陳嶺林，查學(xué)強(qiáng)，李強(qiáng)明，羅建平*，楊磊

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥 230601）

（2.安徽碗北老家農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，安徽阜陽 236400）

芥菜疙瘩（Brassica napiformisL. H. Bariley）又名辣疙瘩、大頭芥、大頭菜，是十字花科蕓薹屬植物芥菜的一個(gè)變種，為我國(guó)常用的蔬菜之一。傳統(tǒng)中醫(yī)藥記載，芥菜具有宣肺豁痰、溫中利氣的功效。現(xiàn)代研究表明，芥菜疙瘩中不僅具有普遍的生物活性成分（如膳食纖維、多糖、維生素、多酚和黃酮等），而且還具有十字花科植物特有的硫苷和其代謝產(chǎn)物異硫氰酸酯等生物活性成分，具有抗炎[1]和抗氧化[2]的生物活性。芥菜疙瘩在全國(guó)各省均有種植，其栽培面積超過1.0×106hm2，產(chǎn)量約 4.5×107t[3]。目前芥菜疙瘩的加工仍以傳統(tǒng)腌制小菜為主，加工手段初級(jí)、產(chǎn)品類型單一、附加值低、市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力弱，迫切需要改變傳統(tǒng)的加工模式，尋找新的加工利用途徑，從而改變產(chǎn)業(yè)發(fā)展困滯于產(chǎn)業(yè)鏈低端的局面。

慢性阻塞性肺疾?。–hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見的伴有氣流阻塞的慢性疾病，是世界上第四大致死疾病[4]。在中國(guó)，呼吸系統(tǒng)疾病死亡人數(shù)（主要是慢性阻塞性肺疾病）在主要疾病的死亡人數(shù)中排名第四[5]，且農(nóng)村死亡率明顯高于城市。果蔬超微粉對(duì)果蔬的有效成分具有更高的溶出率，其生物活性功能優(yōu)于普通粉[6-9]，采用超微粉碎技術(shù)對(duì)芥菜疙瘩凍干樣品進(jìn)行粉碎，能基本完整保留芥菜疙瘩的功效成分。本研究基于果蔬超微粉的優(yōu)良特性[10]，以脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）鼻腔滴注構(gòu)建 COPD小鼠模型，并以芥菜疙瘩普通粉（Brassica napiformisordinary powder，BOP）為對(duì)照，從抗炎和抗氧化的角度研究芥菜疙瘩超微粉（Brassica napiformisultrafine powder，BUP）對(duì)COPD小鼠肺炎的影響，旨在為芥菜疙瘩超微粉的高值化加工利用提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與動(dòng)物

芥菜疙瘩由安徽省臨泉縣安徽碗北老家農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供；BUP（粒徑18.311±0.008 μm）由芥菜疙瘩切塊凍干后經(jīng)中藥超微粉碎機(jī)以進(jìn)樣體積0.6 L、粉碎時(shí)間20 min制得；BOP（粒徑86.025±0.293 μm）由高速破碎機(jī)破碎芥菜疙瘩凍干樣品并過 60目孔篩制得。SPF級(jí) C57BL/6J小鼠（合格證編號(hào)：NO.202011402），購(gòu)買于常州市卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（許可證號(hào)：SCSK(蘇)2016-0010）。小鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn) SPF級(jí)動(dòng)物房（溫度：23±2 ℃，相對(duì)濕度：50%～60%，光照12 h/d），自由攝食攝水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

異硫氰酸烯丙酯、蘿卜硫苷，Sigma Inc.；蘆丁、沒食子酸，上海源葉生物科技有限公司；脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、地塞米松（Dexamethasone，Dex），白鯊生物科技有限公司；一氧化氮（Nitric oxide，NO）、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、ECL化學(xué)發(fā)光、RNA抽提試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；過氧化氫酶（Catalase，CAT）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（Superoxidase，SOD）試劑盒，南京建成科技有限公司；小鼠IL-1β、IL-6、IL-10 Elisa試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；iTaq Universal SYBR Green Supermix、iScript cDNA Synthesis試劑盒，Bio-Rad Laboratories, Inc.；CD11b、MHCII、F4/80、CD11c、FoxP3、CD25 抗體，BD Biosciences；CD68、Ly6G 抗體，賽維爾生物科技有限公司；p65、IκB、p-IκB、NF-κB、Nrf2 抗體，Proteintech，Group, Inc.；Phospho-NF-κB p65 抗體，Abclonal Biotech Co. Ltd.。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TU-1901紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SC21CL冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；XDW-6J超微粉碎機(jī)，濟(jì)南達(dá)微機(jī)械有限公司；Sl-150高速多功能粉碎機(jī)，江蘇永康市松青五金廠；WIX-EP600電泳儀，韋克斯科技(北京)有限公司；Varioskan Flash全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，Thermo Fisher公司；Image Quant LAS 4000 mini熒光成像系統(tǒng)，GE Healthcare公司；MoFlo XDP流式細(xì)胞儀，Beckman Coulter公司；P250 FLASH病理切片掃描顯微鏡，3D HISTECH公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 芥菜疙瘩粉體活性成分的測(cè)定

取適量BUP和BOP，按照GB 5009.88-2014測(cè)定其膳食纖維的含量，按照唐明明等[11]的方法測(cè)定多酚和黃酮的含量，按照Doorn等[12]的方法測(cè)定硫苷的含量，按照方海仙等[13]的方法異硫氰酸酯的溶出率；每組樣本獨(dú)立檢測(cè)3次。

1.3.2 小鼠實(shí)驗(yàn)分組造模、給藥及一般情況觀察

小鼠隨機(jī)分成 7組（n=8），分別為正常組（Control）、模型組（LPS）、陽性藥組（LPS+Dex）、超微粉高劑量組（LPS+6% BUP）、超微粉低劑量組（LPS+2% BUP）、普通粉高劑量組（LPS+6% BOP）和普通粉低劑量組（LPS+2% BOP）。造模參照J(rèn)anbazacyabar等[14]的方法，第 28 d造模結(jié)束后，LPS+Dex 按照 1 mg/(kg·d)地塞米松劑量給藥[15]，芥菜疙瘩粉體飼料高、低劑量[16]分別是100 g飼料中含有對(duì)應(yīng)粉體含量的6 g和2 g，其余組都給予正常飼料，連續(xù)30 d。整個(gè)周期結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行隔夜禁食處理。實(shí)驗(yàn)期間對(duì)小鼠一般情況觀察并記錄體重變化。

1.3.3 小鼠肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析

CO2處死小鼠，收集小鼠BALF[17]，將收集的細(xì)胞混勻后分成5個(gè)組別，即調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）組、樹突狀細(xì)胞（DC）組、肺泡巨噬細(xì)胞（AM）組、中性粒細(xì)胞（NE）組以及活性氧（ROS）組，分別加入各細(xì)胞對(duì)應(yīng)的熒光抗體，即 Treg為 CD25-FITC和Foxp3-APC、DC為CD11c-APC和MHCII-PE、AM為CD11c-APC和F4/80-FITC、NE為CD11b-FITC和Ly6G-PE，室溫（25 ℃）環(huán)境下孵育30 min后以流式細(xì)胞儀檢測(cè)幾種細(xì)胞的比例；BALF中ROS含量變化按照試劑盒說明書測(cè)定[18,19]。每組樣品重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)平行三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用flowjo（V 10.5.3，BD Life Sciences，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.4 肺組織病理學(xué)染色和免疫組化分析

CO2處死小鼠，收集小鼠肺組織，計(jì)算肺系數(shù)（肺組織重量與該小鼠對(duì)應(yīng)體重的比值）；肺組織以 4%多聚甲醛固定后分別按Li等[20]、Fleur等[21]和Wang等[22]的方法制備H&E染色、Masson染色、CD68和Ly6G免疫組化切片，并在顯微鏡下觀察、拍照。

1.3.5 小鼠肺組織中細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激相關(guān)因子的測(cè)定

取適量肺組織，分別以IL-1β、IL-6和IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)小鼠肺組織中細(xì)胞因子的含量進(jìn)行測(cè)定；分別以超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、一氧化氮和丙二醛檢測(cè)試劑盒測(cè)定小鼠肺組織中氧化應(yīng)激相關(guān)因子的含量。

1.3.6 肺組織RT-PCR分析

取適量肺組織，按照RNA提取試劑盒提出RNA，以 iScript cDNA Synthesis試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，參照iTaq Universal SYBR Green Supermix試劑盒進(jìn)行血紅素加氧酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）和醌氧化還原酶-1（NADPH quinineoxidoreductase-1，NQO-1）的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計(jì)算其相對(duì)mRNA的水平（以GAPDH為內(nèi)參）。引物購(gòu)買于生工生物工程股份有限公司，序列為：GADPH正向：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；HO-1正向：5′-CTGACCCATGACACCAAGGAC-3′，反向：5′-AAA GCCCTACAGCAACTGTCG-3′；NQO1 正向：5′-GGC AGAAGAGCACTGATCGTA-3′，反向：5′-TGATGGG ATTGAAGTTCATGGC-3′。

1.3.7 肺組織Western blot實(shí)驗(yàn)

取適量肺組織，對(duì)肺組織內(nèi)的全蛋白進(jìn)行提取，對(duì)所提蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)[23]，分別分析肺組織內(nèi) p65、p-p65、IκB、p-IκB、Nrf2 等蛋白的表達(dá)水平。用Image Quant LAS 4000 mini熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像并拍照保存，拍照結(jié)果用Image J軟件（以β-actin作為內(nèi)參）進(jìn)行灰度值分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以Mean±SD表示，運(yùn)用One-Way ANOVA檢驗(yàn)方法分析各組之間的顯著性差異，不同字母表示組與組之間具有顯著性差異（p＜0.05），根據(jù)統(tǒng)計(jì)的結(jié)果，用Orign 9.0軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 BUP的活性成分溶出率

表1 芥菜疙瘩普通粉（BOP）和超微粉(BUP)活性成分溶出率比較Table 1 Comparison of the dissolution rate of active ingredients in BOP and BUP

BUP的粒徑只有BOP的21%，兩種粉體的活性成分溶出率測(cè)定（表1）表明，BUP中可溶性膳食纖維、多酚、黃酮以及其特有的硫苷和異硫氰酸酯的溶出率均高于BOP，表明超微粉碎可使芥菜疙瘩中的活性成分更加容易釋放出來。

2.2 BUP對(duì)COPD小鼠一般情況及肺組織病理學(xué)的影響

小鼠經(jīng)過LPS造模以后，與正常組相比，其體重增長(zhǎng)速度開始減緩，精神狀態(tài)欠佳。造模結(jié)束后開始給藥，與模型組相比，陽性組小鼠和芥菜疙瘩粉體組小鼠體重增長(zhǎng)速度開始恢復(fù)，精神狀態(tài)開始恢復(fù)；并且BUP組小鼠的體重恢復(fù)速度比BOP組小鼠更快。解剖小鼠后對(duì)小鼠肺組織進(jìn)行肺系數(shù)計(jì)算可知，與正常組相比，模型組小鼠肺系數(shù)明顯增大；與模型組相比，陽性藥和芥菜疙瘩粉體組小鼠的小鼠肺系數(shù)降低。如圖1所示，LPS造模會(huì)導(dǎo)致COPD小鼠肺組織發(fā)生炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁和支氣管增粗（圖1a）、肺組織纖維化（圖1b），同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致小鼠肺組織支氣管發(fā)生巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1c）和肺泡壁中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1d）。通過給小鼠日糧飼料添加BUP可以緩解小鼠的COPD癥狀，雖然其作用效果與陽性藥地塞米松相比略有不足，但對(duì)肺組織的改善效果優(yōu)于BOP。

2.3 BUP對(duì)COPD小鼠肺泡灌洗液免疫細(xì)胞比例的影響

小鼠BALF中炎性相關(guān)細(xì)胞Treg、AM、DC和NE的流式細(xì)胞分析表明，與正常組小鼠BALF中Treg細(xì)胞比例（6.88%）相比，LPS造模導(dǎo)致小鼠 BALF中的Treg細(xì)胞比例變少（3.02%），陽性藥地塞米松明顯改善其比例（6.45%），芥菜疙瘩粉也能提升Treg的比例，其中BUP的效果最優(yōu)（5.89%）（圖2a）。同時(shí)，與正常組的AM（3.43%）、DC（19.87%）和NE（1.62%）的細(xì)胞比例相比，模型組小鼠BALF中的AM、DC和NE均顯著提高，分別升高了3.56、0.39和7.02倍，而給藥地塞米松和芥菜疙瘩粉體均能降低COPD小鼠BALF中AM、DC和NE細(xì)胞的比例，且BUP降低的比例優(yōu)于 BOP（圖 2b、2c、2d）。研究結(jié)果表明芥菜疙瘩能調(diào)節(jié)小鼠BALF中的細(xì)胞比例，進(jìn)而改善LPS引起的COPD。

2.4 BUP對(duì)COPD小鼠肺組織炎癥相關(guān)因子的影響

LPS造成炎性細(xì)胞大量聚集，釋放大量的炎性細(xì)胞因子參與肺的炎癥損傷過程[24]。通過圖 3a、3b分析得知，與正常組的促炎因子 IL-1β（226.95±4.48 pg/mg prot）和IL-6（134.97 pg/mg prot）的水平相比，通過LPS誘導(dǎo)小鼠COPD以后，肺組織中IL-1β和IL-6的水平分別增高到329.74 pg/mg prot和199.55 pg/mg prot，通過給藥陽性藥和芥菜疙瘩粉體具有抑制IL-1β和IL-6增多的趨勢(shì)；同理，如圖3c所示，與正常組抗炎因子 IL-10的水平（219.48 pg/mg prot）相比，COPD模型小鼠肺組織中其水平明顯降低（165.48 pg/mg prot），通過給予陽性藥和芥菜疙瘩粉體均能增高IL-10的水平，從而改善COPD小鼠的炎癥水平。

2.5 BUP對(duì)COPD小鼠肺組織炎性信號(hào)通路的影響

NF-κB信號(hào)通路是目前已知最主要的調(diào)節(jié)炎癥的通路之一，主要參與調(diào)控機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞的存活，在調(diào)節(jié)致病菌感染的免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用[25]。如圖4所示，通過對(duì)小鼠肺臟的炎性通路蛋白進(jìn)行western bloting分析，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，LPS誘導(dǎo)小鼠肺臟NF-κB通路的激活，其肺組織內(nèi)的p-p65（p-NF-κB）和 p-IκB 的表達(dá)增加，表明 NF-κB-p65可能向核內(nèi)轉(zhuǎn)移促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，從而誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生；而BUP能抑制COPD小鼠肺組織內(nèi)p65和IκB的磷酸化，從而改善COPD小鼠的炎癥，同時(shí)可以看出BUP在改善COPD小鼠炎性信號(hào)通路的效果優(yōu)于BOP。

2.6 BUP對(duì)COPD小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)因子和抗氧化酶系統(tǒng)的影響

越來越多的證據(jù)證明，活化的細(xì)胞體內(nèi)耗氧量會(huì)增加，從而導(dǎo)致ROS的過量產(chǎn)生，因此維持機(jī)體ROS的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[26]。從圖5可以看出，正常小鼠經(jīng)LPS誘導(dǎo)COPD后，其肺泡灌洗液活性氧平衡被破壞（5a），肺組織內(nèi)NO含量增加（5b，由15.14 pg/mg prot增加至27.41 pg/mg prot），CAT（5c），GSH-Px（5d）和SOD（5e）表達(dá)下降（分別由3.62 U/mg prot、251.43 μmol/mg prot、91.00 U/mg prot下降至 1.88 U/mg prot、90.36 μmol/mg prot、10.72 U/mg prot），促使氧自由基過量產(chǎn)生對(duì)機(jī)體有傷害的物質(zhì)MDA（5f，含量增加了152.71%），表明LPS破壞了COPD小鼠細(xì)胞膜，致使肺組織發(fā)生損傷。通過給予地塞米松和芥菜疙瘩粉體后能夠降低COPD小鼠體內(nèi)的NO和MDA，升高CAT、GSH-Px和SOD的水平，進(jìn)而平衡氧化應(yīng)激過程。

2.7 BUP對(duì)COPD小鼠抗氧化通路的影響

如圖6所示，LPS造模會(huì)導(dǎo)致COPD小鼠肺組織內(nèi)的HO-1 mRNA（6a）、NQO-1 mRNA（6b）表達(dá)下降，說明機(jī)體內(nèi)的解毒酶表達(dá)不足。Nrf2被認(rèn)為是一種調(diào)節(jié)抗氧化能力的轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2信號(hào)通路的激活是細(xì)胞防御氧化應(yīng)激的主要機(jī)制[27]。通過對(duì)小鼠飼喂芥菜疙瘩粉體，能夠增加Nrf2蛋白水平的表達(dá)（6c、6d），Nrf2被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核從而可能上調(diào)大量抗氧化酶（CAT、GSH-Px和SOD等）和異種生物解毒基因（HO-1 mRNA和NQO-1 mRNA等）的表達(dá)，進(jìn)而改善小鼠的COPD。

3 結(jié)論

本研究以芥菜疙瘩制備BUP，并與BOP對(duì)比，研究BUP活性成分浸出率的變化和其對(duì)COPD小鼠的改善作用及機(jī)制。相較于BOP，BUP具有更高的活性成分浸出率，且BUP能夠通過抗炎和抗氧化通路調(diào)節(jié)COPD小鼠的免疫細(xì)胞比例、細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激相關(guān)因子的釋放，改善COPD小鼠的肺氣腫和肺纖維化，從而改善COPD小鼠的肺炎，且其效果優(yōu)于BOP。綜上可知，BUP活性成分溶出率高且能夠改善 LPS誘導(dǎo)的COPD小鼠，該結(jié)果為芥菜疙瘩的精深加工利用和功能食品的開發(fā)研究提供了新的理論依據(jù)。