馮笑梅 ,郝興瑤,文 勇

經(jīng)過50多年的研究，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)已被證明是再生醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域中用途廣泛、使用頻率較高的成體干細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景[1]，在口腔組織再生中也被大量運用[2]。然而多種體內(nèi)外誘因能夠造成其衰老，隨著衰老相關(guān)基因和表觀遺傳的變化逐漸積累，子代細(xì)胞數(shù)量銳減、質(zhì)量降低，最終導(dǎo)致干細(xì)胞應(yīng)用效率下降，若體內(nèi)長期積聚衰老細(xì)胞則會導(dǎo)致機體老化甚至發(fā)生衰老相關(guān)疾病[3]。

基于此，亟需適當(dāng)?shù)闹委熓侄沃責(zé)ㄋダ霞?xì)胞生機，提升再生醫(yī)學(xué)療效，延長人類健康壽命。目前，已知多種相關(guān)干預(yù)措施，包括細(xì)胞重編程[4]、外泌體治療[5]、小分子化合物治療等，且均在生物模型中展現(xiàn)出不菲的治療價值。但由于大部分方法受到倫理限制，難以實現(xiàn)安全化、標(biāo)準(zhǔn)化監(jiān)測，不太可能轉(zhuǎn)化于臨床。因此，探索一種簡易、安全、有效的延緩間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的方法具有重要的實踐與臨床意義，其中，小分子化合物的應(yīng)用逐漸成為近年的研發(fā)熱點。

1 MSCs衰老概論

1.1 MSCs

MSCs具有自我更新及多向分化潛能[1]，組織來源廣泛，可以自骨髓、臍帶、牙周、牙髓等部位采集[6]。其豐度較低，且通常處于靜止?fàn)顟B(tài)，但能在一定刺激下重新進入細(xì)胞周期，確保子代干細(xì)胞的持續(xù)供應(yīng)[7]，并能在不同誘導(dǎo)條件下分化為特定細(xì)胞，通過遷移、歸巢修復(fù)組織功能[8]。

1.2 細(xì)胞衰老的定義、誘因

細(xì)胞衰老是一種可誘導(dǎo)、持久的細(xì)胞周期停滯現(xiàn)象[3]，誘發(fā)因素包括：DNA損傷[9]、持續(xù)DNA復(fù)制壓力造成的端粒酶縮短[10]、線粒體功能障礙[11]、氧化應(yīng)激[12]、干細(xì)胞自噬失調(diào)[13]等(圖1)。根據(jù)誘因可大致將MSCs的衰老類型分為3類：復(fù)制性衰老、功能失調(diào)性衰老、應(yīng)激性衰老。

圖1 常見的間充質(zhì)干細(xì)胞衰老誘因Fig.1 Common causes of MSCs’ senescence

1.3 衰老MSCs的特征

MSCs的衰老是一種復(fù)雜的、動態(tài)應(yīng)對潛在有害應(yīng)激的綜合反應(yīng)機制[3]，相關(guān)特征在此過程中呈現(xiàn)多樣性，涉及的分子、表型均可作為鑒定細(xì)胞衰老的標(biāo)志物。

首先，細(xì)胞形態(tài)變化最顯著，由于動態(tài)肌動蛋白細(xì)胞骨架基因簇表達(dá)下調(diào)，肌動蛋白更新放緩[14]，衰老MSCs由原本典型的紡錘狀，轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞樣，體積變大、形態(tài)變扁[15]。而最明確的特征是細(xì)胞周期停滯——各類誘因激活p53/p21CIP1和p16INK4a/Rb腫瘤抑制信號通路啟動衰老，下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子參與信號放大，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1期[16-17]。另外，衰老細(xì)胞高度抵抗不同基因毒性損傷誘導(dǎo)的凋亡[18]，其中的效應(yīng)因子包括Bcl-2、p53、HSP90等[19]。

此外，衰老細(xì)胞代謝活躍，分泌趨化因子、促炎細(xì)胞因子等成分組成的衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)，維持和傳播衰老狀態(tài)[20]。細(xì)胞衰老后溶酶體含量增加，其內(nèi)的衰老相關(guān)β半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal)活性相應(yīng)增強，此項特征是目前細(xì)胞衰老鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)[21]。

另有學(xué)者認(rèn)為異染色質(zhì)廣泛空間重排，胞核形成衰老相關(guān)異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)(senescence-associated heterochromatic foci，SAHF)亦是特征之一[22]。但近年研究發(fā)現(xiàn)，異染色質(zhì)的解體會導(dǎo)致WRN缺陷的MSCs早衰，來自老年個體的原代牙髓MSCs的異染色質(zhì)標(biāo)記減少，說明SAHF和MSCs衰老并不總相耦合[23]。

2 延緩間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的小分子化合物

小分子化合物是天然提取或人工合成的分子量小于1 000 ku的有機化合物，使用廣泛、理論相對成熟，成本低廉、操作快捷，容易監(jiān)測其藥代動力學(xué)變化。目前已有部分化合物進入臨床試驗階段，產(chǎn)生了細(xì)胞重編程、外泌體治療等手段所能達(dá)到的療效，明顯改善及預(yù)防MSCs衰老，可見其優(yōu)勢顯著，是較為可靠的治療策略。

2.1 天然化合物

2.1.1 西羅莫司 西羅莫司(sirolimus，Siro)最初來源于智利復(fù)活節(jié)島土壤中的吸水鏈霉菌，臨床上常用作強效免疫抑制劑。近年來，大量研究證實，Siro是能有效激活細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)劑[13]，Siro激活衰老骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived MSCs，BM-MSCs)自噬，通過減少活性氧(reactive oxygen species，ROS)、p53水平和受損細(xì)胞數(shù)量，部分恢復(fù)衰老細(xì)胞生物學(xué)功能[13]。此外，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)通路的持續(xù)激活在細(xì)胞衰老和組織衰老中起著重要作用[24]。而研究表明，在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord derived MSCs，UC-MSCs)衰老模型中，Siro預(yù)處理抵御了衰老誘因?qū)-mTOR及其下游靶基因p70S6K的快速激活，顯著降低SA-β-Gal陽性細(xì)胞比例，抑制SASP，雙鏈DNA斷裂標(biāo)志物γ-H2AX的表達(dá)水平也隨之降低，同時維持異染色質(zhì)穩(wěn)定狀態(tài)，防止DNA的進一步損傷，有效抵抗了細(xì)胞衰老[25]。

2.1.2 白藜蘆醇 白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種食用多酚類植物保健素。除了抗氧化、抗炎、抗癌，近年來發(fā)現(xiàn)其在抗衰方面也可發(fā)揮獨到作用。Res處理衰老小鼠BM-MSCs后，細(xì)胞衰老標(biāo)志物及ROS水平顯著降低，通過AMPK/ROS信號通路促進衰老細(xì)胞成骨分化[26]。此外，Res是沉默信息調(diào)節(jié)因子Ⅰ型(silent information regulator type 1，SIRT1)的有效激活劑[27-28]，通過激活SIRT1，有效延緩早期傳代MSCs衰老并提升其干性特性[27]，但細(xì)胞在傳至第10代后，SIRT1表達(dá)水平將隨傳代進程的延續(xù)而降低[29]，因此Res對晚期傳代細(xì)胞發(fā)揮與前述完全相反的效用[27]。研究發(fā)現(xiàn)，濃度也是決定藥物作用的關(guān)鍵因素，低濃度Res提升SIRT1及增殖細(xì)胞核抗原水平，促進UC-MSCs活力，抑制衰老，而高濃度時作用翻轉(zhuǎn)，使細(xì)胞周期停滯于S期[28]。另外，細(xì)胞所處狀態(tài)也能影響藥物的抗衰老效果。Kornienko等發(fā)現(xiàn)，高濃度Res保護靜止態(tài)BM-MSCs免受氧化應(yīng)激，觸發(fā)可逆的細(xì)胞周期阻滯，且不產(chǎn)生基因毒性效應(yīng)，但會導(dǎo)致非靜止態(tài)細(xì)胞不可逆的細(xì)胞早衰、周期停滯和DNA損傷[30]。

2.1.3 褪黑素 褪黑素(melatonin，Mel)是松果體分泌的一種神經(jīng)激素肽，能調(diào)節(jié)機體晝夜節(jié)律。近來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)Mel是一種強大的內(nèi)源性自由基清除劑，應(yīng)用于抗衰老領(lǐng)域前景廣闊。Mel處理后，體外長期傳代的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose tissue derived MSCs，AD-MSCs)增殖、遷移提升，內(nèi)源性ROS含量減少，衰老標(biāo)志物表達(dá)下降，細(xì)胞干性得以維持[31]。Zhou等發(fā)現(xiàn)，BM-MSCs發(fā)生氧化應(yīng)激性早衰后，Mel通過下調(diào)p38-MAPK磷酸化，增加SIRT1表達(dá)，以劑量依賴方式有效降低p16INK4a水平，并改善其他衰老表型，提升衰老細(xì)胞成骨分化[32]。Han等發(fā)現(xiàn)，Mel能以PrPC依賴性方式維護線粒體Ⅰ、Ⅳ復(fù)合體的活性，增加線粒體重塑及氧化磷酸化，以抵御氧化應(yīng)激誘導(dǎo)下慢性腎病(chronic kidney disease，CKD)鼠來源MSCs的衰老，促進細(xì)胞增殖及粘附。而后將已處理的細(xì)胞植回體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)即使在缺血部位，細(xì)胞仍能存活并促進血管新生[33]。此外，Mel還可通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、抑制SASP[34]，增強過氧化氫酶活性、調(diào)節(jié)異常自噬[35]來延緩衰老。

2.1.4 姜黃素 姜黃素(curcumin, Cur)是一種從姜黃屬植物中提取的二酮類化合物，能夠清除ROS，抑制胞內(nèi)誘導(dǎo)性氧化應(yīng)激，并且是有效的炎癥調(diào)節(jié)劑[36-37]。大鼠AD-MSCs經(jīng)Cur處理后，倍增時長縮短，細(xì)胞中SA-β-GAL染色陽性者比例顯著減少，而TERT表達(dá)明顯增加[36]。Rocío等發(fā)現(xiàn)，Cur能夠作為NF-κB信號通路中p65蛋白的抑制劑，在下調(diào)炎性UC-MSCs衰老模型p65水平的同時，導(dǎo)致SASP失活，抑制衰老表型[37]。

2.1.5 其他潛在天然化合物 川芎嗪(tetramethylpyrazine，Tmp),是從川芎中提取的生物活性成分，在衰老小鼠骨髓中局部給藥后，可清除衰老BM-MSCs，顯著改善衰老表型及代謝微環(huán)境[38]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是綠茶茶多酚的主要組成成分，在預(yù)處理MSCs后，通過激活核因子-紅系2-相關(guān)因子2防止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老[39]。槲皮素(quercetin，Que)對采集自Werner綜合征、Hutchinson-Gilford綜合征、生理性衰老模型的MSCs均表現(xiàn)出衰老表型的延緩作用，并能延長端粒長度，恢復(fù)異染色質(zhì)構(gòu)架[40]。

2.2 合成化合物

2.2.1 二甲雙胍 二甲雙胍(metformin，Met)是治療Ⅱ型糖尿病的一線藥物，除此之外還具有多效性，是近年“老藥新用”的代表。研究發(fā)現(xiàn)，Met預(yù)處理人牙周膜細(xì)胞24 h，便能以劑量依賴方式降低氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的胞內(nèi)ROS積聚，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞衰老效應(yīng)，保護細(xì)胞成骨潛能，并且，該過程可能與細(xì)胞自噬相關(guān)[41]。此外，Kim等發(fā)現(xiàn)，Met降低衰老相關(guān)標(biāo)志物SA-β-GAL、p16INK4α的表達(dá)，以AMPK依賴性方式抑制SASP水平的升高，靶向減輕CKD-MSCs的衰老程度，恢復(fù)細(xì)胞增殖能力，減少DNA氧化損傷[42]。

2.2.2 Senolytics Senolytics尚無統(tǒng)一中文名稱，國內(nèi)有研究者將其譯為“衰老細(xì)胞清除劑”[43]，它并非一個特定化合物，而是一類化合物或組合用藥的統(tǒng)稱。一項有關(guān)糖尿病慢性腎病治療的臨床研究證實，作為第一批被研發(fā)出的Senolytics，達(dá)沙替尼+槲皮素(dasatinib+quercetin，D+Q)組合用藥能減少循環(huán)中的關(guān)鍵SASP因子，特異性清除高表達(dá)p16INK4a和p21CIP1的衰老細(xì)胞，降低胞內(nèi)SA-β-GAL活性[44]。此外，Zhu等發(fā)現(xiàn)，D+Q組合用藥可顯著清除小鼠體內(nèi)衰老的BM-MSCs[45]。另有大量研究佐證，多種Senolytics可用于清除衰老MSCs。例如，細(xì)胞凋亡通路重要調(diào)節(jié)因子Bcl-2蛋白家族的抑制劑ABT-263可以去除復(fù)制衰老的MSCs，但對端粒長度無明顯影響[46]。HSP90抑制劑17-DMAG作為一種新型的Senolytics，可以極大降低早衰鼠模型的衰老BM-MSCs百分比[47]。應(yīng)注意到的是，Senolytics作用方式與其他小分子化合物不同，其一，其靶點為衰老細(xì)胞本身，而非特定的單一分子如受體或調(diào)節(jié)酶，也不是單一的生化途徑如信號通路；其二，其作用是降低整體的衰老細(xì)胞負(fù)擔(dān)，而非針對單個器官或結(jié)構(gòu)[44]。然而，在腫瘤抑制、胚胎發(fā)育等生理性過程中，細(xì)胞衰老反而發(fā)揮了對機體的保護作用。因此，在未來臨床應(yīng)用中，應(yīng)慎重考慮Senolytics治療的時機、部位，并嘗試通過多種化合物修飾手段，增加其對目標(biāo)組織靶細(xì)胞的專一性[43]。

3 結(jié) 語

上述熱點小分子化合物，不論自天然生物提取還是人工合成，均能顯著對抗MSCs衰老，并且歸根到底是通過削減衰老誘因或改善干細(xì)胞所處微環(huán)境發(fā)揮作用的。然而，目前尚不清楚它們在體內(nèi)的應(yīng)用是否會造成長遠(yuǎn)的不良影響。因此，為了提升MSCs在口腔組織再生中的應(yīng)用與治療效率，研究還需要利用更多的生物模型，觀察衰老細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展規(guī)律及用藥治療后的細(xì)胞生物學(xué)變化，進一步探索個性化用藥方案或基于生物材料的治療方法，例如使用多種化合物聯(lián)合治療或改良輸送方法，將可能的不良反應(yīng)作用降至最低，在保證用藥安全的前提下轉(zhuǎn)化于臨床，產(chǎn)生最有效、最優(yōu)化的干細(xì)胞治療預(yù)后。