侯嬌嬌，張江波，張月玲

(1.焦作市中站區(qū)龍翔街道辦事處，河南 焦作 454000；2.濟(jì)源市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 濟(jì)源 459000)

甜 瓜(Cucumis melo L．)是 葫 蘆 科(Cucurbitaceae)甜瓜屬植物中的一種重要的瓜類作物，在我國瓜類作物栽培中占有較大種植面積。近10年來，隨著植物基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)將目的基因?qū)胩鸸峡梢杂行Э旖莸靥岣咛鸸系目鼓嫘圆⒏牧计淦焚|(zhì)。在甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化的方法中，除花粉管通道法之外，其他方法均建立在組織和細(xì)胞再生完整植株的基礎(chǔ)上。在組織培養(yǎng)方面，目前已能夠通過子葉、真葉等外植體再生完整植株。1989年Dirks等以子葉和真葉為外植體，成功得到了5個甜瓜雜交種的再生體系[1]；同年，Niedz等以甜瓜幼齡子葉為外植體獲得了4個厚皮甜瓜基因型的再生體系[2]；之后，Homma Y.等、Kathal R.等的研究涉及了更多的甜瓜基因型[3-4]。在國內(nèi)，多以甜瓜子葉作為外植體進(jìn)行再生體系的建立。王建設(shè)等建立了伊麗莎白主栽品種的再生體系[5]；肖守華等、師桂英等建立了黃河蜜甜瓜等幾個厚皮甜瓜品種的高效再生體系[6-7]。在真葉方面，2009年王福蘭以甜瓜薄皮品種“甘甜一號”為材料，成功得到了甜瓜真葉再生體系[8]。但未見對芝麻酥甜瓜品種再生研究的報道。由于不同部位的外植體再生潛力不同[9]，不同培養(yǎng)條件下外植體的再生潛力、頻率存在很大差異[10]，不同甜瓜品種的組培再生潛力因基因型不同而表現(xiàn)出明顯差異，而且不同培養(yǎng)基種類，尤其是添加的植物激素種類及其配比對甜瓜組培再生潛力的影響也不同[11]。

甜瓜果實香甜，營養(yǎng)豐富。隨著生活水平的提高，人們越來越注重其品質(zhì)和產(chǎn)量。運(yùn)用生物技術(shù)手段進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新，培育出高產(chǎn)且優(yōu)質(zhì)的甜瓜新品種成為甜瓜遺傳育種研究的新熱點。甜瓜高效再生體系的建立，對于進(jìn)一步進(jìn)行甜瓜轉(zhuǎn)基因等方面的研究十分必要，目前，已能夠利用胚軸、胚根和子葉等外植體通過器官發(fā)生途徑或體細(xì)胞胚途徑再生完整植株。但國內(nèi)關(guān)于葉片再生的報道較少，研究者多以甜瓜子葉作為外植體。因為利用葉片作為外植體，材料來源容易，可通過不斷繼代培養(yǎng)組培苗得到，尤其對于珍貴稀少的品種其意義更大。本文研究了不同激素組合、不同取材方式、不同光照條件等影響甜瓜葉片不定芽分化的因素，為應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良甜瓜性狀奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

甜瓜品種“芝麻酥”的成熟種子。MS培養(yǎng)基、6-BA、IAA。人工氣候箱（MGC-250BP-2），超凈工作臺（SW-CJ-1F），高壓滅菌鍋，微波爐，電子天平（BL210S北京賽多利斯天平有限公司），冰箱，烘箱，量筒，手術(shù)刀，鑷子，封口膜，燒杯，移液管，酒精燈等。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制。MS培養(yǎng)基的配制。以配制400 mL MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配制方式如下：依次量取40 mL母液Ⅰ，4 mL母液Ⅱ，4 mL母液Ⅲ，4 mL母液Ⅳ于燒杯中，加入少量蒸餾水混勻，然后再加入稱好的12 g蔗糖和3.2 g瓊脂粉，攪拌混勻最后加蒸餾水定容至400 mL。用1 mol/L NaOH將培養(yǎng)基的pH值調(diào)至5.8左右，放入微波爐中加熱融化瓊脂。最后分裝到三角瓶中，每瓶大約50 mL。不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制。在MS培養(yǎng)基上設(shè)置20種生長調(diào)節(jié)劑組合(表1)，分別對外植體進(jìn)行分化培養(yǎng)。

表1 20種誘導(dǎo)不定芽分化培養(yǎng)基

1.2.2 種子的接種。將甜瓜種子剝?nèi)ず螅?.1%的升汞表面滅菌5 min，無菌水沖洗4～5次，然后取出種子接種于MS固體培養(yǎng)基上。

1.2.3 預(yù)培養(yǎng)及不定芽誘導(dǎo)。（1）預(yù)培養(yǎng)：將接種好的種子放入條件為溫度（25±1）℃光周期為16 h光照/8 h黑暗（正常光周期）的光照培養(yǎng)箱中，進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)10 d，以期獲得下一步試驗所需的材料，即葉片。（2）不定芽的誘導(dǎo):在無菌條件下，取預(yù)培養(yǎng)獲得的，新梢頂端未完全展開的葉片（不帶葉柄），切成大約0.4 cm×0.4 cm甜瓜葉外植體小塊，接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。然后轉(zhuǎn)入溫度（25±1）℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗（正常光周期）的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計愈傷組織及不定芽的發(fā)生情況。

在葉片（不帶葉柄）最佳激素條件下，取10 d苗齡新梢頂端未完全展開的葉片，不帶葉柄、帶葉柄（0.5 mm）兩種取材方式，直接轉(zhuǎn)入溫度（25±1）℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗（正常光周期）的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計愈傷組織及不定芽的發(fā)生情況。

在最適取材方式和最佳激素條件下選取試管苗幼嫩未完全展開葉片，接種于分化培養(yǎng)基上，設(shè)計前期暗培養(yǎng)時間為5 d，然后移至正常條件下培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計葉片不定芽的發(fā)生情況。

1.2.4 統(tǒng)計方法及數(shù)據(jù)分析方法。接種30 d后統(tǒng)計不定芽的發(fā)生情況。統(tǒng)計方法為:外植體不定芽分化率(簡稱“分化率”)=再生不定芽葉塊數(shù)/接種葉塊數(shù)×100%；外植體平均出芽數(shù)=再生不定芽總數(shù)/再生不定芽的葉塊數(shù)；愈傷組織誘導(dǎo)率（愈傷誘導(dǎo)率）=愈傷塊數(shù)/接種葉塊數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜葉片不定芽誘導(dǎo)最佳激素組合的摸索

預(yù)培養(yǎng)10 d甜瓜葉外植體（不帶葉柄）在不同濃度6-BA與IAA配比的MS培養(yǎng)基上大部分均能誘導(dǎo)出愈傷組織或不定芽叢（表2）。外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上接種后不斷擴(kuò)大，8 d左右，在外植體切口處長出細(xì)小、嫩綠的愈傷組織，17 d左右，在愈傷組織處長出芽叢。

表2 6-BA與IAA對甜瓜葉片外植體發(fā)生不定芽和愈傷組織的影響（單位：%）

由圖1可以看出，在6-BA 0.2 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L分別與IAA 0、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/L配比時，隨著IAA濃度的增加，不定芽發(fā)生頻率都呈現(xiàn)出不斷下降的趨勢；其中6-BA 1.0 mg/L與IAA 0 mg/L配比時不定芽發(fā)生頻率最高，達(dá)到50%，平均每個外植體上可誘導(dǎo)出1.6個健壯小芽，顯著高于其他組合。

在不同濃度組合的6-BA與IAA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，葉片分化率和平均出芽數(shù)差異很大。在MS+6-BA 1.0 mg/L(含瓊脂0.8%、蔗糖3%)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上不僅分化率較高，而且玻璃化程度低，再生芽生長健壯，再生芽數(shù)多（圖2）。隨著IAA濃度的增加，外植體的分化率下降，且玻璃化現(xiàn)象也有加重的趨勢。這是因為濃度過高的IAA含量促進(jìn)了愈傷組織的形成，從而影響了不定芽的分化。6-BA對甜瓜的不定芽分化起著關(guān)鍵性作用，濃度過低產(chǎn)生芽叢較少，甚至沒有芽叢產(chǎn)生，但是濃度過高，就會引起玻璃化苗的產(chǎn)生，芽叢減少（圖3）。有研究表明，子葉塊再生存在明顯的極性，多在近軸端產(chǎn)生芽叢。葉片的再生，極性不像子葉塊那樣明顯，所劃傷口處能夠較均勻產(chǎn)生芽叢。

2.2 不同外植體不定芽的誘導(dǎo)比較

在葉片外植體（不帶葉柄）最佳激素濃度條件下，帶葉柄的葉片切塊不定芽誘導(dǎo)率較高，誘導(dǎo)率達(dá)65%，平均出芽數(shù)2.77個（表3），最早一批不定芽主要以直接出芽方式發(fā)生，沒有明顯的愈傷化過程。繼續(xù)培養(yǎng)后，從外植體切口和與培養(yǎng)基貼近的一面長出愈傷組織，但愈傷組織多呈疏松霜花狀，白色或淡綠色，少數(shù)疏松愈傷組織中長出綠色小瘤狀物，小瘤狀物以后可分化出不定芽（圖4）。而葉片一般8 d左右，在近軸端長出鮮綠的愈傷組織。17 d左右在外植體愈傷組織處開始長芽叢。

表3 不同外植體不定芽的誘導(dǎo)比較

2.3 不同光照條件對不定芽誘導(dǎo)的影響

光照對帶葉柄外植體的分化率、平均出芽數(shù)和出現(xiàn)不定芽所用時間有很大影響。直接轉(zhuǎn)入正常光周期(光/暗培養(yǎng)時間為16 h/8 h)下培養(yǎng)的外植體，其不定芽的分化率最高為65%(再生培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L)，而且出現(xiàn)不定芽所用時間較短，外植體在接種后3～4 d就有所反應(yīng)。暗培養(yǎng)，不定芽的再生率明顯下降。這可能由于黑暗條件下，外植體內(nèi)積累的生長素多，促進(jìn)了愈傷組織的形成和生長。而激素平衡的改變和愈傷組織對養(yǎng)分的競爭不利于不定芽的分化，結(jié)果導(dǎo)致暗培養(yǎng)條件下外植體上的不定芽數(shù)明顯少于正常光周期下培養(yǎng)的外植體上的不定芽數(shù)。而且暗培養(yǎng)后，外植體上的不定芽數(shù)明顯少于正常光周期下培養(yǎng)的外植體上的不定芽數(shù)，葉片有不同程度的發(fā)黃，生長不健壯，所以出現(xiàn)不定芽所用的時間較長。因此，直接轉(zhuǎn)入正常光周期下培養(yǎng)，對甜瓜離體外植體再生不定芽較為適宜。

3 討論

3.1 植物激素的濃度

表4 不同光照條件對不定芽誘導(dǎo)的影響

植物的組織培養(yǎng)中確立最佳誘導(dǎo)條件是十分必要的，尤其是植物激素的濃度。本研究發(fā)現(xiàn)芝麻酥甜瓜品種的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L，不需要IAA，這與陶興林等[12]的試驗結(jié)果基本相符。他們的研究也表明，在甜瓜不定芽誘導(dǎo)中，生長素是非必要的。這可能是由于甜瓜本身的內(nèi)源生長素的含量比較高，如果再人為添加就會引起愈傷組織的發(fā)生，不利于不定芽的誘導(dǎo)。

細(xì)胞分裂素與生長素的比例是組織培養(yǎng)中激素使用的關(guān)鍵，應(yīng)該根據(jù)培養(yǎng)的目的進(jìn)行調(diào)節(jié)。原則上是生長素濃度明顯高于細(xì)胞分裂素，則促進(jìn)細(xì)胞脫分化，誘導(dǎo)愈傷組織，反之則促進(jìn)細(xì)胞分化，但是我們在試驗中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素與生長素的種類對不同植物的敏感性差異很大，因此激素種類的選擇應(yīng)以植物種類不同而異。還發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)不定芽的增殖生長中，為了使不定芽的分化保持較高的頻率，加入較高濃度范圍的6-BA對芽的分化有促進(jìn)作用，但若6-BA濃度太高則明顯抑制芽的分化，且再生芽多畸形玻璃化加重，難以發(fā)育成正常植株。此外，當(dāng)6-BA濃度較高時，由于其后效應(yīng)，常會抑制根的誘導(dǎo)，因此芽增殖后期逐漸降低細(xì)胞分裂素濃度對根的誘導(dǎo)是有利的。但降低幅度也不能太大，否則會抑制芽叢的生長，并且外植體有黃化現(xiàn)象。我們還發(fā)現(xiàn)同一處理中，在有的外植體表面上，僅僅維持在原來的狀態(tài)，對誘導(dǎo)幾乎沒有反應(yīng)；有的外植體已經(jīng)形成很密的不定芽叢；而有的外植體只出現(xiàn)疏松愈傷組織，呈霜狀或顆粒狀，顏色為白色或褐色；有的外植體則同時誘導(dǎo)出愈傷組織和不定芽。這說明外植體對不定芽誘導(dǎo)有很大的影響，分析認(rèn)為，同一處理中外植體表現(xiàn)的差異主要是由于不同外植體的自身狀況導(dǎo)致的，包括外植體中的內(nèi)源激素水平、營養(yǎng)水平等的差異而造成，所以在試驗中，為了保持試驗的準(zhǔn)確性應(yīng)該對外植體進(jìn)行必要的選擇，盡量保持一致。

在試驗中，葉柄處誘導(dǎo)率較高，可能是由于葉外植體吸收培養(yǎng)基中的生長素和細(xì)胞分裂素主要是通過葉脈中的維管束進(jìn)行的，而葉柄有較大維管束，有利于激素向葉片的運(yùn)輸，從而導(dǎo)致葉片激素濃度過高，利于愈傷組織的形成，而不利于形成不定芽，但是葉柄與培養(yǎng)基接觸，培養(yǎng)基中的激素濃度有利于葉柄不定芽的形成。暗處理對許多植物的再生有促進(jìn)作用，暗處理可減少外植體酚類物質(zhì)的溢出，利于不定芽的分化。但是，同時黑暗條件下，有些植物外植體內(nèi)積累的生長素多，促進(jìn)了愈傷組織的形成和生長。而激素水平的改變和愈傷組織對養(yǎng)分的競爭不利于不定芽的分化。本試驗結(jié)果表明，直接轉(zhuǎn)入正常光周期下培養(yǎng)有利于外植體的再生。由于暗培養(yǎng)的作用比較復(fù)雜，暗處理對外植體再生芽誘導(dǎo)的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

3.2 甜瓜不定芽誘導(dǎo)過程中的玻璃化與褐化

在組培過程中經(jīng)常出現(xiàn)的兩個問題，一個是玻璃化，一個是褐化。玻璃化是組培中常見的現(xiàn)象，現(xiàn)在大多數(shù)學(xué)者的試驗結(jié)果表明，玻璃化的形成與培養(yǎng)器皿內(nèi)的水分、營養(yǎng)、激素有關(guān)。我們的試驗中，上述所提到的玻璃化成因中只有激素水平的差異，所以出現(xiàn)的玻璃化現(xiàn)象可能是由于激素原因造成，試驗得出的結(jié)果與上述一致。激素配比不同，細(xì)胞分裂素水平高的組合出現(xiàn)了不同程度的玻璃化。這也就再一次證明了激素是造成玻璃化的主要原因之一。

褐化的原因主要是植物組織經(jīng)創(chuàng)傷后產(chǎn)生大量的酚類化合物，氧化后褐化造成。試驗結(jié)果表明，低濃度的6-BA不但利于不定芽的誘導(dǎo)，而且畸形芽少，還可以減緩褐化程度；隨著6-BA濃度的升高，褐化組織數(shù)目增加，褐化程度越重?？赡苁羌?xì)胞分裂素刺激了多酚氧化酶的活性所致。所以，在甜瓜的組織培養(yǎng)過程中，在篩選了高效誘導(dǎo)再生的激素后，發(fā)現(xiàn)玻璃化、褐化現(xiàn)象時，應(yīng)及時降低激素濃度、換用較弱的激素，既可減少褐化程度又可以減少玻璃化程度。

4 結(jié)論

在設(shè)定的20個激素組合誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，以預(yù)培養(yǎng)10 d的甜瓜品種“芝麻酥”幼葉（不帶葉柄）為外植體，培養(yǎng)在MS+6-BA 1.0 mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為溫度25℃，光照16 h/8 h光/暗周期，能夠獲得最佳不定芽誘導(dǎo)率，為50%。

在相同的激素組合、培養(yǎng)條件下，外植體取材方式對不定芽誘導(dǎo)率有一定影響，帶0.5 mm葉柄的葉外植體不定芽誘導(dǎo)頻率要高于不帶葉柄的葉外植體（65%vs 50%）。

光照有利于甜瓜不定芽的誘導(dǎo)，前期黑暗培養(yǎng)則抑制不定芽的發(fā)生。

6-BA與IAA配合使用有利于甜瓜葉片愈傷組織的誘導(dǎo)，本研究中在MS+6-BA1.0 mg/L+IAA0.1 mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，可達(dá)95%。