陳清嬋，簡清梅，孫愛紅

(荊楚理工學院生物工程學院，湖北 荊門 448000)

柑橘是蕓香科中柑橘屬植物的水果，目前我國無論是柑橘種植面積還是柑橘的產(chǎn)量，都是世界上最大的國家。在我國柑橘產(chǎn)業(yè)中，柑橘汁占79 %，柑橘罐頭占20 %。而且隨著我國柑橘種植面積的不斷擴大和柑橘果實加工迅速發(fā)展，導致產(chǎn)生了大量的柑橘皮及柑橘渣。目前，僅有少量柑橘皮作為藥材利用，絕大多數(shù)柑橘皮作為廢物丟棄或加工成動物飼料。直接丟棄或填埋處理會對環(huán)境造成嚴重污染，但加工飼料通常采用粉碎和干燥等處理，能耗大。柑橘皮果渣中有多種活性成分，主要包括多糖基成分（果膠、纖維素、半纖維素）、精油、黃酮、色素等，其含量甚至高于柑橘加工制成品，其中多糖含量較為可觀。大量國內(nèi)外研究資料表明，植物多糖具有增強機體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗炎、抗病毒、降低血糖等多種生物活性。目前植物多糖的提取方法被普遍應(yīng)用的是水提醇沉法。此外復合酶浸提法、超聲波提取法、微波提取等不同提取方法與傳統(tǒng)工藝相比更加高效、節(jié)能。這些提取方法能夠在提高多糖產(chǎn)率及純度的同時降低能耗。

本試驗在利用柑橘皮果渣發(fā)酵獲得橘子酒后，以發(fā)酵橘皮果渣為原料，利用微波輔助提取技術(shù)對其多糖進行提取，用響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝，旨在尋找一種途徑來對柑橘皮果渣綜合利用進行新嘗試，為柑橘皮果渣再利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：新鮮柑橘，湖北荊門漳河自產(chǎn)柑橘。

菌種：安琪釀酒酵母，湖北安琪酵母股份有限公司。

試劑及耗材：NaHSO、葡萄糖、苯酚，天津市福晨化學試劑廠，均為分析純；濃硫酸、95%乙醇，武漢市洪山中南化工試劑有限公司，均為分析純。

儀器設(shè)備：101-1 型鼓風干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司；WY200B 恒溫搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；722N 可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；FA24C電子分析天平，上海衡際科學儀器有限公司；NH4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；JG手提式多功能粉碎機，上海廣沙工貿(mào)有限公司；G70D20CSP-D2(SO) 微波爐，佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

酒精發(fā)酵橘皮果渣樣品→加水浸泡→微波提取→離心→上清液加熱濃縮→加入95%乙醇→4 ℃沉化12 h→離心→鼓風干燥→發(fā)酵橘皮果渣粗多糖

1.2.2 操作要點

（1）原料預處理。橘皮果渣經(jīng)酒精發(fā)酵后得到橘子酒，離心取橘皮果渣，再干燥處理。得到顆粒狀的發(fā)酵橘皮果渣，將其放入手提式多功能粉碎機內(nèi)研磨，得到細粉狀的發(fā)酵橘皮果渣。

（2）浸泡。用電子天平稱取5.0 g 預處理的發(fā)酵橘皮果渣樣品加入選定水料比的蒸餾水中浸泡12 h。

（3）微波提取。在微波爐中按照選定的微波功率、提取時間和水料比進行微波輔助提取多糖。

（4）離心和沉化。將提取液離心完后收集上清液。將上清夜減壓濃縮，使體積濃縮至原來的1/3，然后加入濃縮液4 倍體積的95 %乙醇，放入冰箱內(nèi)，使其在4 ℃溫度下沉化24 h。

（5）離心和干燥。離心收集沉淀，干燥后得到發(fā)酵橘皮果渣粗多糖。

1.2.3 單因素試驗

單因素試驗取值見表1，單因素試驗時選定的微波功率為420 W，提取時間為5 min，水料比20∶1。

表1 單因素試驗設(shè)計

1.2.4 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken 中心組合試驗設(shè)計來優(yōu)化微波輔助提取發(fā)酵橘皮果渣多糖的工藝，選擇微波功率（X）、提取時間（X）和水料比（X）3 個因素為影響因子，多糖提取率為響應(yīng)值，響應(yīng)面法分析試驗因素及設(shè)計水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平表

1.2.5 測定方法

1.2.5.1 葡萄糖標準曲線的繪制

準確稱取200 μg 干燥恒重的葡萄糖，配制成濃度為20 μg/L 的葡萄糖標準溶液，分別準確吸取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL 的葡萄糖標準溶液置于10 mL 試管中，而后分別用純水滴加至2 mL，再加入1 mL質(zhì)量分數(shù)為5%苯酚溶液和濃硫酸溶液5 mL，振蕩混勻，將試管置于37 ℃水浴中靜置30 min，而后立即冷卻至室溫，在波長490 nm 處測定其吸光度值。繪制標準曲線(縱坐標為490 nm處吸光度值，橫坐標為葡萄糖濃度μg/L)，擬回歸方程。得到回歸方程：

式中：y——490 nm處吸光度值；

x——葡萄糖濃度，μg/L；

R——決定系數(shù)。

1.2.5.2 總糖含量測定

本實驗采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標準品，測定發(fā)酵橘皮果渣多糖的含量。精密稱取粗多糖樣品20 μg 溶解于1 L 容量瓶中，配制成濃度為20 μg/L 的樣品溶液。準確吸取樣品液1 mL，按1.2.5.1 步驟測定吸光度值，從葡萄糖標準曲線中求出樣品中多糖的含量。計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 微波功率對多糖提取率的影響

由圖1 可知，隨著微波功率的增加，發(fā)酵橘皮果渣多糖提取率呈先上升后下降的趨勢。當功率在280～350 W 之間，多糖得率呈現(xiàn)較快的增長趨勢,但隨著功率進一步上升，多糖得率增幅減小，在微波功率490 W 左右達到最大，此時多糖提取率為3.96 %，之后增加微波功率，多糖得率反而有所降低。這可能是微波功率達到一定強度后促使了發(fā)酵橘皮果渣多糖的降解。

圖1 微波功率對多糖提取率的影響

2.1.2 提取時間對多糖提取率的影響

由圖2 可知，隨著微波提取時間的延長，發(fā)酵橘皮果渣多糖提取率逐漸上升，可以適當延長提取時間，有利于細胞內(nèi)有效成分的釋放。當提取時間在7 min 時，多糖提取率達到最大，此時多糖提取率為3.88%。繼續(xù)延長時間，發(fā)酵橘皮果渣多糖提取率開始下降。這可能也是因為微波處理時間過長促使了發(fā)酵橘皮果渣多糖的降解。

圖2 提取時間對多糖提取率的影響

2.1.3 水料比對多糖提取率的影響

從圖3 可知，在微波輔助提取過程中，隨著水料比的增大,發(fā)酵橘皮果渣多糖的提取率呈逐漸上升趨勢。當水料比超過40∶1 時，發(fā)酵橘皮果渣多糖提取率增幅不明顯?？梢娎^續(xù)增加水料比值對進一步提高發(fā)酵橘皮果渣多糖提取率的意義不大，基于節(jié)約資源的出發(fā)點，最佳提取液料比選擇40∶1，此時發(fā)酵橘皮果渣多糖提取率為5.07%。

圖3 水料比對多糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立

以微波功率X、提取時間X、水料比X為自變量，多糖提取率為響應(yīng)值y，進行響應(yīng)面分析，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)單因素實驗確定的各項實驗條件范圍，選擇微波功率（420～560 W），提取時間(5～7 min)和水料比（30∶1～50∶1）。對表3 中的數(shù)據(jù)利用Design-Expert軟件進行分析得到響應(yīng)面回歸方程：

2.2.2 回歸模擬分析

方差分析結(jié)果如表4 所示。F 值為14.98，P 值小于0.01，證明試驗具有顯著代表性。決定系數(shù)(R=0.9506)和調(diào)整后的決定系數(shù)(Adj R=0.8872)證實該模型是高度顯著的。各影響因素與響應(yīng)值之間并不存在簡單的線性關(guān)系。其中提取時間的F 值為56.94，微波功率的F 值為6.26，水料比的F 值為4.00，所以影響因素大小順序為：提取時間＞微波功率＞水料比。線性相關(guān)系數(shù)微波功率（X），提取時間(X)和二次項系數(shù)(X和X)均顯著(P＜0.05)。水料比（X）和二次項系數(shù)（X）均不顯著，同時交互項系數(shù)(XX，XX和XX)也不顯著。失擬項(P；F)均不顯著，說明實驗值與模型之間關(guān)聯(lián)性良好。綜上，可以用此模型對發(fā)酵橘皮果渣多糖提取工藝進行分析預測。

表4 回歸模擬方差分析表

2.2.3 微波功率與提取時間對多糖提取率的交互影響

由圖4 可看出，微波功率與提取時間的改變均對多糖提取率有影響，但兩者交互作用不顯著，隨著各因素取值由小變大，提取率相應(yīng)均呈拋物線形，且在近中心條件處出現(xiàn)最大值。但提取時間較微波功率坡度更為陡峭，說明提取時間的變化對多糖提取率的影響高于微波功率。

圖4 微波功率與提取時間對多糖提取率的交互影響

2.2.4 微波功率與水料比對多糖提取率的交互影響

由圖5 可知，微波功率與水料比的相互作用對多糖提取率的影響非常有限，兩因素的坡度都較平緩不陡峭，說明二者有交互作用但不顯著，微波功率的影響大于水料比的影響。

圖5 微波功率與水料比對多糖提取率的交互影響

2.2.5 提取時間與水料比對多糖提取率的交互影響

由圖6 可知，提取時間與水料比的交互作用對多糖提取率的影響不顯著。水料比坡度平緩，而提取時間坡度陡峭，說明提取時間對多糖提取率的影響要遠大于水料比對提取率的影響。

圖6 提取時間與水料比對多糖提取率的交互影響

2.2.6 響應(yīng)面驗證實驗

通過軟件分析得到最優(yōu)提取工藝為:微波功率為498.33 W，提取時間為7.83 min，水料比為36.31∶1，多糖提取率最優(yōu)預測值為5.75%。考慮實際情況，最后確定微波輔助提取最優(yōu)工藝為：微波功率為500 W，提取時間為8 min，水料比為36∶1，在此條件下發(fā)酵橘皮果渣提取率為5.67 %。實際結(jié)果與理論值偏差較小，說明該模型能夠較好地預測發(fā)酵橘皮果渣多糖提取工藝條件，具有良好的實際運用價值。本實驗所得發(fā)酵橘皮果渣多糖提取率與其他報道過的橘皮多糖提取率比較，明顯偏少，這可能是由于發(fā)酵過程中橘皮一部分多糖成分降解為含醇溶性物質(zhì)或小分子糖，提取過程中經(jīng)醇沉、離心等步驟后除去單糖或醇溶性物質(zhì)，導致多糖含量偏低。

3 結(jié)論

本試驗以果酒發(fā)酵橘皮果渣為原料，利用微波輔助提取多糖技術(shù)，對其進行提取工藝優(yōu)化研究，在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法進一步優(yōu)化，得出發(fā)酵橘皮果渣多糖提取最適工藝條件為：微波功率為500 W，提取時間為8 min，水料比為36∶1，在此條件下多糖提取率為5.67%。