孫安琪，胡志燁，巨修練

（1.武漢工程大學(xué)郵電與信息工程學(xué)院 武漢 430072；2.武漢大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430071；3.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院 武漢 430072）

乳腺癌是女性最為多發(fā)的惡性腫瘤之一。目前臨床上各種化療藥物的應(yīng)用使腫瘤的治療效果有所改善。但是這些化療藥物仍然存在毒副作用大的問(wèn)題，并且使用一段時(shí)間后，腫瘤細(xì)胞也可能產(chǎn)生耐藥性。所以，在臨床上考慮聯(lián)合用藥是改善現(xiàn)狀的一個(gè)途徑。

由于聯(lián)合用藥針對(duì)不同的靶點(diǎn)，在降低單藥使用劑量的同時(shí)，還能產(chǎn)生協(xié)同作用，提高療效、降低不良反應(yīng)、避免腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，因此逐漸成為癌癥治療的首選方案[1]。將藥物聯(lián)合使用之后，最終可能產(chǎn)生協(xié)同作用，也可能作用相加或者拮抗。所以，需要采取科學(xué)、有效的方法來(lái)判定藥物之間相互作用的結(jié)果。目前，聯(lián)合指數(shù)法較為常用，它是Chou和Talalay以質(zhì)量守恒定律為基礎(chǔ)，提出的聯(lián)合指數(shù)判定法，也稱為CI法。本文也是采取的CI法來(lái)判斷藥物之間的協(xié)同效應(yīng)[2]。

喜樹(shù)堿類藥物主要作用于細(xì)胞S期，影響DNA功能，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但是在臨床上使用會(huì)產(chǎn)生較大的不良反應(yīng)，通過(guò)不斷的結(jié)構(gòu)改造，目前常用的藥物有伊立替康、拓?fù)涮婵档?，并且它們也常與吉西他濱、5-氟尿嘧啶、阿霉素以及順鉑等聯(lián)合應(yīng)用，取得了一定的治療效果[3-6]。同時(shí)，考慮將羥基喜樹(shù)堿與安全低毒的中藥有效成分聯(lián)合使用，考察聯(lián)合用藥的效果。

紫杉醇可以維持微管蛋白穩(wěn)定、抑制細(xì)胞有絲分裂，還能控制腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步的擴(kuò)散。在臨床上，化療完成后，常用紫杉醇進(jìn)一步進(jìn)行配合治療，可以提高患者的順應(yīng)性[7-8]。但是紫杉醇作為細(xì)胞毒性藥物，在使用過(guò)程中也可能影響正常細(xì)胞，導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。

紅景天苷是紅景天根莖中分離出來(lái)的主要活性成分，對(duì)乳腺癌治療具有一定作用。但是，目前能夠應(yīng)用到臨床治療腫瘤的紅景天苷未見(jiàn)報(bào)道，并且關(guān)于它聯(lián)合用藥的研究也不多見(jiàn)。由于紅景天苷毒副作用較小，是非常具有吸引力的化藥佐藥候選者[9]。因此本文探討單獨(dú)應(yīng)用紅景天苷及其聯(lián)合羥基喜樹(shù)堿或紫杉醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的抑制作用，利用聯(lián)合指數(shù)法判斷聯(lián)合用藥的效果，為后續(xù)研究提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

乳腺癌細(xì)胞MCF-7株購(gòu)自ATCC（American type culture collection，美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)）。

1.2 主要試劑與儀器

紅景天苷（99.9%，武漢信嘉和誠(chéng)藥物化學(xué)有限公司）；羥基喜樹(shù)堿（上海秦巴化工有限公司）；紫杉醇（99.5%，武漢貝爾凱生物科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（HyClone公司）；胎牛血清（AusGeneX）；MTT（BioSharp公司）；酶標(biāo)儀（biotec elx800）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；96孔板（耐思生物科技有限公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺癌細(xì)胞MCF-7待密度長(zhǎng)至80%-90%時(shí)，消化并吹散細(xì)胞后，使用含10% FBS（fatal bovine serun，胎牛血清）的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基鋪96孔板，每孔約8000-10000個(gè)細(xì)胞，前后左右推動(dòng)96孔板使細(xì)胞均勻分散，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.4 藥物分組

待細(xì)胞完全貼壁后，先使用含10% FBS的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基將紅景天苷組配制成以下濃度梯度：1000.00、800.00、600.00、500.00、400.00、300.00、200.00、100.00、50.00 μmol·L-1；羥基喜樹(shù)堿組配制成以下濃度梯度：250.00、100.00、50.00、25.00、12.50、5.00、2.50、0.50、0.25 μmol·L-1；紫杉醇組配制成以下濃度梯度：0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、6.00、8.00、10.00 μmol·L-1；然后吸出 96孔版中原培養(yǎng)基，分別加入上述化合物溶液以及兩者混合物，每個(gè)濃度梯度設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將細(xì)胞與藥液共孵育3天，取出96孔板，每孔在生物安全柜中避光加20 μL MTT溶液，輕輕搖晃混勻后，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h。取出96孔板，小心吸出液體（盡量避免吸出結(jié)晶物），然后每孔加入100 μL DMSO，放在微量振蕩器上震蕩15 min充分溶解結(jié)晶。放入酶標(biāo)儀，選取490 nm波長(zhǎng)掃讀96孔板，并保存數(shù)據(jù)。

1.6 結(jié)果判定

采用CHOU-TALALAY聯(lián)合指數(shù)法。已知：中效方程fa/fu=(D/Dm)m，其中fa為效應(yīng)，也就是抑制率，fu=l-fa，D為藥物濃度，Dm為中效濃度，m為斜率。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得fa和D值，計(jì)算單獨(dú)使用藥物時(shí)的Dm，以及藥物聯(lián)用時(shí)的Dm。由中效方程的公式，可推導(dǎo)出 D=Dm (fa/fu)1/m。再計(jì)算聯(lián)合指數(shù)CI=(D)l/(Dx)1+(D)2/(Dx)2+α(D)1(D)2/ (Dx)1(Dx)2，其中(D)1、(D)2為合用產(chǎn)生 X 效應(yīng)時(shí)，兩藥的濃度，(Dx)1、(Dx)2為單用產(chǎn)生X效應(yīng)時(shí)，兩藥的濃度，α=0為排斥性藥物，α=1為非排斥性藥物。若CI＜1兩藥為協(xié)同作用，數(shù)值越小，產(chǎn)生的協(xié)同作用越強(qiáng)；若CI=1為相加作用；若CI＞1為拮抗作用，數(shù)值越大，產(chǎn)生的拮抗作用越強(qiáng)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 紅景天苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，紅景天苷各濃度組的OD值與空白對(duì)照組差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05），并且細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨紅景天苷濃度的升高而增高，說(shuō)明紅景天苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長(zhǎng)的抑制作用存在劑量依賴性（表1，圖1）。同樣，分別使用羥基喜樹(shù)堿和紫杉醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長(zhǎng)也具有抑制作用，并呈濃度依賴性（表2，表3；圖2，圖3）。

2.2 聯(lián)合應(yīng)用紅景天苷及羥基喜樹(shù)堿對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制率的影響。

紅景天苷和羥基喜樹(shù)堿聯(lián)用對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的抑制率（表4，圖4）均高于單獨(dú)使用各藥物時(shí)的抑制率（表5，圖5）。并且紅景天苷與羥基喜樹(shù)堿的濃 度 為（200.00+2.50）、（300.00+5.00）、（400.00+12.50）、（500.00+25.00）、（600.00+50.00）、（800.00+100.00）、（1000.00+250.00）μmol·L-1時(shí)，CI值小于1，說(shuō)明在此濃度下，兩者聯(lián)用可以產(chǎn)生協(xié)同作用。

表1 紅景天苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制率的影響（n=6）

圖1 紅景天苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制率的影響

表2 羥基喜樹(shù)堿對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制率的影響（n=6）

2.3 聯(lián)合應(yīng)用紅景天苷及紫杉醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制率的影響。

紅景天苷和紫杉醇聯(lián)用對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的抑制率（表6，圖6）均高于單獨(dú)使用各藥物時(shí)的抑制率（表7，圖7）。并且紅景天苷與紫杉醇的濃度為（100.00+0.05） 、（200.00+0.10） 、（300.00+0.50） 、（400.00+1.00） 、（500.00+2.00） 、（600.00+6.00） 、（800.00+8.00）、（1000.00+10.00）μmol·L-1時(shí)，CI值小于1，說(shuō)明在此濃度下，兩者聯(lián)用可以產(chǎn)生協(xié)同作用。

表3 紫杉醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制率的影響（n=6）

圖2 羥基喜樹(shù)堿對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制率的影響

圖3 紫杉醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制率的影響

表4 聯(lián)合應(yīng)用紅景天苷及羥基喜樹(shù)堿對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制率的影響（n=6）

圖4 聯(lián)合使用紅景天苷與羥基喜樹(shù)堿對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制率的影響

3 討論

紅景天作為一種富含多糖類物質(zhì)和免疫活性物質(zhì)的傳統(tǒng)中藥，已被廣泛用于預(yù)防高原病、抗衰老、抗抑郁以及消除疲勞等方面。已證實(shí)紅景天的有效成分紅景天苷可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[10-11]。

圖5 單獨(dú)使用紅景天苷、羥基喜樹(shù)堿以及聯(lián)合使用兩藥對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，紅景天苷對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖具有抑制作用，并且當(dāng)紅景天苷濃度增加，其對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制率也相應(yīng)升高。細(xì)胞形態(tài)在細(xì)胞周期中發(fā)生一系列變化，其中G1至S期以及G2至M期是兩個(gè)重要的階段。在此期間，發(fā)生了活躍且復(fù)雜的分子水平的相關(guān)變化，并且易受外界的影響，這也是學(xué)者們十分關(guān)注的階段。一般情況下，p27（Kip1）和p21（Cip1）上調(diào)，周期蛋白依賴激酶4（Cyclin-dependent kinase, CDK4）和特異性周期蛋白-D1（Cyclin D1）下調(diào)，細(xì)胞正常生長(zhǎng)[12]。當(dāng)受到調(diào)控或者一些外界不利因素介入，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯在此階段，從而抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)。推測(cè)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴于細(xì)胞周期的正常進(jìn)行，一旦通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，阻滯了細(xì)胞周期，則可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。

腫瘤的生長(zhǎng)取決于細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的比例，其中細(xì)胞凋亡的過(guò)程受到凋亡基因的調(diào)控，有研究也指出乳腺癌的發(fā)生發(fā)展與凋亡失調(diào)有關(guān)[13]。也就是說(shuō)，相關(guān)凋亡基因在被激活、表達(dá)或者調(diào)節(jié)過(guò)程中，出現(xiàn)了異常。較為常見(jiàn)的凋亡基因有凋亡抑制基因p53和B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2），以及促凋亡基因Bax（Bcl-2相關(guān)X蛋白，Bcl-2-Associated X）等。紅景天苷可能通過(guò)調(diào)節(jié)以上基因的表達(dá)，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，從而抑制其生長(zhǎng)。

表6 聯(lián)合應(yīng)用紅景天苷及紫杉醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制率的影響（n=6）

圖6 聯(lián)合使用紅景天苷與紫杉醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7抑制率的影響

圖7 各濃度紅景天苷、紫杉醇及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖抑制率的影響

同時(shí)還推測(cè)紅景天苷的乳腺癌細(xì)胞抑制作用還與誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞分化有關(guān)。誘導(dǎo)細(xì)胞分化的過(guò)程，沒(méi)有對(duì)細(xì)胞造成損傷，而是通過(guò)調(diào)控，使細(xì)胞的發(fā)展趨于正?；痆14]。其中，c-myc基因可促進(jìn)細(xì)胞分裂，啟動(dòng)細(xì)胞分化，在乳腺癌細(xì)胞的增殖過(guò)程中起到了較大的作用。當(dāng)上調(diào)c-myc基因水平，細(xì)胞增殖；相反的，若下調(diào)c-myc基因水平，則抑制了細(xì)胞的增殖。推測(cè)紅景天苷也可能抑制了c-myc的表達(dá)，使乳腺癌細(xì)胞增殖作用受到控制，繼而起到抗乳腺癌的效應(yīng)。

自噬是在外界條件發(fā)生變化時(shí)，細(xì)胞可能會(huì)吞噬自己的細(xì)胞器或者細(xì)胞質(zhì)蛋白，然后進(jìn)入囊泡，與溶酶體結(jié)合，生成自噬溶酶體，再在蛋白水解酶的作用下降解，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的代謝和更新[15]。自噬在病理狀態(tài)下也很常見(jiàn)，尤其在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中有不可忽視的作用。這其中有許多相關(guān)基因參與了調(diào)控，比如LC3是自噬標(biāo)志物，主要參與自噬小體的形成[16]。LC3前體分子首先裂解形成胞質(zhì)形式的LC3-I，被激活后，形成膜結(jié)合形式的LC3-II，附著在溶酶體膜上，最后被降解[17]。推測(cè)紅景天苷可以通過(guò)促進(jìn)LC3的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，抑制乳腺癌的發(fā)展。

紅景天苷也能通過(guò)調(diào)控多途徑的信號(hào)通路，起到抗乳腺癌的作用[18-19]。推測(cè)紅景天苷抑制了基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metallopeptidase，MMP）-2、MMP-9、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2（Vascular epidemal growth factor receptor-2，VEGFR-2）等蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR、EGFR/JAK2/STAT3信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，或者抑制細(xì)胞遷移和血管生成。

表7 單獨(dú)使用紅景天苷、紫杉醇以及聯(lián)合用藥細(xì)胞增殖抑制率（%）

目前臨床上多數(shù)化療藥物具有較大的副作用，并且腫瘤細(xì)胞也易產(chǎn)生多藥耐藥性?；诩t景天苷具有一定的抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用，故考慮將其與陽(yáng)性藥物聯(lián)合使用，并評(píng)價(jià)其效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合應(yīng)用高、中劑量的紅景天苷與羥基喜樹(shù)堿或紫杉醇在抗乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖方面存在協(xié)同作用。關(guān)于聯(lián)合給藥，協(xié)同抗腫瘤的機(jī)制也可能與影響凋亡信號(hào)通路、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性、抑制細(xì)胞增殖和侵襲等方面有關(guān)。

羥基喜樹(shù)堿可以通過(guò)抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I，對(duì)DNA的合成起到抑制作用，最終導(dǎo)致DNA單鏈或者雙鏈的斷裂，繼而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[20]。但該藥易產(chǎn)生骨髓抑制等不良反應(yīng)，所以考慮聯(lián)合用藥，提高療效的同時(shí)，減少不良反應(yīng)，還可降低細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生[21]。而紅景天苷能夠抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性[22]，與典型的拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑羥基喜樹(shù)堿聯(lián)合使用，具有良好的協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自動(dòng)死亡的重要形式，凋亡刺激信號(hào)可以激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Cysteinyl aspartate specific proteinas，caspase）相關(guān)途徑。推測(cè)紅景天苷與紫杉醇聯(lián)用之后，紅景天苷能夠增強(qiáng)紫杉醇的激活作用。該激活作用通過(guò)線粒體細(xì)胞C釋放到細(xì)胞質(zhì)，與凋亡蛋白酶激活因子1結(jié)合形成多聚體，再與caspase-9結(jié)合形成凋亡小體，并且激活下游凋亡分子caspase-3，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[23]。p53是Bax的轉(zhuǎn)錄激活劑，也是Bcl-2的轉(zhuǎn)錄抑制劑，通過(guò)調(diào)控Bax/Bcl-2的比例，可以誘導(dǎo)激活caspase-9，進(jìn)一步作用于caspase-3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[24]。在阻滯腫瘤細(xì)胞周期方面，紫杉醇是將細(xì)胞阻滯在了S期[25]，紅景天苷可能通過(guò)下調(diào)Cdc2及Cyclin B1的表達(dá)，將細(xì)胞阻滯在G2期，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[26]。由于該時(shí)期是DNA合成前的關(guān)鍵時(shí)期，因此減少DNA的合成，協(xié)同抑制細(xì)胞增殖的不同階段，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡。我們推測(cè)，紅景天苷與紫杉醇作用于細(xì)胞周期的不同時(shí)期可能是兩種藥物聯(lián)用促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制，另外紅景天苷抑制相關(guān)信號(hào)通路的激活，也能降低紫杉醇藥物抗性的作用，其具體的抗癌機(jī)制以及體內(nèi)的效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。

臨床上，傳統(tǒng)經(jīng)典的抗腫瘤藥物會(huì)隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)而療效減弱。此時(shí)，若單純地增加給藥劑量，會(huì)增加藥物的毒副作用，導(dǎo)致患者的順應(yīng)性降低。目前，抗腫瘤的研究趨向于采用聯(lián)合用藥的設(shè)計(jì)思路，通過(guò)不同靶點(diǎn)的作用，起到輔助和協(xié)同的作用，減少不良反應(yīng)的同時(shí)，達(dá)到更好的治療效果[27-28]。因此，在抗腫瘤治療時(shí)，將紅景天苷與羥基喜樹(shù)堿或紫杉醇合理配伍聯(lián)合使用，也為臨床治療提供了新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

然而，紅景天苷與抗乳腺癌藥物協(xié)同作用的機(jī)制有待進(jìn)一步明確，也可以將體外的協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)延伸至體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，從而由單一成分向聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行縱深研究。