫以及隱色結(jié)晶紫（工業(yè)品），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；乙酸乙酯（分析純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；二氯二氰苯醌DDQ（分析純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；硼氫化鉀（分析純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；石油醚60 ℃～90 ℃（分析純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；氯金酸（分析純），上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸三鈉（分析純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金納米粒子的合成

金納米離子參考Frens法[14]合成。在100 mL圓底燒瓶中加入聚四氟乙烯磁力攪拌子和50 mL的0.01%氯金酸溶液，將圓底燒瓶中溶液加熱至沸騰后迅速加入0.40 mL的1%檸檬酸三鈉水溶液，保持沸騰狀態(tài)，加熱回流30 min即可制得金納米粒子，反應(yīng)結(jié)束后冰浴冷卻，裝入棕色試劑瓶中保存待用。粒子制備完成后用紫外-可見分光光度計(jì)測試粒子最大吸收波長，透射電子顯微鏡分析粒子形貌。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

分別準(zhǔn)確稱取0.01 g的孔雀石綠和結(jié)晶紫，溶解于約3 mL乙腈中。完全溶解后移至10 mL的容量瓶中，加乙腈至刻度線，搖勻，配得1000 mg/L的孔雀石綠和結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 樣品前處理

取1 g均質(zhì)后樣品于5 mL離心管中，加2 mL乙腈和1 mL水，搖勻震蕩超聲3 min，于4000 r/min離心3 min。取全部上層清液于5 mL離心管，加入0.10 mol/L的硼氫化鉀50 μL，此時(shí)有小氣泡出現(xiàn)，加1 mL的石油醚震蕩兩分鐘，靜置后取全部上層清液約1 mL于1.50 mL離心管。加入1%二氯二氰基苯醌（DDQ）50 μL和0.01 mol/L鹽酸200 μL，震蕩搖勻，靜置后取適量下層清液于玻璃襯管中待測。

陽性樣品的制備，即將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成相應(yīng)濃度，加入待測樣品，制成相應(yīng)陽性樣品。

1.2.4 拉曼光譜分析

玻璃襯管瓶中加入40 μL待測液、40 μL促凝劑、200 μL納米金后，將玻璃襯管瓶放入檢測池中，蓋上池蓋，等待5 min；設(shè)置檢測程序參數(shù)：中心波長785 nm，激光功率250 mV，檢測時(shí)長1000 ms，平均次數(shù)2次。運(yùn)行分析獲得待測樣品譜圖。

1.2.5 定性POD模型建立

檢出概率（POD）被定義為“在給定的分析物水平或濃度下，給定矩陣的定性方法的陽性結(jié)果（P(x)）的比例”[15]，POD曲線以圖形方式描述了陽性結(jié)果的概率與分析物濃度之間的關(guān)系[16]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的 POD模型隨著濃度變化可使“靈敏度”、“特異性”、“假陽性”、“假陰性”等性能指標(biāo)可視化[15]（如圖1）。

確定一個(gè) POD模型，首先要確定目標(biāo)物在特定基質(zhì)下的最低定性限（LOD），定性標(biāo)準(zhǔn)以儀器同時(shí)能檢出一個(gè)或幾個(gè)目標(biāo)峰，且當(dāng)有兩個(gè)以上的峰時(shí)必須都要有響應(yīng)值為準(zhǔn)。與該基質(zhì)的空白曲線對比，在低濃度范圍各做 40個(gè)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，根據(jù)檢出率確定LOD值。然后依據(jù)空白、1/2LOD、LOD、2LOD四個(gè)濃度基質(zhì)樣品各做的 40個(gè)重復(fù)試驗(yàn)所確定的檢出概率后制圖，便可得到可視化的“靈敏度”、“特異性”、“假陽性”、“假陰性”等性能指標(biāo)圖形。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2010，圖表的繪制采用Origin 9.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米粒子表征

以金納米粒子溶膠為SERS增強(qiáng)基底，該溶膠外觀呈現(xiàn)酒紅色，澄清透明。紫外-可見吸收光譜測試結(jié)果表明該金納米粒子最大吸收峰為538 nm處，如圖2a所示。

圖2b為金納米增強(qiáng)粒子透射電鏡測試結(jié)果，圖中顯示該金納米溶膠的粒徑分布較為均勻，無團(tuán)聚現(xiàn)象，粒子分散性較好。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，該金納米粒子中粒子尺寸分布在55～60 nm之間，粒子為橢球狀，表面具有一定粗糙度，具有較強(qiáng)SPR效應(yīng)，可以有效增待測分子拉曼信號，適合作為SERS基底。

2.2 測試條件優(yōu)化

2.2.1 優(yōu)化納米金用量

為了獲得孔雀石綠測試時(shí)的金納米溶膠最佳用量，本研究對樣品測試時(shí)金納米溶膠添加量進(jìn)行了研究，如圖3所示。結(jié)果表明，在40 μL 10 μg/L的孔雀石綠溶液里，一定范圍內(nèi)隨著金納米粒子用量的增加，孔雀石綠拉曼信號響應(yīng)越強(qiáng)；但當(dāng)金納米溶膠添加量大于400 μL時(shí)，拉曼信號響應(yīng)反而有所降低，這是由于金納米溶膠添加量過多，待測樣液被稀釋，孔雀石綠拉曼信號響應(yīng)隨之下降；當(dāng)金納米溶膠添加量為200～300 μL之間時(shí)，拉曼信號響應(yīng)差別不大，因此確定在40 μL 10 μg/L的孔雀石綠溶液里，金納米溶膠的添加量為200 μL。

2.2.2 優(yōu)化促凝劑種類

研究確定當(dāng)金納米溶膠添加量為 200～300 μL之間時(shí)，拉曼信號響應(yīng)差別不大。所以促凝劑的體積確定為40 μL，這樣總的進(jìn)樣體積就不會(huì)超過300 μL，待測液的濃度就不會(huì)被稀釋到響應(yīng)值受影響的程度。但不同的無機(jī)鹽作為促凝劑對具體樣品的增強(qiáng)效果有所不同，這里主要研究了兩種促凝劑種類，即 NaCl和KI（如圖4）。由圖可見，促凝劑KI相較于NaCl，在相同濃度的孔雀石綠溶液里，可以更有效的增加所有特征峰的峰強(qiáng)度。

2.2.3 靜置時(shí)間優(yōu)化

在進(jìn)樣時(shí)發(fā)現(xiàn)，孔雀石綠在最開始的兩次檢測中“1610 cm-1”特征峰都未出現(xiàn)，需要一定時(shí)間，才會(huì)顯現(xiàn)。隨著靜置時(shí)間的延長其特征峰強(qiáng)度增強(qiáng)趨勢如圖5所示，經(jīng)研究當(dāng)樣品與促凝劑結(jié)合，加入納米金后，隨時(shí)間增長，孔雀石綠的特征峰響應(yīng)值會(huì)趨于增強(qiáng)，靜置5 min以后，結(jié)果會(huì)趨于穩(wěn)定。

研究中加入適量的含氧離子促凝劑，可以打破溶膠體系的電離平衡，從而使溶膠顆粒凝聚，這與體系中的等離子共振條件有直接的關(guān)系，可以引起物理效果的增強(qiáng)[17]。靜置時(shí)間即為體系達(dá)到平衡的時(shí)間，也是使物理增強(qiáng)效果最佳時(shí)間。所以為了達(dá)到最好的檢測結(jié)果，選擇連續(xù)檢測，直至特征峰趨穩(wěn)后，確定最好的檢測時(shí)間。因此，本方法最好的進(jìn)樣靜置時(shí)間是5 min。

2.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.3.1 提取試劑的選擇

水產(chǎn)類制品基質(zhì)復(fù)雜，提取試劑的選擇是影響檢測結(jié)果的重要因素?？兹甘G和結(jié)晶紫是三苯甲烷類化合物，首先選擇乙腈作為提取劑，它能有效的進(jìn)入基體組織提取目標(biāo)物[18]。如圖 6a所示，研究發(fā)現(xiàn)對于不同種類水產(chǎn)基質(zhì)，檢測特征峰的響應(yīng)值有所區(qū)別，蝦類基質(zhì)的檢測結(jié)果差別很大?？赡苁俏r肉基質(zhì)的膠質(zhì)原因在超聲過程中無法完全分散在乙腈中，因此，提取過程嘗試加水，結(jié)果顯示，提取試劑為50%乙腈水溶液時(shí)，三個(gè)特征峰的響應(yīng)值有明顯提高。

為了驗(yàn)證水促進(jìn)蝦基質(zhì)在提取液中均勻分散作用，是特征峰響應(yīng)值升高的原因，用魚基質(zhì)做了相同實(shí)驗(yàn)，同樣發(fā)現(xiàn)三個(gè)特征峰拉曼強(qiáng)度提升超過30%左右圖6b，說明水不僅起到了分散基質(zhì)作用，還增強(qiáng)了基質(zhì)中待測目標(biāo)物在提取液中提取效果。

最后，以純水、純乙腈以及三種體積比的水/乙腈為提取液，如圖6c可知，乙腈水的混合物做提取劑可以比單純的乙腈或水的提取效率都高。當(dāng)提取液為體積比為1:1的水/乙腈時(shí)，它的提取效率最高。但在實(shí)際操作時(shí)，體積比1:1的水/乙腈在與石油醚萃取的過程中，產(chǎn)生大量的泡沫，需靜置分層并離心。體積比為1:2的水/乙腈的提取液，靜置即可快速分層。所以，本方法采用的是1:2的水/乙腈的提取液。

有研究表明，在鹽溶液中，當(dāng)乙腈與水體積比為1:1時(shí)，乙腈相與水相的相比較大[19]，可以促使上相的有機(jī)相中的極性較大的化合物向下相的水相中轉(zhuǎn)移，故而提高提取率。因本研究樣品均為水產(chǎn)，所以提取液里含有基質(zhì)所帶的鹽分，而孔雀石綠和結(jié)晶紫作為極性較大的化合物在此提取液中，也會(huì)向水相中轉(zhuǎn)移，從而提高萃取率。

2.3.2 氧化劑和還原劑的選擇

前處理過程包括待測物提取，凈化以及濃縮。在凈化過程中，發(fā)現(xiàn)石油醚能有效提取乙腈提取液中的隱色孔雀石綠，顯色孔雀石綠并不能有效的被提取。所以需要先將乙腈提取液中的孔雀石綠全部還原成隱色孔雀石綠。而在拉曼檢測時(shí)，顯色孔雀石綠可以顯示更好的拉曼特征峰型，所以檢測時(shí)再將隱色孔雀石綠氧化成顯色孔雀石綠進(jìn)行檢測。

在還原劑的選擇中，考查了乙醇、硫代硫酸鈉、硼氫化鉀以及亞硫酸鈉四種常用的還原劑。保持其它實(shí)驗(yàn)參數(shù)不變，如圖7a，根據(jù)峰型和響應(yīng)值來看，乙醇和亞硫酸鈉在“1610 cm-1”的響應(yīng)值不強(qiáng)首先排除。比較硫代硫酸鈉和硼氫化鉀在“939 cm-1”，硼氫化鉀的響應(yīng)值是最好的，而且硫代硫酸鈉的還原性較弱，使峰型沒有較好的分開，在“1610 cm-1”的峰型較寬，所以相較其他三個(gè)還原劑，硼氫化鉀的效果是最好的。因?yàn)榕饸浠浀姆€(wěn)定性較差，將其配在1 g/L的KOH里，可以延長使用時(shí)間，在一周內(nèi)保持穩(wěn)定[20]。因此選擇硼氫化鉀作為還原劑。

在氧化劑的選擇中，考查了四氯苯醌和二氯二氰基苯醌（DDQ）。因?yàn)镈DQ是一種主要用于芳香化合物脫氫成雙鍵的氧化劑[21]，孔雀石綠以及結(jié)晶紫都是含有苯環(huán)的芳香類化合物可被氧化。四氯苯醌與DDQ同為醌類氧化劑，有著相似的氧化機(jī)理，同樣也可以被用于孔雀石綠和結(jié)晶紫的氧化[22]。為了驗(yàn)證氧化劑的氧化效果，在控制其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)的前提下，進(jìn)行了比較。如圖 7b所示，在低濃度的孔雀石綠中，DDQ做為氧化劑可以獲得更加清晰的峰型，相較與四氯苯醌的試驗(yàn)結(jié)果，939 cm-1、795 cm-1這兩個(gè)特征峰更加明顯。因此，選擇DDQ做為氧化劑。

2.4 定性方法及檢出限

按2.2步驟測定，由分析人員分別對蝦、魚、蟹、貝四類樣品進(jìn)行最低添加量的檢測，與空白樣品的峰型進(jìn)行對照，各做40個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)檢出概率得出LOD。然后依據(jù)空白、1/2LOD、LOD、2LOD四個(gè)濃度基質(zhì)樣品各做的 40個(gè)重復(fù)試驗(yàn)所確定的檢出概率制圖，繼而獲得“靈敏度”、“特異性”、“假陽性”、“假陰性”等性能指標(biāo)可視化圖。以三文魚中的孔雀石綠為例，在孔雀石綠為0.50 μg/kg時(shí)，仍可明顯看見可見峰，且檢出概率≥95%，濃度為0.25 μg/kg時(shí)峰型衰弱，939 cm-1趨近于無，如圖8a，且檢出概率僅為65%，可初步判定LOD為0.50 μg/kg。由獲得的POD圖8b也可得出，當(dāng)孔雀石綠濃度大于0.50 μg/kg時(shí)，靈敏性≥95%，特異性≥95%，假陰性≤5%，假陽性≤5%符合了快速檢測定性的要求。最后，根據(jù)dPOD參數(shù)評價(jià)定性方法與標(biāo)準(zhǔn)方法 GB/T 20361-2006的一致性[23]，確定檢出限。當(dāng)dPOD的置信區(qū)間（LCL，UCL）覆蓋0時(shí)，則認(rèn)為該定性方法與標(biāo)準(zhǔn)方法無差異。本例中，根據(jù)dPOD的置信區(qū)間可知，如圖8c，該定性方法對空白樣品的檢測特異性與標(biāo)準(zhǔn)方法一致，當(dāng)濃度≥0.5 μg/kg時(shí)，該定性方法的檢測靈敏度與標(biāo)準(zhǔn)方法一致，因此該定性方法的檢出限定為0.5 μg/kg。

在實(shí)際檢測應(yīng)用過程中，使用該方法對五批次水產(chǎn)魚制品進(jìn)行了檢測。檢測出其中一批次的鯽魚樣品呈陽性（如圖9）。經(jīng)國標(biāo)方法GB/T 20361-2006檢測，結(jié)果為0.8 μg/kg，快檢方法與國標(biāo)結(jié)果比對無差異性。

3 結(jié)論

本方法建立的測定水產(chǎn)中的孔雀石綠和結(jié)晶紫表面增強(qiáng)拉曼光譜快速檢測方法，確定出孔雀石綠及結(jié)晶紫的蝦、蟹類檢出限為 1.00 μg/kg，魚、貝類檢出限為0.50 μg/kg，靈敏性≥95%，特異性≥95%，假陰性≤5%，假陽性≤5%符合了快速檢測定性的要求，操作簡單、快速有效，易于推廣。從樣品的制備，到前處理再到儀器分析，只需40 min，且有較低的檢出限，可以符合日常對于該物質(zhì)的檢測要求。同時(shí) POD定性模型的使用，精準(zhǔn)有效的驗(yàn)證了該方法的適用性，促進(jìn)現(xiàn)場快速檢測方法在食品安全監(jiān)管中的使用。