劉 雙 ，耿 煒 ，張紅艷 ，王 凱 ，王 曉 ，董紅敬 ＊＊

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省分析測(cè)試中心 濟(jì)南 250014；2.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）藥學(xué)院 濟(jì)南 250300；3.山東省婦幼保健院 濟(jì)南 250014；4.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 濟(jì)南 250014）

金銀花（Lonicera Japonica Thunb.）又名忍冬花，是忍冬科忍冬屬植物忍冬的干燥花蕾或帶初開的花[1]。金銀花具有悠久的藥用歷史，“金銀花”一名出自《本草綱目》，由于忍冬花初開為白色，后轉(zhuǎn)為黃色，故得名金銀花[2]，金銀花具有清熱解毒、疏風(fēng)散熱的功效，是一味臨床常用中藥。傳統(tǒng)中藥復(fù)方是我國(guó)的文化瑰寶，復(fù)方是多種中藥以配伍形式組成，中藥的配伍原則是古人的智慧結(jié)晶，而藥對(duì)是中藥配伍的基本形式，藥對(duì)是連接中藥與方劑的樞紐[3]。藥對(duì)雖組成簡(jiǎn)單，但具有協(xié)同增效或配伍減毒等作用，且體現(xiàn)了歷代醫(yī)學(xué)家臨床用藥的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)[4]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來(lái)的新興學(xué)科，是闡明藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病之間的內(nèi)在聯(lián)系、揭示藥物的作用途徑的一門前沿學(xué)科[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)研究理論、高通量篩選和網(wǎng)絡(luò)分析及可視化技術(shù)等，系統(tǒng)地、整體地分析中藥復(fù)方[6-8]，有利于從分子機(jī)制層面闡明成分在預(yù)防或治療疾病方面發(fā)揮作用的途徑，揭示中藥多成分-多靶點(diǎn)-多途徑的效用特點(diǎn)[9]，綜合地反應(yīng)藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)機(jī)制，這與中藥整體性、系統(tǒng)性治療疾病的特點(diǎn)不謀而合，已成為分析中藥作用機(jī)制的有力工具[10-11]。如采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究黑逍遙散治療阿爾茨海默病的作用機(jī)制[12]，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘巴西人參的核心功效[13]。因此，采用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)挖掘金銀花的核心藥對(duì)并借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)核心藥對(duì)的現(xiàn)代藥理活性，可為金銀花藥對(duì)的發(fā)現(xiàn)及深入研究提供理論基礎(chǔ)。

圖1 研究思路流程圖

本文以《中華醫(yī)典》中含金銀花的處方為基礎(chǔ)，借助數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析含金銀花組方的用藥規(guī)律并分析核心藥物組合的現(xiàn)代藥理活性，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其現(xiàn)代藥理活性（見圖1），以期為傳統(tǒng)復(fù)方的研究與開發(fā)以及“老藥新用”提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源、數(shù)據(jù)篩選及處理

通過《中華醫(yī)典》數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.tcmbook.cn），以“金銀花”為關(guān)鍵詞，檢索含有“金銀花”的中藥復(fù)方，檢索時(shí)間為建庫(kù)至2021年10月25日。

給藥方式為口服的中藥復(fù)方被納入分析范圍。根據(jù)《中國(guó)藥典》2020版以及《中華本草》來(lái)規(guī)范各處方的中藥名稱。如：生地規(guī)范為地黃、熟地規(guī)范為熟地黃、生芪規(guī)范為黃芪等。

1.2 用藥規(guī)律分析

將篩選并規(guī)范好的中藥復(fù)方錄入Excel表格中，由雙人負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)審核，以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。借助數(shù)據(jù)透視表對(duì)中藥的使用頻次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。將數(shù)據(jù)整理成Y和N的格式，即復(fù)方中含有這味藥標(biāo)記為Y，不含有這味藥物標(biāo)記為N，最后添加一組全為N的復(fù)方。借助SPSS Modeler 18.0軟件進(jìn)行復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析，通過源節(jié)點(diǎn)導(dǎo)入Excel格式數(shù)據(jù)，選擇字段面板中的類型節(jié)點(diǎn)，將數(shù)據(jù)類型設(shè)置為標(biāo)記，角色設(shè)置為任意，連接數(shù)據(jù)節(jié)點(diǎn)與數(shù)據(jù)類型節(jié)點(diǎn)。選擇圖形面板中的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)并插入，連接類型節(jié)點(diǎn)與網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)，分析條件設(shè)置為僅顯示true值標(biāo)志，可顯示的最大鏈接數(shù)為55，“強(qiáng)鏈接下限”為30，“弱鏈接上限”為10，按照鏈接大小顯示強(qiáng)/正常/弱類別以顯示關(guān)聯(lián)應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)圖，其中，連線的粗細(xì)表示兩種藥物在同一復(fù)方中出現(xiàn)的頻率。通過SPSS Statistics 26.0軟件進(jìn)行聚類分析，并借助Cytoscape軟件[14]實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.3 現(xiàn)代藥理活性挖掘

1.3.1 藥物作用靶點(diǎn)的獲取及其與疾病的相互作用關(guān)系

綜合分析頻次統(tǒng)計(jì)、復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)、關(guān)聯(lián)規(guī)則分析結(jié)果，篩選出核心藥物組合。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)[15]（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和TCMIP數(shù)據(jù)庫(kù)[16]（http://www.tcmip.cn/）獲取核心藥物的化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)，并進(jìn)行去重和規(guī)范，采用String數(shù)據(jù)庫(kù)[17]（https://cn.string-db.org/）查詢靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的基因名稱。

CTD數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ctdbase.org/）是一個(gè)強(qiáng)大的、公開的研究資源，是用于描述化學(xué)物質(zhì)、基因和人類疾病之間關(guān)系的科學(xué)依據(jù)，CTD數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了許多描述跨物種化學(xué)基因/蛋白質(zhì)相互作用和化學(xué)-疾病關(guān)系以及基因-疾病關(guān)系的精確數(shù)據(jù)[18]。借助CTD數(shù)據(jù)庫(kù)，分析所有靶點(diǎn)相關(guān)的潛在疾病；通過Excel中的數(shù)據(jù)透視表統(tǒng)計(jì)靶點(diǎn)的出現(xiàn)頻次，得到出現(xiàn)頻次較高的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，利用Excel使關(guān)鍵靶點(diǎn)與疾病相互映射，利用Cytoscape軟件構(gòu)建“中藥-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)并分析拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)，分析藥-靶-病之間的內(nèi)在關(guān)系。

1.3.2 生物功能富集分析

采用String數(shù)據(jù)庫(kù)分析關(guān)鍵靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），進(jìn)一步篩選核心靶點(diǎn)，基于DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)[19]（https://david.ncifcrf.gov/）對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析及KEGG通路富集分析。

2 核心藥物組合的體外驗(yàn)證

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤中發(fā)病率位居第三，死亡率位居第二。HCT116細(xì)胞是1979年從一位患結(jié)直腸癌的男性病人中分離得到的，HCT116細(xì)胞已成為結(jié)直腸癌研究領(lǐng)域中被廣泛使用的模式細(xì)胞。綜合分析數(shù)據(jù)挖掘的結(jié)果，選擇HCT116細(xì)胞可作為研究對(duì)象進(jìn)行體外驗(yàn)證。

2.1 細(xì)胞、試劑與儀器

人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116）；金銀花、甘草均夠自漱玉平民大藥房千佛山東路店，金銀花提取物、甘草提取物、金銀花-甘草提取物為課題組自制（取50 g金銀花，精密稱定，置1000 mL圓底燒瓶中，精密加入400 mL蒸餾水，放入電熱套中進(jìn)行水浴加熱，提取1 h，濾過，濃縮，凍干，得金銀花提取物；取50 g甘草，精密稱定，置1000 mL圓底燒瓶中，精密加入400 mL蒸餾水，放入電熱套中進(jìn)行水浴加熱，提取1 h，濾過，濃縮，凍干，得甘草提取物；取30 g金銀花和15 g甘草，精密稱定，置1000 mL圓底燒瓶中，精密加入400 mL蒸餾水，放入電熱套中進(jìn)行水浴加熱，提取1 h，濾過，濃縮，凍干，得金銀花-甘草提取物）；RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司，批號(hào)：8121354）；PBS緩沖液（Solarbio公司，批號(hào)：20210526）；胰蛋白酶（Solarbio公司，批號(hào)：20210105）；胎牛血清（杭州四季青公司，批號(hào)：20050504）；HF90氣套式二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力康公司）；Spark多功能微孔板檢測(cè)儀（瑞士TECAN公司）。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

從-80℃的冰箱中取出凍存的HCT116細(xì)胞（購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所），置于37℃水浴鍋中迅速解凍，將解凍后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，加入適量RPMI-1640培養(yǎng)基混勻后進(jìn)行離心（1500 r·min-1，5 min），棄上清液。向離心管中加入6 mL 10% FBS 1640培養(yǎng)基，吹打均勻后加到新培養(yǎng)瓶中，搖勻后置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%以上后，棄上清液，加2 mL PBS進(jìn)行清洗，加1 mL胰蛋白酶在培養(yǎng)箱中消化2 min。加入適量10% FBS 1640培養(yǎng)基吹打細(xì)胞使其從瓶底脫離，離心（1500 r·min-1，5 min）后棄上清液，加10% FBS 1640培養(yǎng)基6 mL，吹打均勻后放入新培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3 MTT法檢測(cè)抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化并反復(fù)吹打后制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104·mL-1，以每孔100 μL接種于96孔板中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別加入5% FBS 1640培養(yǎng)基配制的金銀花組（5 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1）、甘草組（25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1）、金銀花-甘草組（25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1）并設(shè)置空白組（只含培養(yǎng)基）和陰性對(duì)照組（藥物濃度為0），每組各接種5孔，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h、72 h。向每個(gè)孔中加入 50 μL MTT溶液（1.0 mg·mL-1）；繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出上清液；加入100 μL DMSO，后用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔OD值。增殖抑制率按照以下公式計(jì)算。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及用藥頻次分析

共統(tǒng)計(jì)金銀花組方108首，涉及189味中藥。通過分析發(fā)現(xiàn)，使用頻率在10以上的藥物有35味（表1），累計(jì)頻次825次，占總頻次的71.06%，屬于高頻中藥。其中，使用頻次前10位的分別是金銀花、甘草、當(dāng)歸、連翹、赤芍、防風(fēng)、黃芩、天花粉、皂角刺、牛蒡子。

3.2 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

如圖2所示，在復(fù)方中共有26味藥與金銀花配伍使用，其中，金銀花、甘草、當(dāng)歸、連翹的相關(guān)性較強(qiáng)，在金銀花組方中經(jīng)常一起使用。Apriori算法是用于挖掘數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)規(guī)則的常用算法，該算法可對(duì)事務(wù)性數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行挖掘，得到相互關(guān)聯(lián)的屬性，是多個(gè)數(shù)據(jù)挖掘算法的基礎(chǔ)算法[20]。在關(guān)聯(lián)規(guī)則中，支持度表示前項(xiàng)和后項(xiàng)同時(shí)在數(shù)據(jù)庫(kù)中出現(xiàn)的比率，置信度表示前項(xiàng)出現(xiàn)的條件下，后項(xiàng)出現(xiàn)的概率。在建模選項(xiàng)板下，選擇關(guān)聯(lián)中的Apriori算法，將Apriori節(jié)點(diǎn)與類型節(jié)點(diǎn)相連接，使用預(yù)定義角色，選擇最低條件支持度10%，最小規(guī)則置信度80%，最大前項(xiàng)數(shù)為5，對(duì)藥物進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析。根據(jù)Apriori 算法，一共產(chǎn)生202條規(guī)則，主要的關(guān)聯(lián)規(guī)則見表2、表3、表4。其中金銀花-甘草聯(lián)合使用頻率最高，支持度為65.14%。

3.3 現(xiàn)代藥理活性挖掘

通過以上研究，發(fā)現(xiàn)金銀花-甘草聯(lián)合使用頻率最高，因此進(jìn)一步以金銀花-甘草組合為例，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)“金銀花-甘草”藥對(duì)的藥理活性進(jìn)行了深層次挖掘。

表1 高頻藥物使用統(tǒng)計(jì)表（頻次 ≥ 10）

3.3.1 藥物作用靶點(diǎn)的獲取及其與疾病的相互作用關(guān)系

基于TCMSP、TCMIP數(shù)據(jù)庫(kù)，建立金銀花、甘草的藥物靶點(diǎn)庫(kù)；采用CTD數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取與藥物靶點(diǎn)相關(guān)的疾病，共有681個(gè)疾病，選取度值最高的前10個(gè)疾病及其相關(guān)靶點(diǎn)，借助Excel中的數(shù)據(jù)透視表插件，以獲得在較多疾病中出現(xiàn)頻次較高的靶點(diǎn)，稱為關(guān)鍵靶點(diǎn)，共53個(gè)（表5）。

圖2 金銀花組方的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)

表2 常用2味藥物組合關(guān)聯(lián)規(guī)則

表3 常用3味藥物組合關(guān)聯(lián)規(guī)則

表4 常用4味藥物組合關(guān)聯(lián)規(guī)則

分別將金銀花與甘草的作用靶點(diǎn)與疾病相互映射，整理、規(guī)范，借助Cytoscape軟件建立“中藥-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)（圖3），網(wǎng)絡(luò)共包含65個(gè)節(jié)點(diǎn)，632條網(wǎng)線。

3.3.2 生物功能富集分析

基于String數(shù)據(jù)庫(kù)建立關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，置信度設(shè)置為0.4，借助Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化（圖4），分析PPI網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點(diǎn)的大小和顏色深淺表示Degree值的高低，其中，AKT1、IL6、ALB為Degree值前3的靶點(diǎn)蛋白（Degree ≥ 49，ClosenessCentrality ≥ 0.94，BetweennessCentrality ≥ 0.027）。

表5 關(guān)鍵靶點(diǎn)

圖3 中藥-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

通過DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO富集分析和KEGG通路富集分析（圖5、圖6）。GO富集分析包括生物過程（Biological process）、細(xì)胞組分（Cellular component）、和分子功能（Molecular function）3個(gè)部分。其中，關(guān)鍵靶點(diǎn)富集的生物過程條目包括RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控（Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter）、凋亡過程的負(fù)調(diào)控（Negative regulation of apoptotic process）、細(xì)胞增殖的正調(diào)控（Positive regulation of cell proliferation）等；細(xì)胞組分條目包括細(xì)胞核（Nucleus）、細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）、胞質(zhì)溶膠（Cytosol）等；分子功能條目包括蛋白質(zhì)結(jié)合（Protein binding）、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（Transcription factor binding）、蛋白激酶結(jié)合（Protein kinase binding）等。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集于HIF-1信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、PI3K-Akt 信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway）等。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 GO富集分析

圖6 KEGG通路富集分析

圖7 藥物組抑制率

4 核心藥物組合對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組（抑制率為0）比較，金銀花組、甘草組和金銀花-甘草組，處理細(xì)胞48 h后，能對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，且金銀花組較甘草組以及金銀花-甘草組的抑制作用更強(qiáng)，隨著濃度的升高，抑制作用加強(qiáng)（圖7A）；處理細(xì)胞72 h后，金銀花組和甘草組的抑制率較48 h處理后的金銀花組和甘草組有所降低。72 h處理后的金銀花-甘草組的抑制率較48 h處理后的金銀花-甘草組的抑制率高（圖7B），說明不同劑量的金銀花-甘草藥對(duì)處理HCT116細(xì)胞72 h，對(duì)HCT116細(xì)胞增殖有較好的抑制作用。金銀花-甘草組對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性，隨著時(shí)間與金銀花-甘草藥對(duì)濃度的上升，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，且濃度越高、時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用越強(qiáng)。

5 討論

分析傳統(tǒng)復(fù)方的用藥規(guī)律有利于總結(jié)和繼承名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)?！吨腥A醫(yī)典》是全面系統(tǒng)整理中醫(yī)古籍而制成的一本中國(guó)歷代醫(yī)學(xué)古籍。在《中華醫(yī)典》收錄的含金銀花復(fù)方中，金銀花為君藥或臣藥以發(fā)揮清熱解毒功效，如銀花解毒湯、清熱解毒湯中金銀花作為君藥，苦參湯、闌尾化瘀湯中金銀花作為臣藥。當(dāng)前，金銀花藥對(duì)的挖掘研究較少，而藥對(duì)是復(fù)方的最基本形式；用藥頻次分析結(jié)果顯示，甘草在金銀花組方中出現(xiàn)的頻次較高，故兩者有望成為新藥對(duì)。甘草號(hào)稱中草藥之王，善解百藥之毒。近年來(lái)，與甘草組成藥對(duì)的研究較多，比如芍藥-甘草藥對(duì)[21]、麻黃-甘草藥對(duì)[22]、大黃-甘草藥對(duì)[23]、苦參-甘草藥對(duì)[24]、桔梗-甘草藥對(duì)[25]等。甘草固有調(diào)和諸藥之功效，但其亦有補(bǔ)氣益中、緩急止痛、清熱解毒等功效，甘草的功效有且不限于調(diào)和諸藥。金銀花與甘草合用，一方面可以降低金銀花的毒副作用；另一方面，金銀花和甘草二藥的藥力溫和，對(duì)熱度較勝者，僅使用金銀花或甘草，不能達(dá)到理想的效果，兩者合用，不僅可以增強(qiáng)金銀花清熱解毒的功效，還可發(fā)揮甘草的甘緩護(hù)胃的功效，緩和金銀花甘寒對(duì)脾胃的影響。

關(guān)聯(lián)規(guī)則顯示，金銀花-甘草、金銀花-甘草-當(dāng)歸、金銀花-甘草-當(dāng)歸-防風(fēng)分別是3類組合組中支持度最高的組合。含有金銀花和甘草的組方多為清熱解毒方，如疏風(fēng)清熱湯、驅(qū)風(fēng)散、消毒散等。臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，金銀花和甘草聯(lián)用在治療前列腺炎方面具有較好療效，甘草中的甘草甜素和甘草次酸具有抗炎抑菌作用，黃酮類成分對(duì)平滑肌有解痙攣?zhàn)饔?，利于消炎排尿；金銀花中的有機(jī)酸、黃酮類成分等具有抗菌、抗炎作用，兩者聯(lián)用，對(duì)前列腺炎療效顯著，可迅速緩解患者病痛，利于恢復(fù)[26]。金銀花、甘草、當(dāng)歸聯(lián)用，金銀花清熱解毒，疏風(fēng)散熱，當(dāng)歸補(bǔ)血活血，潤(rùn)腸通便，而甘草可以清熱解毒，調(diào)和藥性，三者可以清熱解毒，補(bǔ)血活血；在三味藥的基礎(chǔ)上，再添防風(fēng)以祛風(fēng)解表，勝濕止痛。

現(xiàn)代藥理活性研究發(fā)現(xiàn)，金銀花、甘草的藥物靶點(diǎn)與腫瘤（Neoplasms）、消化系統(tǒng)疾?。―igestive System Diseases）、心 血 管 疾 病（Cardiovascular Diseases）等有關(guān)，展現(xiàn)了中藥廣泛的藥理活性，體現(xiàn)了中藥多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。目前，金銀花或甘草單獨(dú)使用的藥效研究較多，比如研究人員從凍干的金銀花中提取分離出多酚類成分，發(fā)現(xiàn)多酚類成分對(duì)人組織淋巴瘤細(xì)胞具有抑制作用[27]；甘草中的查爾酮A可以通過增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平，降低MMP引起線粒體功能障礙和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡[28]。金銀花，性甘、寒，歸肺、胃經(jīng)，既能散風(fēng)熱，又能清胃熱而解毒。甘草在治療常見急、慢性消化道疾病如消化性潰瘍、慢性膽囊炎、膽石癥等方面具有顯著療效[29]。金銀花可以有效地清理血液中的脂肪及有害物質(zhì)，增加血管血流量，有效預(yù)防心肌梗塞等心血管疾??；田行瀚等[30]發(fā)現(xiàn)甘草中的甘草查爾酮B、甘草查爾酮C、甘草查爾酮D和刺甘草查爾酮聯(lián)合使用對(duì)心血管疾病的治療效果顯著。

“中藥-關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)顯示，金銀花和甘草組合使用對(duì)腫瘤、消化系統(tǒng)疾病、心血管疾病等具有治療作用，兩味藥物的作用靶點(diǎn)有所差異，ABCC2、ALB、IGF1R為金銀花的特有作用靶點(diǎn)，SIRT1為甘草的特有作用靶點(diǎn)，甘草中的甘草酸可以作用于SIRT1，進(jìn)而抑制HMGB1的表達(dá)，對(duì)SAH后神經(jīng)功能損傷具有改善作用，能明顯抑制腦部水腫，神經(jīng)細(xì)胞凋亡[31]。在KEGG通路富集分析結(jié)果中，通過調(diào)節(jié)HIF-1α信號(hào)通路，可以改善H/R誘導(dǎo)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[32]；通過干預(yù)PI3K/AKT信號(hào)通路，可減輕心肌凋亡程度，表現(xiàn)出對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[33]。此外，PI3K/Akt信號(hào)通路過度表達(dá)和活化與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，上游分子通過與PI3K結(jié)合，使其構(gòu)象發(fā)生改變，從而磷酸化激活A(yù)kt，Akt的活化能調(diào)控其下游分子，參與腫瘤調(diào)控通路[34]，一旦PI3K/Akt信號(hào)通路被抑制，細(xì)胞增殖的能力便會(huì)下降，細(xì)胞凋亡增加[35]。TNF信號(hào)通路與受體相互作用蛋白、TNF受體相關(guān)因子2、TNF相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白以及Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白等相關(guān)，在促進(jìn)細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[36]。

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于單獨(dú)使用金銀花或甘草，核心藥物組合金銀花和甘草對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用更強(qiáng)，抑制活性的提高可能是兩種中藥金銀花和甘草中的化學(xué)成分生成了新的化學(xué)成分，這體現(xiàn)了中藥配伍的必要性及科學(xué)性，也證實(shí)了中藥復(fù)方絕不是簡(jiǎn)單的機(jī)械相加或組合，而是相輔相成又各司其職；此外，隨著濃度的上升，金銀花-甘草組的抑制活性逐漸增強(qiáng)，呈劑量依賴性；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，金銀花-甘草組的抑制率逐漸提高，表明該藥對(duì)的治療效果顯著且藥效持久。

綜上所述，本研究采用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)對(duì)《中華醫(yī)典》中含金銀花的組方用藥規(guī)律進(jìn)行了分析和探討，發(fā)現(xiàn)金銀花組方中甘草、當(dāng)歸、連翹、赤芍、防風(fēng)等與金銀花同時(shí)使用的頻次較高，明確了含金銀花組方的相關(guān)藥物配伍規(guī)律，挖掘出使用頻次較高的金銀花-甘草藥對(duì)。運(yùn)用數(shù)據(jù)挖掘及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討了金銀花-甘草藥對(duì)的現(xiàn)代藥理活性及潛在作用機(jī)制，通過人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)出的現(xiàn)代藥理作用進(jìn)行成功驗(yàn)證，證實(shí)金銀花-甘草藥對(duì)較單藥使用的效果好且療效持久，體現(xiàn)了中藥配伍的科學(xué)性、可行性和必要性，也為中藥藥對(duì)的挖掘與應(yīng)用、傳統(tǒng)藥對(duì)新用途的發(fā)現(xiàn)提供了新思路。