●劉玉太 車?yán)h 吳橋興 趙澤明 朱奇峰 金學(xué)林※※

（1.陜西省動物研究所 陜西 西安 710032；2.陜西省秦嶺珍稀瀕危動物保育重點實驗室 陜西 西安 710000）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）屬黃病毒科瘟病毒屬，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒[1]。該病毒主要感染牛、羊、豬、鹿、駱駝及許多野生動物，BVDV感染可造成易感動物腹瀉、高溫、白細(xì)胞減少、黏膜糜爛和脫落等臨床癥狀[2]，該病在幼畜中傳播迅速，感染率和發(fā)病率均較高，還會造成孕畜流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎、畸形胎和繁殖機能障礙等。

牛 輪 狀 病 毒（Bovine rotavirus，BRV）由Bishop等于1973年發(fā)現(xiàn)，屬呼腸病毒科輪狀病毒屬，大小為60～80 nm，無包膜和多層核衣殼的RNA病毒[3]。該病毒主要感染1周齡內(nèi)幼畜，其中犢牛最為易感，表現(xiàn)為水樣腹瀉和嚴(yán)重脫水，嚴(yán)重時出現(xiàn)血便，成年牛感染后多呈隱性經(jīng)過[4-5]。

牛冠狀病毒（Bovine coronavirus，BCoV）屬于冠狀病毒科乙型冠狀病毒屬2a亞群，是一種有包膜、不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒[6]。感染該病毒會引起犢牛腹瀉、成年牛冬痢和肺炎等呼吸道疾病[7]。1周齡幼畜最易感染該病毒，導(dǎo)致其出現(xiàn)嚴(yán)重的出血性腹瀉、嚴(yán)重脫水和代謝性酸中毒[8]。

陜西省具有悠久的梅花鹿養(yǎng)殖歷史，20世紀(jì)50年代，西安藍(lán)田、長安、周至等縣開辦了國營梅花鹿飼養(yǎng)場。目前省內(nèi)飼養(yǎng)梅花鹿的各類企業(yè)有50余家，總存欄5000余只，陜南、關(guān)中、陜北均有分布。2020年5月，人工飼養(yǎng)的梅花鹿、馬鹿首次被列入《國家畜禽遺傳資源品種目錄》，調(diào)動了陜西畜牧從業(yè)人員飼養(yǎng)梅花鹿的積極性，梅花鹿養(yǎng)殖業(yè)正逐漸成為陜西農(nóng)村農(nóng)民脫貧致富的重要產(chǎn)業(yè)。BVDV、BRV、BCoV感染鹿群不僅會降低養(yǎng)殖戶的收益，還會影響梅花鹿養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本研究通過采集梅花鹿肛拭子樣品，使用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)對3種病毒感染情況進(jìn)行檢測，為陜西省梅花鹿BVDV、BRV和BCoV的防控提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年5月至6月，在陜西省具有代表性的4個養(yǎng)鹿地區(qū)的6個鹿場采集梅花鹿肛拭子共61份（漢中2個梅花鹿場、安康1個梅花鹿場、商洛1個梅花鹿場、咸陽2個梅花鹿場），低溫運輸至實驗室，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

Trizol購自美國Thermo Fisher Scientific公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司；Random primer購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；dNTP 2.5 mol/L購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；2×PCR MasterMix購自北京聚合美公司；DEPC水購自西安赫特生物公司；PCR儀（GT19612）購自杭州柏恒科技有限公司；高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司；渦旋振蕩器購自美國Scientific Industries公司；超凈工作臺購自北京科偉永興儀器有限公司；電子天平購自余姚市金諾天平儀器有限公司。

1.3 BVDV、BRV、BCoV抗原檢測方法

1.3.1 樣品處理將肛拭子樣品從-80℃環(huán)境中取出，置于4℃條件下解凍。解凍后的肛拭子樣品置于已滅菌的1.5 mL離心管中，每管加入1 mL PBS，渦旋5 min，離心后各取上清液500 μL置于新的離心管中備用。

1.3.2 總RNA提取上清液中各加入500 μL的Trizol溶液，充分混合均勻，加入200 μL的氯仿，蓋緊離心管劇烈搖蕩15 s，冰上靜置2 min。4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清液置于新的1.5 mL離心管中，加入等體積異丙醇，溫和顛倒混勻。室溫放置10 min，-80℃放置1 h。4℃，12 000 r/min離心15 min，棄上清，加入1 mL的75%乙醇，顛倒混勻。4℃，7500 r/min離心5 min，棄上清，4℃，12000 r/min空離1 min，用20 μL的移液器吸干剩余水分，室溫下干燥10 min。用10 μL DEPC水溶解提取的RNA。

1.3.3 RNA濃度測定利用Nano測定儀測定樣品總RNA濃度和A260/A280比值，RNA濃度≥100 ng/μL，比 值 在1.8～2.0間 視 為RNA樣 品合格。

1.3.4 cDNA反轉(zhuǎn)錄用兩步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，第一步70℃變性5 min，之后立即冰浴放置2 min。第二步37℃ 60 min，-20℃保存。兩步法反轉(zhuǎn)錄體系，見表1。

表1 反轉(zhuǎn)錄體系

1.3.5 引物設(shè)計BVDV、BRV、BCoV病毒基因擴增引物由上海生工合成。均按要求各自加入相應(yīng)ddH2O，吹打混勻制成母液（100 μmol/L），再取10 μL母液置于新的1.5 mL離心管中，加入90 μL ddH2O 稀釋，制成工作液（10 μmol/L）。擴增引物，見表2。

表2 3種病毒基因擴增引物

1.3.6 PCR擴增將RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA按15 μL體系進(jìn)行PCR擴增，體系組分，見表3。BVDV反 應(yīng) 條 件 為94℃ 5 min；94℃ 30 s，47℃30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃ 7 min。BCoV、BRV反應(yīng)條件為95℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個 循 環(huán)；72℃ 10 min。PCR結(jié)束后，BVDV使用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，BRV、BCoV使用 1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表3 PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果與分析

使用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)對陜西省四地6個鹿場的61份梅花鹿肛拭子進(jìn)行BVDV、BRV、BCoV感染情況檢測，部分代表性結(jié)果見圖1、圖2和圖3。61份樣品中BVDV陽性樣品0份，BRV陽性樣品0份，BCoV陽性樣品0份。

圖1 梅花鹿肛拭子BVDV檢測代表性結(jié)果

圖2 梅花鹿肛拭子BRV檢測代表性結(jié)果

圖3 梅花鹿肛拭子BCoV檢測代表性結(jié)果

3 結(jié)論與討論

腹瀉是梅花鹿飼養(yǎng)過程中的常見病和多發(fā)病，占梅花鹿病例的50%～60%，臨床上以排便次數(shù)增加和糞便不成形為典型癥狀[9]。根據(jù)發(fā)病原因不同，可將梅花鹿腹瀉病分為兩大類，一類是由營養(yǎng)、環(huán)境、管理、應(yīng)激等因素造成的非傳染性腹瀉病，另一類是由細(xì)菌、病毒、寄生蟲等致病源感染引起的傳染性腹瀉病，其中以病毒引起的病毒性、傳染性腹瀉病發(fā)病率最高，危害最為嚴(yán)重。BVDV、BRV和BCoV是3種常見的可引起動物病毒性腹瀉的病毒。

BVDV感染梅花鹿并引起疾病反應(yīng)已在多篇文獻(xiàn)中被報道。Doyle[10]調(diào)查了45種野生反芻動物，發(fā)現(xiàn)鹿科動物的血清中抗體陽性率達(dá)28%。王新平等[11]證實了我國鹿群存在不同程度的BVDV感染，其中育成梅花鹿的帶毒率為34.1%。杜銳等[12-13]調(diào)查顯示，幼鹿群中BVDV感染率達(dá)60.0%～86.7%，并在鹿腹瀉糞樣中檢測到BVDV粒子。郜玉剛等[14]從梅花鹿流產(chǎn)胎兒病料中分離出了BVDV病毒，并命名為CCSYD株。孟日增等[15]采用夾心ELISA方法檢測鹿群的BVDV感染情況，陽性率為32.5%。可見，BVDV已成為危害養(yǎng)鹿業(yè)的重要病原之一。雖然我國鹿群內(nèi)BRV和BCoV的感染情況尚無文獻(xiàn)報道，但國外的研究表明，BCoV和BRV可跨種感染鹿科動物。Alekseev等[16]對包括水鹿、白尾鹿在內(nèi)的4種野生反芻動物糞便內(nèi)的冠狀病毒基因進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)其核苷酸序列與BCoV相似度達(dá)99.4%～99.6%，并且認(rèn)為?？赡苁锹沟纫吧雌c動物冠狀病毒感染的傳染源，反之亦然。Kim等[17]采集了77只野生水鹿的鼻拭子，其中3只表現(xiàn)BCoV陽性。Yokoi等[18]報道了日本179只馴養(yǎng)的梅花鹿BCoV陽性率為1.1%。Kim等[19]發(fā)現(xiàn)野生水鹿體內(nèi)輪狀病毒的陽性率為2%。Romano等[20]在挪威和瑞典的馴鹿體內(nèi)檢測到了BRV。Shibahara等[21]通過免疫組化技術(shù)在一只由腹瀉致死的5月齡馴鹿腸道組織中檢測到BRV?？傊珺VDV、BRV和BCoV可通過牛等家畜跨種傳播感染梅花鹿，造成鹿群腹瀉、消瘦甚至死亡等臨床癥狀，危害梅花鹿養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。

本研究中，陜西省內(nèi)的梅花鹿樣品BVDV、BRV和BCoV感染調(diào)查結(jié)果全部為陰性，一方面可能與本研究采集的樣品數(shù)量少有關(guān)，另一方面在一定程度上反映陜西省的梅花鹿鹿群BVDV、BRV和BCoV防控效果良好。但是梅花鹿養(yǎng)殖人員對這3種病毒的防范仍然不能忽視，尤其是牛羊養(yǎng)殖發(fā)達(dá)的關(guān)中、陜北地區(qū)。

本研究中陜西省的梅花鹿樣品BVDV、BRV和BCoV感染調(diào)查結(jié)果雖全部為陰性，但樣品陰性并不代表鹿群不存在這3種病毒。隨著陜西省梅花鹿產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，梅花鹿養(yǎng)殖密度增大，鹿群之間交易頻繁，必然會增大BVDV、BRV和BCoV的感染概率。目前，這3種病毒引起的腹瀉性疾病均無有效的治療和免疫方法，且常存在混合感染情況，給臨床診斷治療增加了難度。因此，加強檢疫和凈化工作，重視區(qū)域性防控，對防范梅花鹿群感染BVDV、BRV和BCoV具有重要意義。