黃周梅，武旭悅，黃金發(fā)，袁真宏，畢潔，王加華，舒在習(xí)，肖安紅，戴煌*

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023）（2.大宗糧油精深加工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023）（3.湖北省農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023）（4.山東新希望六和集團(tuán)有限公司,山東青島 266100）

黃曲霉毒素主要是由黃曲霉、寄生曲霉和黑曲霉及亞種等在合適的溫度和濕度條件下產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)人畜有強(qiáng)烈的致病性、致癌性，嚴(yán)重危害人體健康，在糧油、飼料以及副產(chǎn)品中廣泛存在[1-3]。黃曲霉毒素性質(zhì)穩(wěn)定、毒性高、易致癌，已被視為世界范圍內(nèi)重要的食品污染物[4]。黃曲霉毒素有多種亞型結(jié)構(gòu)[5]，其中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）被認(rèn)為是已知化學(xué)致癌物質(zhì)中最強(qiáng)的致癌物質(zhì)，常見于花生、玉米、小麥等糧食及其制品中[4,6,7]。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)食品中 AFB1含量對(duì)保障食品安全，維護(hù)人類健康至關(guān)重要。傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)方法，如高效液相色譜、薄層色譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[8-12]，具有檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但這些方法耗時(shí)長且難以實(shí)現(xiàn)快速靈敏的檢測(cè)[13,14]。近年來食品安全事件屢見不鮮，消費(fèi)者對(duì)食品安全關(guān)注越來越關(guān)注，市場(chǎng)對(duì)快速檢測(cè)技術(shù)需求也日益旺盛?；诿庖叻ㄩ_發(fā)出的快速檢測(cè)方法具有高度的選擇性和靈敏度，已成為極具競(jìng)爭(zhēng)力的檢測(cè)技術(shù)之一。然而這些快速檢測(cè)方法在使用過程中往往受到高成本和穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)的限制[5]。其次，基于免疫法的信號(hào)標(biāo)記物不穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果易受環(huán)境因素影響而導(dǎo)致假陽性。為了克服這些缺陷，急需尋找能穩(wěn)定信號(hào)物的新方法。因此，開發(fā)新型材料來保持信號(hào)標(biāo)記物生物催化活性，使信號(hào)標(biāo)記物能夠在復(fù)雜多變的環(huán)境下保持著優(yōu)異的穩(wěn)定性是當(dāng)前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

金屬-有機(jī)框架（metal-organic frameworks，MOFs）材料是一類結(jié)晶無機(jī)-有機(jī)雜化材料，具有多種獨(dú)特的性質(zhì)[15-17]。例如，其開放式結(jié)構(gòu)和多峰孔隙率允許有效的傳質(zhì)，在溫和條件下合成，具有良好生物相容性、化學(xué)和熱穩(wěn)定性。這些特性引起了研究者們極大興趣，采用MOFs作為固定基質(zhì)來解決酶穩(wěn)定性和降低檢測(cè)成本[18-20]。研究發(fā)現(xiàn)，利用仿生礦化方法將酶封裝到MOFs中，復(fù)合物在極端環(huán)境下能有效保持酶的生物催化活性，同時(shí)能擴(kuò)展酶催化環(huán)境中pH和溫度的應(yīng)用范圍[21,22]。目前已經(jīng)開發(fā)出多種MOFs作為酶載體，如沸石咪唑酯骨架結(jié)構(gòu)材料-8（zeolitic imidazolate framework-8，ZIF-8）[23]、HKUST-1[24]、MIL-101（Cr）[15]、HP-PCN-224（Fe）[25]等。最近，以ZIF-8作為固定化載體，利用仿生礦化方法在酶表面生成的保護(hù)涂層，以提高酶的穩(wěn)定性和可重復(fù)性是研究熱點(diǎn)[26,27]。在此啟發(fā)下，利用仿生礦化方法在酶表面生成保護(hù)涂層作為酶聯(lián)免疫法的信號(hào)標(biāo)記物，以增加酶抗極端環(huán)境干擾能力，提高檢測(cè)信號(hào)穩(wěn)定性是可行的嘗試。

本研究中，利用仿生礦化方法在ZIF-8包埋HRP（HRP@ZIF-8）作為信號(hào)標(biāo)記物，在HRP表面生成的ZIF-8保護(hù)涂層，結(jié)合酶聯(lián)免疫技術(shù)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）建立比色法對(duì)AFB1靈敏檢測(cè)。ZIF-8的高表面積和有序的孔隙率可以增強(qiáng)HRP負(fù)載量以獲得較強(qiáng)的比色信號(hào)。為了構(gòu)建良好的比色信號(hào)探針，在 HRP@ZIF-8表面修飾多巴胺（dopamine，DA）形成聚多巴胺（polydopamine，PDA）層。金屬-聚多巴胺框架同時(shí)具有MOFs和PDA的優(yōu)點(diǎn)，表面富含芳環(huán)的PDA可以通過疏水-親水相互作用或π-π堆積來修飾生物分子。以ZIF-8作為模板制備了具有豐富π電子的HRP@ZIF-8/PDA復(fù)合物與免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）偶聯(lián)，合成信號(hào)標(biāo)記物 HRP@ZIF-8/PDA/IgG。利用該復(fù)合物催化3,3’5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）顯色來構(gòu)建間接競(jìng)爭(zhēng)免疫比色法檢測(cè) AFB1，基于MOF-ELISA檢測(cè)法中HRP@ZIF-8/PDA/IgG增加了酶抗極端環(huán)境干擾的能力，提高了檢測(cè)信號(hào)的穩(wěn)定性。該系統(tǒng)建立了一種通用、快速、靈敏的比色法，實(shí)現(xiàn)了AFB1的肉眼快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

Zn(NO3)2·6H2O、2-甲基咪唑（2-methylimidazole，2-MI）、即用型TMB顯色液、HRP、96孔微孔板（高結(jié)合力，白色）購自武漢飛揚(yáng)生物科技有限公司；多巴胺鹽酸鹽、三(羥甲基)氨基甲烷（Tris）等化學(xué)試劑均為分析純，購買于天津化學(xué)試劑公司。脫氧雪腐烯醇（deoxynivalenol，DON）、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），小鼠單克隆抗AFB1抗體（Ab1，10.0 mg/mL，1 mL），AFB1偶聯(lián)BSA（AFB1-BSA，5.0 mg/mL），兔抗鼠IgG購自山東綠都生物科技有限公司（中國山東）；N-羥基-磺基琥珀酰亞胺（NHS）/N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亞胺（EDC）來自Sigma-Aldrich公司（中國上海）。Milli-pore超純水（18.2 MΩ/cm，美國Millipore公司）用作溶劑。除非特別說明，所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

1.2 儀器

EnVision多功能酶標(biāo)儀，新加坡Perkin Elmer公司；JEM-2010透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM），日本電子株式會(huì)社；RigakuD/max-2400 X 射線衍射（X-ray diffraction，XRD），日本島津公司；TGA 4000熱重分析儀（thermal gravimetric analyzer，TGA），美國林賽斯公司；DXR 2xi顯微拉曼成像光譜儀，英國雷尼紹公司；3H24RI臺(tái)式智能高速冷凍離心機(jī)，德國賀利氏公司。

1.3 HRP@ZIF-8/PDA/IgG生物復(fù)合材料的合成

2 mol/L鋅離子、1 mg/mL HRP和0.5 mol/L 2-MI在離心管中混合，總體積為720 μL，混合液振蕩后在室溫下保持30 min。懸浮液在4 ℃下11000 r/min離心15 min，沉淀用去離子水洗。取500 μL HRP@ZIF-8溶液與1 mL 25 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液混合，加入500 μL 0.1 mol/L DA溶液，劇烈攪拌5 min后，在室溫下輕微振搖2 h，形成的懸浮液在4 ℃下11000 r/min離心15 min。沉淀用去離子水清洗后分散在1 mL 10 mmol/L pH 7.4 PBS中。將EDC/NHS活化后的20 μL 0.5 mg/mL IgG添加到懸浮液中，在室溫下孵育 30 min，置于4 ℃冰箱中連續(xù)振搖過夜。離心收集沉淀，用10 mmol/L pH 7.4 PBS洗滌3次，去除未結(jié)合的IgG。將獲得的HRP@ZIF-8/PDA/IgG復(fù)合物重新分散在1.0 mL 10 mmol/L pH 7.4 PBS中，置于冰箱中備用。

1.4 酶濃度和封裝效率的測(cè)定

將300 μL 2 mol/L 鋅離子、300 μL 0.5 mol/L 2-MI和120 μL不同濃度HRP在離心管中混合，混合液振蕩后在室溫下保持 30 min。懸浮液在 4 ℃下 11000 r/min離心15 min，取上清液檢測(cè)。固定化后上清液的酶濃度根據(jù)HRP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算來確定。包封率定義為包埋在HRP@ZIF-8復(fù)合材料中的HRP含量與HRP初始量的比值，其計(jì)算公式如下：

式中：

C1——HRP@ZIF-8復(fù)合材料中的上清液HRP濃度；

C2——最初的HRP濃度，mg/mL。

1.5 HRP@ZIF-8/PDA復(fù)合材料穩(wěn)定性檢測(cè)

熱穩(wěn)定性：分別將 HRP、HRP@ZIF-8和HRP@ZIF-8/PDA復(fù)合材料置于不同溫度下（30～100 ℃）孵育 30 min，分別取出后用于評(píng)估復(fù)合材料在不同溫度環(huán)境中的穩(wěn)定性，通過測(cè)定不同溫度處理后HRP的相對(duì)活性來表示。

pH穩(wěn)定性：分別將 HRP、HRP@ZIF-8和HRP@ZIF-8/PDA復(fù)合材料置于pH 3 HCl溶液、pH 9 KOH溶液和不同pH的PBS緩沖液（pH 4～8.0）中1 h，分別取出后用于評(píng)估復(fù)合材料在不同pH環(huán)境中的穩(wěn)定性，通過測(cè)定不同pH處理后HRP的相對(duì)活性來表示。

1.6 基于MOF-ELISA檢測(cè)AFB1的原理

利用仿生礦化將HRP包裹在ZIF-8中，提高HRP在極端環(huán)境下的耐受能力和穩(wěn)定性，隨后將鹽酸多巴胺修飾在HRP@ZIF-8復(fù)合物表面，為IgG提供結(jié)合位點(diǎn)，合成HRP@ZIF-8/PDA/IgG信號(hào)標(biāo)記物。在檢測(cè)AFB1時(shí)，采用間接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)，將AFB1-BSA固定在酶標(biāo)板上，加入固定濃度的抗體，樣品中 AFB1與酶標(biāo)板上固定的 AFB1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，清洗移除未結(jié)合抗體后加入 HRP@ZIF-8/PDA/IgG，加入即用型TMB顯色液檢測(cè)可見光譜信號(hào)，通過測(cè)定結(jié)合在酶標(biāo)板上信號(hào)分子的量來確定AFB1濃度，具體如圖1所示。

1.7 AFB1比色法的建立和選擇性檢測(cè)

取96孔板，在每個(gè)孔內(nèi)加入100 μL 0.1 mg/mL AFB1-BSA，37 ℃孵育 2 h后清洗，用含有 1.5%BSA-PBST在37 ℃封閉1 h后清洗。每孔中加入50 μL 0.1 mg/mL AFB1抗體溶液和50 μL標(biāo)準(zhǔn)AFB1/分析溶液，37 ℃孵育 1 h后清洗。每孔中加入 100 μL HRP@ZIF-8/PDA/IgG孵育1 h后清洗；加入50 μL即用型TMB溶液反應(yīng)，隨后加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)吸光度。為了評(píng)估所建立方法的選擇性，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下研究了其他常見真菌毒素（AFB2、AFG1、AFG2和DON）。每次測(cè)試至少3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.8 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

從湖北省武漢市當(dāng)?shù)爻惺占竺讟悠泛兔娣蹣悠穬?chǔ)存在4 ℃冰箱中備用。樣品提取步驟如下：取4.00 g經(jīng)過研磨的大米與10 mL甲醇水溶液（80:20，V/V）混合，然后劇烈攪拌5 min。將混合物以5000 r/min離心20 min。離心后的100 μL上清液用500 μL pH 7.4 PBS稀釋。將4.00 g面粉與10 mL甲醇水溶液混合，劇烈攪拌5 min?；旌衔镫x心后取5 μL上清液用PBS稀釋。將不同濃度的AFB1加入稀釋液中，作為AFB1的加標(biāo)樣品進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。加標(biāo)樣品中 AFB1的濃度通過給出的比色法測(cè)定，然后計(jì)算回收率。每次測(cè)試至少3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.9 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)處理均作3個(gè)平行，試驗(yàn)中測(cè)定所得的數(shù)據(jù)使用Origin 2017軟件進(jìn)行分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HRP@ZIF-8/PDA復(fù)合材料的表征

采用 SEM、XRD、TGA來表征 ZIF-8和HRP@ZIF-8復(fù)合材料的晶體結(jié)構(gòu)和形貌。圖2a和2b為ZIF-8封裝HRP前后的SEM圖，可以看出其平均粒徑分別為100±2.8 nm和100±3.2 nm。ZIF-8的形貌表現(xiàn)為典型的菱形十二面體幾何結(jié)構(gòu)，其形貌在HRP封裝前后沒有明顯變化。從圖 2c中可看出，HRP@ZIF-8/PDA較ZIF-8和HRP@ZIF-8的形貌并無明顯變化，平均粒徑為102±3.5 nm，表明HRP和PDA的修飾不會(huì)破壞 ZIF-8的結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證HRP@ZIF-8/PDA合成，采用拉曼光譜表征。圖2d顯示了HRP@ZIF-8和HRP@ZIF-8/PDA納米復(fù)合材料的拉曼光譜圖。1500 cm-1的吸收峰主要源自于 C=C鍵振動(dòng)，1550 cm-1～1580 cm-1主要是N=N鍵振動(dòng)，2800 cm-1～3000 cm-1譜帶主要源于C-H鍵振動(dòng)，此外687 cm-1和1142 cm-1處呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的吸收譜帶，來自咪唑和 Zn-N[28]，表明 ZIF-8 成功合成。1680 cm-1～1820 cm-1處的譜帶，對(duì)應(yīng)于酰胺I帶，主要源自C=O拉伸模式，表明復(fù)合材料中存在酶。同時(shí)550 cm-1～800 cm-1處的譜帶主要是C-Cl鍵的振動(dòng)，1610 cm-1～1680 cm-1譜帶的振動(dòng)主要是C=N鍵的振動(dòng)，表明PDA已成功修飾到 HRP@ZIF-8上。結(jié)果表明 HRP@ZIF-8和HRP@ZIF-8/PDA納米復(fù)合材料成功合成。為了確認(rèn)添加HRP和PDA后ZIF-8的結(jié)晶度有沒有被破壞，采用 XRD衍射進(jìn)行驗(yàn)證，HRP@ZIF-8和HRP@ZIF-8/PDA納米復(fù)合材料的XRD圖案（圖2e）與模擬ZIF-8的圖案相同，該結(jié)果表明HRP的封裝和PDA的包封不影響ZIF-8的晶體結(jié)構(gòu)。為了驗(yàn)證復(fù)合材料的熱穩(wěn)定性，在氦流下對(duì)合成樣品進(jìn)行熱重分析（圖2f）。ZIF-8表現(xiàn)出11.8%的逐漸失重，溫度升高直至約200 ℃，對(duì)應(yīng)于從納米晶體表面去除空腔中的客體分子（主要為H2O）或未反應(yīng)的物質(zhì)（如2-MI）。在200～500 ℃范圍內(nèi)相對(duì)質(zhì)量顯示在長平臺(tái)內(nèi)穩(wěn)定，表明 ZIF-8具有良好的熱穩(wěn)定性。HRP@ZIF-8和HRP@ZIF-8/PDA 的 TGA 曲線都顯示出從150～400 ℃逐漸分解，這是由于復(fù)合材料中蛋白質(zhì)的降解導(dǎo)致。HRP@ZIF-8/PDA在500～700 ℃逐漸分解主要是去除未反應(yīng)的PDA。從紫外可見吸收光譜可以看出HRP@ZIF-8和HRP@ZIF-8/PDA催化TMB反應(yīng)在450 nm處都出現(xiàn)了典型的特征峰（圖2g），ZIF-8的多峰孔隙率允許有效傳質(zhì)，使顯色底物 TMB/H2O2靠近包埋的HRP而發(fā)生反應(yīng)。圖2g插圖也證明HRP已成功被包埋到ZIF-8中，使得TMB轉(zhuǎn)變成藍(lán)色，具有優(yōu)異的催化能力，同時(shí) HRP@ZIF-8/PDA較HRP@ZIF-8的吸收峰沒有明顯差異，這表明PDA不會(huì)影響 HRP@ZIF-8的催化能力。以上事實(shí)驗(yàn)證了HRP@ZIF-8和HRP@ZIF-8/PDA生物復(fù)合材料已成功合成，并具有良好的催化活性。

2.2 最適HRP濃度和封裝效率的確定

HRP@ZIF-8作為ELISA的信標(biāo)物時(shí)，包埋HRP的濃度影響 AFB1檢測(cè)的靈敏度和檢測(cè)限。為了確定最佳的HRP濃度和封裝效率，利用一定質(zhì)量的ZIF-8包埋不同濃度的HRP，并與初始HRP濃度進(jìn)行比較，以確定最佳酶濃度和封裝效率。結(jié)果如圖3顯示，隨著HRP濃度從0.2 mg/mL增加到1 mg/mL，HRP的包封效率從58.00%提高到98.60%。當(dāng)HRP濃度持續(xù)增加，包封率卻逐漸下降，這可能是由于高HRP濃度下成核位點(diǎn)數(shù)量的增加，導(dǎo)致HRP封裝不足。因此，最終選擇包埋HRP濃度為1 mg/mL。

2.3 HRP@ZIF-8/PDA穩(wěn)定性的測(cè)定

為了驗(yàn)證HRP@ZIF-8和HRP@ZIF-8/PDA生物復(fù)合材料的穩(wěn)定性，探究了不同溫度和pH值對(duì)生物復(fù)合材料催化活性的影響。結(jié)果如圖4a所示，隨著溫度的升高，游離HRP的相對(duì)活性在逐漸降低，當(dāng)溫度升高到 100 ℃時(shí)，相對(duì)活性僅為 47.78%。而HRP@ZIF-8和HRP@ZIF-8/PDA生物復(fù)合材料隨著溫度的升高依然還保持到 70%相對(duì)活性（圖 4a）。HRP@ZIF-8的重要優(yōu)勢(shì)是ZIF-8作為保護(hù)層，可以在高溫度（80 ℃、90 ℃和 100 ℃）下保持礦化使得HRP具有較高的活性。HRP@ZIF-8和HRP@ZIF-8/PDA生物復(fù)合材料廣泛的溫度范圍最有可能來自于 ZIF-8的剛性結(jié)構(gòu)對(duì) HRP的緊密封裝。ZIF-8剛性結(jié)構(gòu)將 HRP限制在結(jié)構(gòu)中，限制了 HRP結(jié)構(gòu)因外界高溫環(huán)境導(dǎo)致的展開運(yùn)動(dòng)[26]，從而抑制了隨后的聚集過程，ZIF-8剛性結(jié)構(gòu)一定程度上維持HRP原有結(jié)構(gòu)，使HRP保持生物催化活性。如圖4b所示，對(duì)于游離HRP，最佳pH值為5.5，當(dāng)pH值為3、6、7、8和9時(shí)，游離HRP分別保持其最高活性的86.57%、82.23%、70.72%和63.53%。這表明游離HRP在極酸性或堿性條件下的催化活性較低。然而，HRP@ZIF-8和HRP@ZIF-8/PDA生物復(fù)合材料在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)表現(xiàn)出比游離HRP更高的相對(duì)催化活性，特別是在極酸性（pH 3）和堿性（pH 9）條件下分別達(dá)到93.41%、79.24%和92.92%、80.30%的相對(duì)催化活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HRP@ZIF-8和HRP@ZIF-8/PDA生物復(fù)合材料在酸性和堿性介質(zhì)環(huán)境中表現(xiàn)出增強(qiáng)耐受性，可能是由于ZIF-8作為固定基質(zhì)具有合適的緩沖功能導(dǎo)致。結(jié)果驗(yàn)證了 HRP@ZIF-8和HRP@ZIF-8/PDA生物復(fù)合材料可以忍受極端條件，并保持較高的催化活性。

2.4 MOF-ELISA檢測(cè)方法的建立及靈敏度評(píng)價(jià)

通過向反應(yīng)體系中分別加入0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、15.00和20.00 ng/mL AFB1，觀察溶液顏色變化情況并用酶標(biāo)儀檢測(cè)紫外可見吸收光譜。結(jié)果如圖5a所示，隨著AFB1濃度升高，反應(yīng)后溶液顏色逐漸由藍(lán)色變?yōu)闊o色，在450 nm處吸光度逐漸降低。當(dāng)AFB1濃度為20 ng/mL，溶液顏色幾乎為無色透明。同時(shí)AFB1濃度與450 nm處吸光度值呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，如圖5b所示。AFB1濃度在0.01～20.00 ng/mL之間時(shí)，得到的線性回歸方程為y=0.03×C[AFB1]+0.79，R2=0.99，檢測(cè)限為72.00 pg/mL，低于國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 2761-2011 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中對(duì)于谷物及其制品中 AFB1的最大限量（20 ng/mL），其檢測(cè)限降低了 3～4個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)比于利用HRP的商業(yè)ELISA試劑盒檢測(cè)AFB1的方法，試劑盒檢測(cè)AFB1的線性檢測(cè)范圍為0.1～10 ng/mL，檢測(cè)限為620.00 pg/mL[29]，而本研究利用ZIF-8仿生礦化原理包埋HRP作為信標(biāo)物，使得線性檢測(cè)范圍更廣，檢測(cè)限更低，提高了HRP在極酸、極堿和極端溫度下的耐受能力和HRP的穩(wěn)定性，在AFB1的檢測(cè)中也可發(fā)揮更好的催化作用，具有更高的靈敏度。結(jié)果表明，所構(gòu)建的 MOF-ELISA比色法對(duì)于檢測(cè)AFB1具有高靈敏性，滿足檢測(cè)要求。

2.5 特異性實(shí)驗(yàn)

為了研究所建立的 MOF-ELISA比色法對(duì)檢測(cè)AFB1的特異性，本研究選用 AFB2、AFG1、AFG2和DON結(jié)構(gòu)類似物作為潛在的干擾物，來測(cè)試方法的特異性。MOF-ELISA比色法對(duì)5.00 ng/mL AFB1和50.00 ng/mL其他真菌毒素在相同條件下進(jìn)行檢測(cè)。如圖 6所示，其他真菌毒素溶液顏色與空白對(duì)照組（即沒有AFB1目標(biāo)物）溶液顏色均呈現(xiàn)出明顯藍(lán)色，而含有AFB1樣品溶液顏色明顯淺于其他真菌毒素和對(duì)照組溶液顏色，表明通過肉眼可直接分辨含有AFB1樣品。在一定濃度AFB1抗體溶液中，加入AFB1后，AFB1被抗體特異性捕獲，導(dǎo)致吸光度值急劇下降，吸光度為0.60，而AFB2、AFG1、AFG2和DON的吸光度變化較小，吸光度在0.81～0.82之間，與空白組的吸光度（0.83）相當(dāng)。結(jié)果表明所建立的方法具有較好的選擇性，基于此建立的MOF-ELISA比色法具有較好的特異性。

2.6 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

為了評(píng)估開發(fā)的MOF-ELISA比色法用于AFB1檢測(cè)在實(shí)際樣品分析中的準(zhǔn)確性，將不同濃度 AFB1添加到米粉和面粉樣品提取液中進(jìn)行回收率測(cè)試。根據(jù)上述擬合的回歸方程y=0.03×C[AFB1]+0.79來計(jì)算加標(biāo)樣品中的AFB1濃度，測(cè)定結(jié)果列于表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在四種添加量中，含有0.50、1.00、2.00和5.00 ng/mL AFB1的米粉樣品回收率在 96.00%～105.00%之間，RSD范圍為2.26%～4.15%（n=3）；在含有0.50、1.00、2.00和5.00 ng/mL AFB1的面粉樣品回收率在82.00%～110.00%之間，RSD范圍為1.20%～4.39%。米粉和面粉的基質(zhì)干擾幾乎可以忽略不計(jì)，加標(biāo)回收率的RSD均小于 5%，表明該方法的重復(fù)性良好。結(jié)果表明，所建立的MOF-ELISA比色法具有良好的抗基質(zhì)干擾能力，可用于米粉和面粉中AFB1含量檢測(cè)。

表1 米粉和面粉樣品中AFB1的回收率研究Table 1 Detection results of the AFB1 levels in spiked rice flour and wheat flour

3 結(jié)論

本研究基于ZIF-8仿生礦化原理，構(gòu)建了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA比色法，用于米粉和面粉中AFB1的檢測(cè)。ZIF-8通過仿生礦化方法完成了HRP的簡(jiǎn)單、快速封裝。通過優(yōu)化HRP濃度所獲得的HRP@ZIF-8生物復(fù)合材料顯著增強(qiáng)了對(duì)堿性環(huán)境和高溫的耐受性，同時(shí)保持較高的酶催化活性。利用 HRP@ZIF-8/PDA/IgG作為信號(hào)標(biāo)記物，可以實(shí)現(xiàn) AFB1的快速肉眼檢測(cè)，可見光吸光度與 AFB1濃度具有良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為72 pg/mL，低于國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定谷物中AFB1最大限量，比商業(yè)化的 AFB1檢測(cè)試劑盒檢測(cè)限更低，降低了3～4個(gè)數(shù)量級(jí)，本研究開發(fā)的AFB1檢測(cè)方法更靈敏，而且該方法對(duì)其他常見霉菌毒素具有良好的選擇性，在米粉和面粉基質(zhì)中具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。與其他檢測(cè)方法相比，基于ZIF-8的ELISA比色法具有成本低、檢測(cè)速度快和易于操作等優(yōu)點(diǎn)，為糧食中 AFB1的靈敏快速檢測(cè)提供了新方法。該方法未來可擴(kuò)展用于其他真菌毒素檢測(cè)研究，同時(shí)對(duì)實(shí)際霉變樣品進(jìn)行檢測(cè)，探索實(shí)際應(yīng)用的可行性。