周綿莉，喻小蘭，施后淵，劉 婭，王 莉

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 瀘州 646000）

早發(fā)性卵巢功能不全（Primary ovarian insufficiency，POI）是一種與不規(guī)則排卵到過(guò)早絕經(jīng)相關(guān)的疾病，表現(xiàn)為閉經(jīng)或少經(jīng)并伴有促性腺激素升高和雌二醇（E2）水平下降[1]。POI可導(dǎo)致不孕，并與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、心血管病、甚至多種惡性腫瘤有關(guān)，嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量[2]。目前，通常建議患有POI的女性接受長(zhǎng)期的激素替代療法（Hormone replacement therapy，HRT），該療法可補(bǔ)償雌激素缺乏并有助于緩解更年期相關(guān)癥狀[3]。然而，HRT引起的規(guī)律月經(jīng)不能滿(mǎn)足患者最迫切的需求，即恢復(fù)卵巢功能自主排卵[4]。事實(shí)上，一半以上POI患者在確診時(shí)，卵巢中還殘留著原始卵泡，這些卵泡可以間歇性地發(fā)揮作用，但對(duì)于POI患者目前還沒(méi)有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的治療方法可以恢復(fù)卵巢功能[5]。

POI屬于中醫(yī)學(xué)“月經(jīng)后期”、“閉經(jīng)”、“不孕”等范疇，目前尚不能被完全根治。研究顯示，中醫(yī)藥辨證治療能有效消除臨床癥狀，改善卵巢儲(chǔ)備功能，正成為POI極具潛力的治療方案，傳統(tǒng)的湯藥、現(xiàn)代的中成藥，治療POI均有明確的效果[6]。二仙湯是20世紀(jì)50年代由張伯納教授經(jīng)過(guò)反復(fù)篩選驗(yàn)證而研制出的中藥名方，由仙茅、仙靈脾、當(dāng)歸、巴戟天、知母、黃柏、地骨皮及女貞子組成[7]。研究表明，二仙湯可能通過(guò)Rab-3、Rab-14等靶點(diǎn)改善卵巢大鼠的認(rèn)知功能[8]。冒湘琳等[9]報(bào)道了二仙湯可改善卵巢儲(chǔ)備功能，促進(jìn)卵泡正常募集和成熟。由于中藥成分的復(fù)雜性和作用多靶點(diǎn)性，關(guān)于二仙湯治療POI的機(jī)制研究還很缺乏，尤其關(guān)于其對(duì)POI卵巢功能改善作用的研究更少。

5’-一磷酸腺苷激活的蛋白激酶（Adenosine 5’-phosphate-activated protein kinase，AMPK）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一種營(yíng)養(yǎng)和能量感受器，調(diào)節(jié)糖脂代謝。正常生理?xiàng)l件下AMPK通過(guò)維持腺苷核苷酸[腺苷5’-三磷酸（ATP）、腺苷5’-二磷酸（ADP）和AMP]的動(dòng)態(tài)來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受各種代謝應(yīng)激的傷害[10]。研究表明，AMPK與包括乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和胰腺癌在內(nèi)的多種疾病相關(guān)[11-12]。然而，AMPK信號(hào)在二仙湯治療POI的作用尚未完全闡明。

因此，本研究擬探討二仙湯治療POI的有效性及對(duì)AMPK/mTOR信號(hào)通路的影響，以期為二仙湯的應(yīng)用治療POI提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BABL/c雌性（SPF級(jí)）小鼠48只，7-8周齡，體質(zhì)量18-22 g，購(gòu)自成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2020-030，使用許可證號(hào)：SYXK（川）2019-189，自由攝食飲水，飼養(yǎng)于恒溫（22-25）℃，相對(duì)濕度60%±10%條件下。研究方案經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20220217-012），并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑及儀器

4-乙烯基環(huán)己烯雙環(huán)氧化物（VCD，貨號(hào)：94956）購(gòu)自Sigma；二仙湯（組方為仙茅、仙靈脾、當(dāng)歸、巴戟天、知母、黃柏、地骨皮、女貞子）購(gòu)自北京同仁堂科技股份有限公司；戊酸雌二醇片（批號(hào)：219A2）購(gòu)自德國(guó)拜耳藥業(yè)；血清促卵泡生成素（FSH，貨號(hào)：ZC-38059）、雌二醇（E2，貨號(hào)：ZC-38046）、促黃體生成素（LH，貨號(hào)：ZC-38253）、活性氧（ROS，貨號(hào)：ZC-53543）、丙二醛（MDA，貨號(hào)：ZC-S0343）、超氧化物歧化酶（SOD，貨號(hào)：ZC-S0350）、谷胱甘肽過(guò)氧化酶（GSH-Px，貨號(hào)：ZC-38196）試劑盒購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司；相關(guān)一抗Caspase-3（貨號(hào)：ab32150）、bax（貨號(hào)：ab81083）、bcl-2（貨號(hào)：ab32124）、AMPKα（貨號(hào)：ab32047）、p-AMPKα（貨號(hào)：ab133448）、mTOR（貨號(hào)：ab134903）、p-mTOR（貨號(hào)：ab109268）購(gòu)自英國(guó)Abcam；Thermo酶標(biāo)儀（MK3）上海賽默生物科技發(fā)展有限公司；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（貨號(hào)：RR820A）購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物；Western細(xì)胞裂解液（貨號(hào)：P0013）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：P0009）購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 早發(fā)性卵巢功能不全小鼠模型構(gòu)建及分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)小鼠1周后，均經(jīng)陰道脫落細(xì)胞涂片篩查，性周期正常。隨機(jī)挑選8只作為空白組，其余40只誘導(dǎo)早發(fā)性卵巢功能不全模型。造模步驟參考Hoyer等[13]的方法：造模小鼠每日腹腔注射VCD溶液5 mL·kg-1，空白組小鼠每日注射5 mL·kg-1生理鹽水，連續(xù)15天。從注射第1天起，每天早上行經(jīng)陰道脫落細(xì)胞涂片檢查，根據(jù)造模小鼠動(dòng)情周期紊亂或延長(zhǎng)，判斷造模成功。

1.4 給藥方法

將造模成功后的小鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性藥物組（戊酸雌二醇片）、二仙湯低劑量組、二仙湯中劑量組、二仙湯高劑量組，每組8只。后開(kāi)始灌胃給藥，陽(yáng)性藥物組按每次0.3 mL給予戊酸雌二醇片水溶液，二仙湯高、中、低劑量組分別按 12 g·kg-1、8 g·kg-1、4 g·kg-1灌胃，空白組和模型組給予生理鹽水每次0.3 mL，連續(xù)6周。其中，二仙湯的制備：按10 g仙茅、10 g仙靈脾、10 g當(dāng)歸、15 g巴戟天、10 g知母、10 g黃柏、15 g地骨皮、12 g女貞子分別取藥材，加入雙蒸水浸泡30 min，后煎煮、過(guò)濾、濃縮至生藥量為1.2 g·mL-1。按“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”配制低、中和高劑量藥液。戊酸雌二醇片用三蒸水溶解制成溶液，每毫升溶液含戊酸雌二醇0.009 mg。

1.5 觀(guān)察指標(biāo)

1.5.1 卵巢組織病理學(xué)觀(guān)察及卵泡計(jì)數(shù)

取小鼠卵巢組織，經(jīng)4%中性多聚甲醛固定24 h后，石蠟包埋切片，厚3-5 μm，HE染色，光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析和卵泡計(jì)數(shù)，根據(jù)已發(fā)表的描述和定義卵泡被檢測(cè)并分類(lèi)為原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和閉鎖卵泡[14]。

1.5.2 血清激素及卵巢組織氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

通過(guò)腹主動(dòng)脈采集各組小鼠血液樣品，3500 r·min-1離心15 min，收集上清液，采用試劑盒檢測(cè)小鼠的血清激素水平：E2、LH、FSH水平。取小鼠卵巢組織，將卵巢組織在冰PBS中沖洗，濾紙吸干后，剪成小塊，加入5 mL PBS在冰上用玻璃勻漿器勻漿，再進(jìn)行2次反復(fù)凍融，進(jìn)一步破碎細(xì)胞膜，勻漿物以5000 r·min-1離心20 min，取上清液，按試劑盒測(cè)定卵巢組織中ROS、MDA、SOD和GSH-Px的含量。

1.5.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Caspase-3、bax、bcl-2表達(dá)

固定的卵巢組織經(jīng)冠狀面切成5 μm厚的連續(xù)切片，切片用含3% H2O2的過(guò)氧化物酶阻斷劑孵育30 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性和非特異性抗原。洗滌后用正常山羊血清封閉切片15 min。隨后，用Caspase-3（1∶100）、bcl-2（1∶100）、bax（1∶100）特異性一抗孵育切片過(guò)夜。洗滌后與生物素標(biāo)記的二抗在37℃孵育2 h，DAB顯色，蘇木精反染，脫水、透明，陽(yáng)性細(xì)胞染成棕色，在放大倍數(shù)（40×）下每張切片計(jì)數(shù)5個(gè)視野，確定Caspase-3、bax以及bcl-2陽(yáng)性染色的強(qiáng)度。

1.5.4 TUNEL染色檢測(cè)卵巢組織細(xì)胞凋亡

取卵巢組織，用4%多聚甲醛固定24 h后，包埋，連續(xù)切片，厚度5 μm，TUNEL染色觀(guān)察卵巢組織細(xì)胞凋亡情況。

1.5.5 qRT-PCR檢測(cè)AMPKα、mTOR mRNA表達(dá)

應(yīng)用TRIzol試劑卵巢組織中提取RNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用TB Green PreMix ex Taq II試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。以β-actin為內(nèi)參。引物序列：AMPKα：上游引物5’-CAGTGATGAGGTGGTGGAGCA GAGGT-3’，下游引物5’-GTGAATGGTTCTCGGCTGT GCTGGAA-3’；mTOR：上游引物5’-AGAGGACCAGC AGCACAAGCAGGA-3’，下游引物5’-TGGTGCAGTGG TGGTGGCATT-3’；β-actin：上游引物5’-AGCGGGAA ATCGTGCGTGAC-3’，下游引物5’-ACTCCTGCTTGCT GATCCACATC-3’。以95℃ 10 min，95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，45個(gè)循環(huán)，記錄CT值，2-ΔΔCT分析相對(duì)表達(dá)水平。

1.5.6 Western blot檢測(cè)AMPKα、p-AMPKα、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)

將卵巢組織勻漿于放射免疫沉淀分析緩沖液（RIPA）中，在4℃下5000 r·min-1離心后，收集上清液，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，然后在95℃變性5 min。將等量的蛋白質(zhì)負(fù)載到8%的SDS-PAGE凝膠上，通過(guò)電泳分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫孵育1 h后，分別與抗AMPKα、p-AMPKα、mTOR、p-mTOR（均1：500）或β-actin（1∶1000）在4℃孵育過(guò)夜，再與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗在室溫下孵育2 h，ECL檢測(cè)免疫反應(yīng)條帶，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像，Image J軟件分析光密度，以β-actin為內(nèi)參，對(duì)照組目標(biāo)蛋白質(zhì)相對(duì)含量為1，計(jì)算各組蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（），兩組間均數(shù)比較采用LSD-t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二仙湯對(duì)早發(fā)性卵巢功能不全小鼠卵巢組織病理學(xué)、卵泡計(jì)數(shù)的影響

空白組卵泡的顆粒細(xì)胞層排列規(guī)則，無(wú)明顯變化；模型組卵泡的顆粒細(xì)胞層排列紊亂，各級(jí)生長(zhǎng)卵泡數(shù)量減少、閉鎖卵泡數(shù)量增多。與模型組比較，4個(gè)治療組的卵泡顆粒細(xì)胞排列較為規(guī)則，大多卵泡結(jié)構(gòu)較為完整，治療后各級(jí)生長(zhǎng)卵泡數(shù)量增多、閉鎖卵泡數(shù)量減少，其中二仙湯高劑量組對(duì)卵巢形態(tài)及卵泡數(shù)顯示出更明顯的改善作用。如圖1。

2.2 二仙湯對(duì)早發(fā)性卵巢功能不全小鼠血液激素水平的影響

與空白組比較，模型組E2含量明顯降低，LH、FSH含量明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，僅二仙湯高劑量組均明顯升高E2含量，明顯降低LH、FSH含量（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 二仙湯對(duì)早發(fā)性卵巢功能不全小鼠氧化應(yīng)激的影響

與空白組比較，模型組ROS、MDA含量明顯升高，SOD、GSH-Px活性明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，戊酸雌二醇組、二仙湯高劑量組ROS含量明顯降低，GSH-Px活性明顯升高（P＜0.05）；二仙湯高劑量組ROS、MDA含量明顯降低，SOD、GSH-Px活性明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

圖1 各組小鼠組織病理變化及卵泡計(jì)數(shù)（HE染色）

表1 各組小鼠血清E2、LH、FSH、AMH含量變化

2.4 二仙湯對(duì)早發(fā)性卵巢功能不全小鼠組織細(xì)胞凋亡的影響

免疫組化結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組Caspase-3、bax表達(dá)明顯增加，bcl-2表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，戊酸雌二醇組、二仙湯低、中、高劑量組Caspase-3表達(dá)明顯降低，bcl-2表達(dá)明顯升高（P＜0.05），二仙湯高劑量組 bax表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與戊酸雌二醇組比較，二仙湯高劑量組bax表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。（圖2A，2C）。TUNEL熒光染色結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組細(xì)胞凋亡明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，戊酸雌二醇組、二仙湯低、中和高劑量組細(xì)胞凋亡被明顯抑制（P＜0.05）。（圖2B，2C）。

2.5 二仙湯對(duì)早發(fā)性卵巢功能不全小鼠AMPK/mTOR信號(hào)通路的影響

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組AMPKα、mTOR mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，二仙湯高劑量組AMPKα、mTOR mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組AMPKα、mTOR蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），p-AMPKα、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，治療組AMPKα、mTOR蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），二仙湯中、高劑量組p-AMPKα和p-mTOR蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

表2 各組小鼠卵巢組織ROS、MDA、SOD、GSH-Px含量

圖2 各組小鼠細(xì)胞凋亡比較

圖3 各組小鼠卵巢組織AMPK/mTOR通路相關(guān)因子變化

3 討論與結(jié)論

3.1 二仙湯治療改善POI卵巢功能及氧化應(yīng)激

卵泡計(jì)數(shù)是卵巢功能的重要指標(biāo)，研究顯示，卵泡衰竭是由宮內(nèi)期原始卵泡池形成不足、卵泡消耗增加、自身免疫性或中毒性卵泡降解引起的，且當(dāng)卵巢卵泡的正常功能被病理過(guò)程阻斷時(shí)將會(huì)發(fā)生卵泡功能障礙[15]。本研究結(jié)果顯示，POI小鼠卵巢內(nèi)卵泡的顆粒細(xì)胞層排列紊亂，原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡較空白組減少，而閉鎖卵泡數(shù)量呈現(xiàn)增加，二仙湯可改善此現(xiàn)象。此外，卵巢功能還主要體現(xiàn)在內(nèi)分泌和生殖功能上，抗苗勒氏管激素可抑制顆粒細(xì)胞對(duì)FSH的敏感性，從而在優(yōu)勢(shì)卵泡選擇中發(fā)揮作用[16]。此外，氧化應(yīng)激與女性和男性的逆行生殖病例的病因有關(guān)[17]，ROS水平較高的卵巢功能早衰患者中服用輔酶Q可以改善胚胎質(zhì)量[18]，提出氧化應(yīng)激的增加與卵巢功能早衰相關(guān)的卵巢炎有關(guān)[19]，且高ROS水平導(dǎo)致線(xiàn)粒體異常，可能會(huì)導(dǎo)致因氧化磷酸化和卵子生成紊亂而產(chǎn)生低的三磷酸腺苷、卵細(xì)胞數(shù)量減少以及卵巢功能早衰[20]。在本研究中，POI小鼠LH、FSH、ROS、MDA 含量明顯升高、E2含量及SOD、GSH-Px活性明顯降低；二仙湯高劑量可逆轉(zhuǎn)上述因子水平。與A?a?ayak等[21]的研究報(bào)道一致，證明POI小鼠出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂，卵巢功能損害，氧化應(yīng)激指數(shù)升高，二仙湯可改善POI小鼠的卵巢功能及氧化應(yīng)激水平。

3.2 二仙湯治療可抑制POI細(xì)胞凋亡及激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路

細(xì)胞凋亡在女性生殖系統(tǒng)的生長(zhǎng)和發(fā)育中起重要作用，不同的應(yīng)激刺激可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，證據(jù)表明，ROS的產(chǎn)生可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。然而，目前為止還沒(méi)有研究探討二仙湯對(duì)POI誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用。雖然細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)制仍然存在許多問(wèn)題，但證據(jù)證實(shí)，細(xì)胞凋亡與mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)密切相關(guān)。此外，AMPK介導(dǎo)的mTOR激活抑制了卵泡閉鎖期間卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡[23]。AMPK/mTOR信號(hào)通路參與凋亡、自噬和細(xì)胞存活，AMPK的激活可以抑制mTOR的磷酸化，而mTOR可以通過(guò)調(diào)節(jié)下游信號(hào)分子來(lái)阻斷細(xì)胞凋亡，如抑制Caspase-9的激活，以及滅活bcl-2家族成員[24]。Liu等[25]研究發(fā)現(xiàn)AMPK/mTOR信號(hào)通路可能激活了壬基酚誘導(dǎo)的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡和自噬。且證據(jù)表明，AMPK信號(hào)通路可被氧化應(yīng)激激活[25]。另外，mTOR激活mTORC1并增加下游基因Rheb、S6k1、4E-BP1的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)卵母細(xì)胞內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)錄進(jìn)而促進(jìn)卵泡的發(fā)育[26]。雌激素能夠激活A(yù)MPK，導(dǎo)致E2和LH水平變化，進(jìn)一步反饋性調(diào)節(jié)FSH、LH分泌[27]。本研究結(jié)果顯示，POI小鼠卵巢中Caspase-3、bax表達(dá)及細(xì)胞凋亡明顯升高，bcl-2表達(dá)、AMPKα、mTOR mRNA及p-AMPKα、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯降低；二仙湯高劑量組Caspase-3、bax表達(dá)及細(xì)胞凋亡明顯降低，bcl-2表達(dá)、AMPKα、mTOR mRNA 及 p-AMPKα、pmTOR蛋白表達(dá)明顯升高。提示二仙湯能夠抑制POI卵巢組織細(xì)胞凋亡及刺激AMPK/mTOR通路顯著激活。

綜上所述，二仙湯可改善早發(fā)性卵巢功能不全小鼠的卵巢功能及氧化應(yīng)激，其保護(hù)作用可能是由AMPK/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)的，然而，尚需要更多的研究來(lái)確定二仙湯對(duì)POI的改善作用，特別是二仙湯的多靶點(diǎn)作用，可能為未來(lái)POI治療的潛在方向，也為今后基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，系統(tǒng)綜合地觀(guān)察二仙湯對(duì)POI的干預(yù)與影響奠定基礎(chǔ)。